生物化学DNA的生物合成.ppt

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1、第三篇 遗传信息的传递,前 言,1958年Francis Crick 提出遗传信息传递的中心法则1970年D Baltimore对遗传信息传递的中心法则作出补充,第十一章 DNA的生物合成,1953年James Watson和Francis Crick 提出DNA双螺旋结构模型，并推测DNA的半保留复制1958年，Meselson和Stahl利用15N标记大肠杆菌DNA，证明了DNA半保留复制1963年，Cairna利用放射性自显影的方法，首次观察到大肠杆菌染色体DNA的复制。,第一节 DNA复制的一般规律,一、DNA半保留复制（一）概念,（二）DNA半保留复制的实验证明,同位素标记技术15N

2、H4Cl细菌培养技术DNA提取技术密度梯度离心技术-15NH4Cl 14NH4Cl,（三）DNA半保留复制的意义,1.遗传的保守性是相对的2.遗传的变异性是绝对的,DNA复制的一般特点亲代DNA的两条链均作为模板DNA的局部需解旋，尚需拓扑异构酶松弛超螺旋DNA聚合酶以5到3的方向合成新链DNA聚合酶需RNA引物DNA的合成是半不连续的DNA复制高度精确（DNA聚合酶的较读功能）DNA的合成非常迅速线性DNA末端（端粒）的复制需端粒酶参与,二、DNA的双向复制,复制起点(origin)：是含有100200个碱基对的一段DNA复制叉（replication fork）:复制子（replicon）

3、:人的基因组可能有104105个复制子新链增长的方向:53,三、DNA的半不连续复制,领头链（leading chain）:后随链（lagging chain）:冈崎片段：后随链合成的小片段DNA,四、DNA复制需要RNA引物,RNA引物约10个核苷酸,五、DNA具有高度保真性,严格遵守碱基配对原则DNA聚合酶对碱基的选择功能DNA聚合酶的校读功能细胞修复系统（碱基错配的发生率为10-110-2，DNA-pol较读功能使之降为 10-510-6，复制后的校正修复系统使之降为10-1010-8）,第二节 参与真核生物DNA复制的有关酶及蛋白因子,一、DNA聚合酶,35的聚合功能，即以DNA为模板

4、，催化新链3，5-磷酸二酯键的生成。DNA聚合酶不能将两个核苷酸聚合，故需一段RNA因物35外切核酸酶活性（较读功能）,二、引发酶（引物酶）引发酶与DNA聚合酶形成复合体。引发酶负责合成约10个核苷酸的RNA引物。它的底物为核苷三磷酸。在引物产生基础上后，DNA聚合酶负责聚合1530个核苷酸，它的底物为脱氧核苷三磷酸。,三、拓扑异构酶（topoisomerase）,拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的性质。,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。,拓扑异构酶具有内切核酸酶及DNA连接酶的性质 类型：型拓扑异构酶：切割DNA双链中的一股，并适时连接，不需ATP参与复制和

5、转录型拓扑异构酶：切割DNA双链，并适时连接，需ATP，参与复制作用：松弛超螺旋,拓扑异构酶的作用,拓扑异构酶的作用,四、解螺旋酶（helicase）作用是解开局部一小段双链DNA形成单链，利于DNA合成,五、单链DNA结合蛋白（single-strand DNA binding protein,SSB）作用：SSB与单链DNA结合，阻止已解链的DNA重新形成双链，利于DNA合成,六、增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（PCNA）是DNA聚合酶的辅助蛋白质。PCNA的三个亚基绕着DNA形成一个滑动夹子,DNA聚合酶附着于滑动夹子上沿DNA向前移动，进行复制。七、复制因子C（RFC）是一种装载因子，它

6、帮助PCNA环状滑动夹子的装配。此因子作为DNA聚合酶和之间的连系物或纽带，有助于前导链和后随链的同时合成。,八、核酸酶H（RNaseH）和盖内切核酸酶（FEN1）它们参与去除RNA引物的作用。RNaseH降解RNA引物，留下一个核苷酸连在冈崎片段的末端，由FEN1完成去除最后一个核苷酸。,九、DNA连接酶（ligase）作用：催化两个DNA片段间形成3，5-磷酸二酯键而将它们连接在一起。,第二节真核生物DNA的复制过程,一、DNA复制的起始,起点辨认复合物（ORC）辨认复制的起始点序列（此序列含有由11个核苷酸组成的保守序列：A（T）TTTATA（G）TTTA（T），ORC具有弱解旋酶活性的

7、小染色体维系蛋白(MCM)再与之结合，产生复制叉，形成复制泡，单链DNA结合蛋白（复制蛋白A）与单链DNA结合，解旋酶再结合到复制泡上。与DNA-pol结合的引发酶在起始位点合成约10个核苷酸 的RNA引物，然后由DNA-pol再形成1530个核苷酸的DNA片段。,二、DNA链的延伸,DNA聚合酶/引发酶产生RNA-DNA后（大约40个核苷酸），RFC紧密结合到引物-模板接合处，DNA聚合酶与模板DNA脱离。RFC负责组装PCNA滑动夹子，然后DNA聚合酶结合到PCNA组成的滑动夹子上，完成冈崎片段的延伸，最终长度达130-200个核苷酸。前导链引物合成后由DNA聚合酶连续延伸DNA 链，长度

8、可达5-10kb。,三、DNA复制的终止,RNA引物的水解：首先由RNase H降解RNA引物，留下单个核糖核苷酸连接到冈崎片段上。然后，由盖内切核酸酶除去最后一个核苷酸。DNA大分子的形成：DNA连接酶将相邻的两个DNA片段连接起来，形成大分子DNA链。,pol,前导链,5,冈崎片段（130-200nt）,pol,后随链,四、端粒DNA的复制,（一）端粒什麽是端粒？端粒是指真核染色体两末端的一种特殊的膨大结构。端粒的构成：端粒由染色体末端DNA和DNA结合蛋白组成的复合物。端粒的作用是（1）保护染色体末端DNA不被核酸酶降解。（2）避免染色体间的融合。,6.端粒DNA的结构端粒DNA有三个结

9、构功能区：端粒相关序列、端粒重复序列和3单链悬突（两个重复序列的长度）。不同物种的端粒DNA长度差别很大。重复序列长度也不一样。3单链悬突可能是端粒的一个普遍特征。真核生物的端粒DNA序列相当保守，一般有58bp 串联重复组成，特征是富含G/C，在3端超出互补链1216个核苷酸。,端粒相关序列,端粒重复序列,3端悬突,7.端粒DNA结合蛋白包括与3单链悬突特异结合的蛋白质和与端粒双链DNA结合的蛋白质。端粒蛋白与端粒DNA结合，保护大约100bp的双链和末端单链DNA。,（二）端粒酶什麽是端粒酶？端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种很特殊的核蛋白复合物。端粒酶的作用：端粒酶RNA含有与端粒DNA

10、互补的序列，并具有逆转录酶的性质。端粒酶负责端粒DNA合成。,U,（三）端粒DNA复制-爬行模型,（四）端粒、端粒酶与衰老通过对体内外细胞端粒平均长度研究，发现同一种细胞不同生长时期端粒长度不同，且端粒DNA序列重复程度与细胞的寿命呈正相关。人类细胞体外分裂时，通常细胞每分裂一次，端粒DNA序列丢失约50bp200bp，细胞停止分裂，处于静止状态。说明端粒DNA序列的缩短与细胞增殖受限有关。随着年龄的增加，细胞的连续分裂，端粒DNA逐渐缩短，甚至丢失，细胞老化并丧失增殖能力而死亡。老年人的端粒DNA长度明显短于年轻人。因此，端粒DNA缩短是细胞衰老的普遍现象。原因可能是人体端粒酶的活性低。研究

11、发现，精子细胞和肿瘤细胞中的端粒酶活性极高。,二、线粒体DNA复制-D环复制,线粒体DNA有两个复制起点。第二个复制起点开始复制时，第一个复制起点已复制达全环的2/3，并将外环取代出来。电镜下观察此结构似D形，故称D环复制。D环复制时两条新链的起始时间不同，因此复制是不对称的。,第四节 原核生物DNA的复制,.,DNA聚合酶I的结构,DNA聚合酶的结构,二、原核生物（E.coli）DNA的复制过程,（一）复制的起始有一个复制的起点和一个复制的终点。采取双向复制。复制起点有特殊的序列,（一）复制的起始-引发体的生成（二）DNA片段的延长（三）复制的终止,拓扑异构酶,DnaA,SSB,pol,SS

12、B,DnaG,pol,前导链,5,冈崎片段（1000-2000nt）,后随链,第五节 反转录过程,一、逆转录的概念：是指以RNA为模板，在逆转录酶的催化下合成DNA的过程。二、逆转录酶具有的酶活性：RNA依赖性DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成DNA单链核糖核酸酶H（RNaseH）活性：水解模板RNADNA依赖性DNA聚合酶活性：以合成的DNA单链为模板合成另一条DNA链三、逆转录酶需要引物：细胞内合成需宿主细胞tRNA作为引物体外合成可人工合成引物,四、逆转录过程,cDNA（互补DNA）:指以RNA为模板生成的双链DNA。逆转录的意义：可能与细胞分化与胚胎发生有关逆转录的应用：基因工程中获

13、得cDNA,五、致癌RNA病毒的致癌机理前病毒学说.,第六节 DNA的损伤与修复,一、DNA损伤（一）何谓DNA损伤？在某些理化因素的作用下，DNA结构发生的任何改变都称为DNA损伤。（二）DNA损伤的形式碱基的更替、缺失、插入、链的断裂、链内或链间的交联、DNA重排等。（三）损伤因素紫外线、电离辐射、烷化剂、碱基类似物、修饰剂化学诱变剂等,二、基因突变（一）基因突变：基因突变是指DNA分子中碱基组成发生改变。（二）突变类型点突变（碱基错配）：是指DNA分子中一个碱基的改变。包括转换和颠换2.插入突变：是指DNA分子中插入多余的碱基。3.缺失突变：是指DNA分子中碱基的丢失。4.三联体扩增：,

14、（三）突变可自发发生和诱发发生.自发突变DNA复制过程中的碱基错配（碱基错配的发生率为10-110-2，DNA-pol较读功能使之降为 10-510-6，复制后的校正修复系统使之降为10-10）,碱基的氨基-亚氨基异构体互变,2.诱发突变：指各种引起DNA损伤的因素所造成的突变。当DNA暴露与260nm 的紫外线时，DNA链相邻的嘧啶碱基可形成5，6双键，产生嘧啶二聚体TT、TC或CC，最常见为TT二聚体。人皮肤细胞受紫外线照射形成二聚体的可达5104/细胞/小时。此外，紫外线还可引起DNA链间交联、DNA与蛋白质交联、甚至断链。,（四）基因突变后果1.突变是生物进化和分化的分子基础。突变（特

15、别是点突变），不一定就是有害突变,2.突变是某些疾病的分子基础,三、DNA损伤的修复,（一）DNA损伤的修复的定义在一定条件下，损伤的DNA分子恢复正常的过程。（二）修复方式：光修复、切除修复、重组修复、旁路修复和SOS修复,1.光复活酶直接修复嘧啶二聚体,UV照射,2.切除修复最普遍的修复方式切除修复需要DNA特异内切酶、核酸外切酶、糖苷酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与。包括单个核苷酸切除和核苷酸片段切除修复。,人类着色性干皮病（xeroderma pigmentosis,XP）常染色体隐性遗传。皮肤对日光，尤其是对紫外线敏感。主要临床表现是皮肤雀斑样色素沉着，毛细血管扩张，局限性萎缩，

16、疣状增生，浅表溃疡，最后可癌变。这种病人的XP类基因（XPA、XPB、XPC、XPF、XPG）有缺陷，导致DNA损伤后的修复障碍。,3.重组修复,4.旁路合成修复,5.SOS修复诱导修复SOS修复是细胞DNA受到广泛损伤而难以复制的紧急情况下，细胞为求生存而出现的一种应急反应。此时，细胞需调动其所有的修复系统进行修复。20世纪50年代，Weigle首次在E.coli中发现SOS修复系统。1973年，Raelman首次称为SOS修复。SOS反应诱导的修复系统包括避免差错修复（光修复、切除修复和重组修复）和倾向差错修复。诱导产生缺乏校正功能的DNA聚合酶，一方面进行修复，同时也容易造成碱基错配的机

17、会而产生新的损伤。但总的结果是细胞可以生存下去。SOS反应是由RecA 蛋白和LexA阻遏物蛋白相互作用引起的，LexA（22kD）阻遏物蛋白是许多基因的阻遏物。RecA 蛋白是SOS反应的最初发动因子。在ATP存在时，RecA被损伤的DNA激活而表现出蛋白水解没活力，水解LexA阻遏物蛋白，使与修复有关的基因开放，表达产物即可对损伤的DNA进行修复。,历史故事一1958年，提出DNA复制为半保留复制 美国科学家马修.梅塞尔(Matthew Meselson)于1930年出生在科罗拉多州的丹佛。他毕业于加州工学院物理化学专业。毕业后留校，1976年到哈佛大学工作。福兰克林.斯塔尔(Frankl

18、in Stahl)于1929年出生于马萨诸塞州的波士顿。曾求学于哈佛大学及罗切斯特大学。1955年至1958年在加州工学院工作，其后在密苏里大学工作一年。1970年受聘于俄罗冈大学任教授。,1957年，梅塞尔和斯塔尔在加州工学院工作期间，利用大肠杆菌研究遗传物质DNA。他们先将大肠杆菌放入含有N15的培养基中标培养，然后将这些大肠杆菌转移到N14的培养基中培养，最后把大肠杆菌经密度梯度离心。他们发现提取的DNA有三条带。它们分别为只含有N15的DNA，只含有N14的DNA，和既含有N15的DNA又含有N14的DNA。将含有N15的DNA又含有N14的DNA进行加热，DNA分为两半，一条是含有N

19、15的DNA的重链，另一条是含有N14的DNA的轻链。他们得出的结论是新合成的DNA两条链，一条由遗传来的重链，另一条来自新合成的轻链。1958年，他们证实细胞分裂时，DNA的复制是半保留的。既DNA两条链解开，每条单链均成为模板形成一条与之对应的新链，然后一同进入子细胞中。,二.DNA聚合酶的发现：20世纪50年代末到20世纪60年代初，科学家们对DNA 怎能执行它的遗传功能进行了大量的研究。1955年Kornberg 从E.Coli 中发现了DNA 聚合酶，为DNA的复制打下了基础。为此，Kornberg 1959年获得诺贝尔奖。亚瑟.科恩伯格（Arthur.Kornberg）1918年3

20、月出生在美国纽约。1941年23岁的他获得罗彻斯特大学医学博士学位，1960年和1962年获得法学和科学博士学位。1942年，在做了一年的实习医生后，科恩伯格的一篇关于“黄疸症”的论文引起了美国国家卫生研究院（NIH）院长戴尔的注意。他被调到NIH生理学部营养学分部工作。一年后，他放弃了临床医学志愿，开始更新的工作。1947年，他开始组建NIH酶学与新陈代谢分部并兼任主任。1953年，科恩伯格来到华盛顿大学医学院，担任微生物系主任。科恩伯格是生物化学特别是酶学的专家。,美国科学家,Kornberg 1955年从E.Coli 中发现了DNA 聚合酶，为DNA的复制打下了基础。为此，Kornber

21、g 1959年获得诺贝尔奖。,Arthur Kornberg,从1950年起，科恩伯格等人开始寻找合成DNA和RNA的酶类。他们首先研究了核酸的基本成分，以及细胞如何制造这些组件，接着又研究这些基本单元如何在酶的帮助下一步步的组装成DNA 和RNA。1955年，科恩伯格终于从大肠杆菌中分离出DNA聚合酶，它可以忠实的复制DNA。DNA聚合酶的发现，为理解遗传机制以及现代DNA重组技术的发展作出了重要的贡献。科恩伯格及其同事奥乔亚共享1959年诺贝尔奖生理学及医学奖。,三.逆转录酶的发现美国加州理工学院的教授戴维和美国癌症学会传染性肿瘤学和细胞生物学教授侯活于1970年在鸡肉瘤中发现了逆转录酶，

22、发展了中心法则。于1975年获得诺贝尔奖。,巴尔的摩(David Baltimore)1938年3月7日出生于美国纽约市。在中学时代就对生物学产生了浓厚的兴趣。曾有一年，他在实验室里度过整个夏天。1956年，他进入宾夕法尼亚州斯沃思莫尔大学学习。他不但在生物学方面取得优异的成绩，还获得了文学学士学位。并且在化学方面也有一些独到之处。大学毕业后他到麻省理工学院，在著名的分子生物学家Zingr的指导下从事研究工作。在导师的指导下，他废寝忘食地工作，同时攻读哲学博士学位。1964年，他转入阿尔伯特-爱因斯坦医学院从事研究，接着又学习动物病毒专业。后来，他到加利福尼亚的一个研究所任副研究员。同后来获得

23、诺贝尔奖的杜尔贝克博士一起工作，得到很大教益。1968年，他在麻省理工学院任付教授，并开始对肿瘤病毒进行研究。1971年，巴尔的摩连获三种奖项，分别为古斯塔夫斯特思病毒学奖，马萨诸塞总医院的沃伦奖，及埃里里利公司的微生物学及免疫学奖。1972年，他晋升为教授。1974年，他到麻省理工学院癌症研究中心工作。同年，他获得美国钢铁基金分子生物学奖和盖尔纳基金年度奖。巴尔的摩广泛的接触生物学及医学界的许多专家。他谦虚好学，博采众长，甚至为了学术问题勇于同权威人士争论。巴尔的摩最终因发现了逆转录酶并揭示了逆转录病毒的复制机理。于1975年，获得诺贝尔奖。,特明(Howard temin)于1934年12

24、月10日出生在美国宾夕法尼亚州的费城。1994年2月崒于费城。父亲是一位律师，他从小受家庭的熏陶，勤奋好学。中学时期就参加了科研活动。使他对生物学研究产生了特殊的兴趣。1951年，他考入斯沃思莫尔学院。他刻苦学习，成绩优秀。1955年毕业。一年后，他考取了加州理工学院的研究生。成为著名生物学家杜尔贝科的研究生，主要攻读动物病毒学。致力于RNA病毒的研究。他所撰写的论文：“劳氏肉瘤病毒“在当时的生物界产生很大影响。1959年，25岁的已经成为了学识不凡的博士。1960年，特明成为卡得尔癌症研究所的副教授。他研究了劳氏病毒在体外培养的增殖调控，提出DNA的原病毒学说。1971-1974年，特明先后获得了许多大奖，其中有美国化学会的酶化学奖和法国癌症研究发展协会的格里弗尔奖等等。在这期间他担任美国癌症学会传染性肿瘤学和细胞生物学教授。美国科学院院士。这为卓越的科学家在成绩面前永不停步。特明与巴尔的摩都发现了逆转录酶。证明了RNA病毒侵入宿主细胞后，先经逆转录酶的作用，将RNA逆转录成互补DNA，然后整合到宿主细胞染色体中，使细胞转化为癌细胞。1975年，特明同巴尔的摩一道获得了诺贝尔奖。,