上海交通大学环境微生物微生物的基因重组.ppt

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1、微生物的遗传和变异,第三节 基因重组,一、原核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组,基因的转移和重组,基因转移：外源性的遗传物质由供体菌转入某受体菌细胞的过程称为基因转移(gene transfer)。重组：转移的基因与受体菌DNA整合在一起称为重组(recombination)，使受体菌获得供体菌的某些性状。细菌的基因转移和重组可通过转化、接合、转导、溶原性转换和细胞融合等方式进行。,Genetic Recombination,一、原核微生物的基因重组,1.转化(Transformation)2.转导(Transduction)3.接合(Conjugation)4.原生质体融合(Cyto

2、plasmic fusion)5.溶源性转换(Lysogenic conversion),1.转化(Transformation),受体菌接受供体菌的DNA片段，经过交换将它组合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化。转化后的受体菌称转化子(Transformant)。,格里菲斯(F.Griffith)实验,无毒的型粗糙型（无荚膜）肺炎球菌,有毒力的型光滑型（有荚膜）肺炎球菌,1928年，英国医学微生物学家格里菲斯用肺炎球菌(pneunococcus bacteria)进行实验，发现微生物转化现象,野生型肺炎双球菌(Strep-tococcus pneumoniae)

3、菌落为光滑 型，一种突变型为粗糙型，两者根本差异在于荚膜形成；荚膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原性；不同抗原型是遗传的、稳定的，一般情况下不发生互变。,I,II,无,粗糙,无,粗糙型R,I,II,III,有,光滑,发达,光滑型S,类型,毒性,菌落,荚膜,基础知识,活的S细胞,注射入老鼠,老鼠死亡,1.,活的R细胞,注射入老鼠,老鼠存活,2.,3.,加热杀死的S细胞,注射入老鼠,老鼠存活,加热杀死的S细胞与活的R细胞混合,从死老鼠体內可以分离出活的S，而且活的S仍具有致病力,注射入老鼠,老鼠死亡,4.,格里菲斯实验,格里菲斯对其试验结论及发展,根据上述研究结果格里菲斯认为：(有毒)死细菌中的某种

4、物质转移到(无毒)活细菌中，并使之具有毒性，导致小家鼠死亡。他将这种细菌遗传类型的转变称为转化，并将引起转化的物质称为转化因子(tranforming principle)。但是当时的化学与生化分析技术还无法鉴定杀死细菌中的成分，因而不知转化因子为何物。以后一些研究者重复上述试验：将加热杀死的SIII细菌与 无毒RII细菌混合培养，然后注入小家鼠体内，同样导致 家鼠死亡。表明：细菌在培养条件下也能够实现遗传类型间的定向转化。,1.双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合，并发生酶促分解，形成平均分子量为45106Da的DNA片段。3.DNA双链中的一条单链逐步降解，另一条单链逐步进入

5、细胞4.转化DNA单链与受体菌染色体组上的同源区段配对，接着受体染色体组的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA所交换和取代，于是形成了杂种DNA区段。5.受体菌染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此染色体分离形成了一个转化子。,肺炎双球菌的转化过程,转化过程,TRANSFORMATIONdirect uptake of biologically active DNA fragments,细菌转化,以反向遗传学的角度来确定未知基因的功能。基因变异使基因功能的丧失，应用于重组DNA技术和细胞内同源重组。,反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经

6、典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。,反向遗传学,转化因子(transforming principle)在转化过程中，转化的DNA片段称为转化因子，分子量小于107，最多不超过1020个基因。感受态(competence)受体菌只有处于感受态时，才能摄取转化因子。细菌处于感受态

7、是因为其表面有一种吸附DNA的受体。,2.转导(Transduction),通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，使受体菌获得部分新遗传性状。普遍性转导(generalized transduction)局限性转导(restricted transduction),缺陷噬菌体(defective phage),一种噬菌体的头部有一定的大小，只能够容纳一定量的DNA，所以，转导噬菌体在带有寄主细胞的一部分DNA的同时，也必然失去了自己的部分DNA，从而丧失了原有的某些功能，成为缺陷噬菌体。具有噬菌体的正常形态，但不能引起寄主细胞裂解性感染的一类温和噬菌体的突变体。通常是由

8、于切离失去了某种或某些噬菌体复制所必需的遗传功能而引起的。如在转导过程中，噬菌体感染细菌后，其染色体变为环状，与细菌染色体联会、交换而整合到寄主染色体上。通过相反的过程，噬菌体也可以脱离寄主染色体，此时，不正常的切离即可导致转导噬菌体的形成。,转导的发现,1952年，莱德伯格(J.Lederberg)和他的学生津德(N.Zinder)在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中进行的重组实验：,1.菌株：,Strain LA-2：,phe+trp+met-his-,Strain LA-22：,phe-trp-met+his+,甲硫氨酸,组氨酸缺陷型,苯丙氨酸,色氨酸缺陷型

9、,2.杂交结果：,Strain LA-2：,Strain LA-22：,10-5原养型(Prototrophs),phe+trp+met+his+,3.利用DNA酶处理 结果LA不受DNA酶影响消除了转化作用的可能性。,4.Davis U-tube实验：将两个亲本分别放在U形管两臂中，结果同样能获得原养型重组菌！而且只在LA-22中！,(2)在培养过程中，少数LA-22菌自溶释放出游离的P22 噬菌体，通过U型管底的滤板(0.1m)，感染并裂解LA-2菌；,(3)宿主LA-2染色体DNA被裂解成小片段；,(4)某些LA-2的DNA片段在P22噬菌体组装时，偶尔装入头部，形成转导噬菌体(tran

10、sducing phage)；,(5)转导噬菌体再次进入LA-22菌，经重组后产生野生型菌株。,(1)LA-22菌株是携带P22噬菌体的溶源性细菌，LA-2菌株是对P22噬菌体敏感的非溶源性细菌；,普遍性转导Generalized Transduction,前噬菌体从溶原菌染色体上脱离，进行增殖，在裂解期的后期，噬菌体的DNA已大量复制，在噬菌体DNA装入外壳蛋白组成新的噬菌体时，在105107次装配中会发生一次装配错误，误将细菌的DNA片段装入噬菌体的头部，成为一个转导噬菌体。转导噬菌体能以正常方式感染另一宿主菌，并将其头部的染色体注入受体菌内。因被包装的DNA可以是供体菌染色体上的任何部分

11、，故称为普遍性转导。,大肠杆菌菌株之间的普遍性传导,普遍性转导,完全转导 外源性DNA片段与受体菌的染色体整合，并随染色体而传代，称完全转导 流产转导 外源性DNA片段游离在胞质中，既不能与受体菌染色体整合，也不能自身复制，称为流产转导,普遍性转导,普遍性转导,局限性转导Restricted transduction,局限性转导或特异性转导，所转导的只限于供体菌染色体上特定的基因。如噬菌体进入大肠埃希菌。,在噬菌体和细菌染色体的att位点上重组，前噬菌体整合到细菌染色体上。,由于前噬菌体切除错误，造成噬菌体局限性转导切除后，环状噬菌体DNA含有一段相邻的基因。,Specialized tran

12、sduction by bacteriophage,Faulty Excision,Specialized transduction by bacteriophage,The principles of performing a genetic cross with bacteriophages,需要注意的是噬菌体DNA的调整和重组在一个类似减数分裂交叉的过程；生产相互交换重组后代。这就要求，让不同表型的噬菌体基因突变的双重感染(plaque morphology in this case在这种情况下，斑块形态)。,局限性转导,菌A,菌B,局限性转导,普遍性转导与局限性转导,转导频率较普遍转导

13、增加1000倍(10-4),受体菌的10-7,转导频率,受体菌获得供体菌DNA特定部位的遗传特性,完全转导或流产转导,转导的后果,噬菌体DNA及供体菌DNA的特定部位,供体菌染色体DNA任何部位或质粒,转导的遗传物质,溶原期,裂解期,基因转导发生的时期,局限性转导,普遍性转导,区别要点,普遍性转导,局限性转导,3.接合(conjugation),接合是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。接合性质粒：能通过接合方式转移的质粒称为接合性质粒，F质粒、R质粒、Col质粒和毒力质粒。,接合实验,1946年，莱德伯格(J.Lederberg)和塔特姆(Tatu

14、m)细菌的多重营养缺陷型杂交实验,接合现象的发现和证实,莱德伯格(Lederberg)和塔特姆(Tatum)大肠杆菌杂交试验：材料：大肠杆菌(E coli)K12菌株的两个营养缺陷型品系 A甲硫氨酸缺陷型(met-)和生物素缺陷型(bio-)；B苏氨酸缺陷型(thr-)和亮氨酸缺陷型(leu-)。方法：将A、B混和，在基本培养基(固体)上涂布培养。结果：平板上长出原养型菌落(+)。,Met蛋氨酸,Thr苏氨酸,Leu亮氨酸,Bio生物素,莱德伯格和塔特姆接合试验,几种可能解释及其分析,对上述试验结果原养型菌落可能产生于：亲本细菌A或B发生了回复突变；两品系细胞通过培养基交换养料互养作用；两品系

15、间发生了转化作用；发生细胞融合，形成了异核体或杂合二倍体。为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行了以下推论 与研究：,回复突变可能的排除,莱德伯格和塔特姆利用的双营养缺陷型菌株进行试验，已基本排除A或B品系发生回复突变产生原养型细菌的可 能。单基因回复突变的频率约为10-6；双基因回复突变的频率则为10-12，频率很低。但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高，因此 基本可以排除回复突变的可能。,互养作用及其排除,试验材料：A品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)噬菌体敏感株 B品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)噬菌体耐性株 试验方法：将A、B

16、品系混合接种在基本培养基表面；短时间后喷T1杀死A品系，使其不能持续产生thr与leu 供B品系持续生长。结果与结论：仍然出现原养型菌落。从而表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发 生了遗传重组。,转化作用及其排除,莱德伯格和塔特姆曾把品系A的培养液经加热灭菌，加入到B品系的培养物中，未得到原养型菌落；表明原养型菌落可能不是由转化作用产生。戴维斯(Dawis,1950)的U型管试验(结果没有得到原养型细菌)；实验结论：细胞直接接触是原养型细菌产生的必要条件。,异核体和杂合二倍体的可能性,出现原养型菌落的另一种可能是细菌细胞发生融合，产生异核体或双杂合二倍体。这两种情况类似于二倍体生物的杂合

17、体将产生原养型菌落。异核体指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成不同的两个或多个细胞核。双杂合二倍体则是异核体进一步发生核融合，形成二倍体细胞核，核内含有两种遗传物质。但细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能暂时存在。培养繁殖过程中必将发生分离，产生各种缺陷型菌落。对试验中得到的原养型菌落后代研究表明：后代没有出现预期的性状分离现象。,接合现象的发现和证实,经过上述分析可以认为：在莱德伯格和塔特姆及其它类似试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，称之为接合。海斯(W.Hayes)(1952)研究表明：大肠杆菌两种不同菌株(品系)接合过程中遗传物质的转移是单向的；从而认为大肠杆菌存在两种类型

18、品系：雌性与雄性分别作为接合过程中遗传物质的供体与受体。接合(conjugation)：遗传物质从供体(donor)转移到受体(receptor)的重组过程。,Met：蛋氨酸、Bio：生物素缺陷型、Thr：苏氨酸、Leu：亮氨酸,莱德伯格和塔特姆接合试验,1m,Conjugation,莱德伯格,塔特姆,比德尔,F因子(Fertility factor),一种在染色体外的小型独立的环状DNA，一般呈超螺旋状，具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中去的能力，此外，其中还带有一些对其生命活动关系较小的基因。F因子的分子量为5107 Da约占大肠杆菌总DNA含量的2。,The F plasm

19、id and conjugation,F因子在细胞中的名称,F+(“雄性”)菌株：游离状态存在，可独立于染色体进行自主复制Hfr(高频重组,high frequency recombination)菌株：它与F-接合后的重组频率比F+与F-接合后的重组频率高出几百倍以上F-(“雌性”)菌株：在这种细胞中没有F因子，表面也不具性菌毛。它可通过与F+菌株或F菌株的接合而接受外来的F因子或F因子，从而使自己成为“雄性”的菌株F菌株：当Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离其染色体组时，可形成游离的但携带一小段(最多可携带三分之一段染色体组)染色体基因的F因子，特称F因子。,F-菌株F+菌株Hfr菌株

20、F菌株,雄性菌株,雌性菌株,F+F-接合,F+Conjugation,F质粒偶然整合到 E.coli 染色体上,高频重组细胞染色体有整合部分游离型质粒能够整合到寄主染色体。整合质粒借助于接合能引发DNA转移。,Conversion of F+to Hfr,F质粒整合到宿主染色体转移总是从被整合的F质粒的一端开始双链中的一条链被“剥离”，并通过菌毛转移第二链合成，发生结合重组,HfrF-接合,当Hfr菌株与F-接合时，Hfr菌株染色体在F因子处断裂。由于F因子位于染色体末端，因此要到整条染色体全部转移完，F因子才能进入F-细胞。转移约需2小时，F-很少能变成F+。,Hfr Conjugation

21、,HfrF-接合,HfrF-接合,用中断杂交技术作连锁图,20世纪50年代，沃尔曼(Wollman)和雅各布(Jacob)中断杂交试验，其目的是：Hfr细菌在交配中，什么时候把基因转移给F-细菌的。结果：接合时的遗传物质转移是直线进行的。,Jacob(1920-),Wollman(1917-2008),Wollman和Jacob实验,Hfr thr+leu+azjrtonrlac+gal+strs F-thr-leu-azjstonslac-gal-strr,Hfr细菌+F-细菌混合培养隔一段时间取样-搅拌-稀释（防止再度配对）-涂布在含有链霉素(str)，但不含苏氨酸(thr+)亮氨酸(le

22、u+)的培养基上。Hfr细菌是strs，不能生长。而F-细菌是thr-leu-也不能生长 只有Hfr细菌的thr+leu+和F-细菌的strr重组子才能生长。利用中断杂交技术可知道Hfr细菌是什么时候把thr+leu+转 移给F-细菌的。这种根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图 技术，称为中断杂交技术。,Interrupting Bacterial Mating,spread on selective media,含链霉素(str)，不含苏氨酸(thr)亮氨酸(leu),Replica Plating,9 min后，仅耐叠氮化物细胞开始生长,链霉素(str)，苏氨酸(thr)亮氨酸(

23、leu),含链霉素(str)，不含苏氨酸(thr)亮氨酸(leu),10 Minutes,除耐叠氮化物细胞数增加外，耐T1噬菌体细胞也开始生长,含链霉素(str)，不含苏氨酸(thr)亮氨酸(leu),15 Minutes,耐叠氮化物与耐T1噬菌体细胞、及可利用乳糖细胞生长,含链霉素(str)，不含苏氨酸(thr)亮氨酸(leu),18 Minutes,所有细胞都生长,含链霉素(str)，不含苏氨酸(thr)亮氨酸(leu),Wollman和Jacob实验结果,在两菌株混合后8 min时，还未见有供体菌的非选择性标记基因进入F-细菌。9 min时开始出现azi，然后相继出现其他抗性菌落。,混合

24、9 min后取样时，开始出现少量对叠氮化物有抗性的菌落，说明抗叠氮化物的基因此时已进入F-细胞中，但对T1噬菌体来说，全部F-细胞还属于敏感型，说明tonA基因还没有进入F-细胞中。混合11 min后，才开始出现抗噬菌体T1的F-细菌。混合18 min出现乳糖发酵的基因。混合24 min取样时，出现半乳糖发酵的基因。说明Hfr菌株的基因是按一定的线性顺序依次进入F-菌株，即染色体从原点开始以直线方式进入F-细胞。,结果,总结,1.重组体中各标记基因进入F-细胞中时间不同，达到最 高水平的时间也不同。2.随时间的推迟，某个基因的重组率增加；一定程度后，重组率便不再增加。如：10 min时，ton

25、r首次出现，15 min时40%，25 min 80%，所以，Hfr细菌的基因是按一定线性顺序依次地进入在F-细菌。3.以基因出现的时间为标准作出大肠杆菌的遗传连锁图。4.用一种大肠杆菌的不同Hfr菌株进行中断杂交试验，作出连锁图，其基因向F-细菌转移的顺序不同。,从Hfr 菌株的基因在F-细菌中出现开始，随着时间的推移，具有这一基因的菌落逐渐增加，直到某一百分数为止；而且某一基因出现的时间愈早，它所达到的百分数也愈高。例如：azi抗性基因出现最早，在20 min时就达到约90%的F-菌落；gal基因出现最迟，即使在混合后30 min时，也只有30%的F-菌落。,抗叠氮化物基因,乳糖基因,半乳

26、糖基因,T1噬菌体敏感基因,Time Map,Times when individual genes first observed to have been transferredTime could vary depending upon Hfr strainOrder sameStart point varied,Interrupted-mating experiment,重组体中Hfr各标记基因出现的百分率。,Hfr细菌的基因的转移是从染色体的一端（原点或O）开始，以线性方式进入F-细胞中，基因离开原点愈远，进入F-细胞愈迟。离开原点较远的基因，可能在转移过程停止以前，仍未转移，因而斜率

27、较低，达到的高峰值也较小。Wollman和Jacob发现F因子最后转移到受体，并使它们成为供体，但效率较低，是线性染色体的最后一个单位。O azi ton lac gal F,用一种大肠杆菌的不同Hfr菌株进行中断杂交实验，作出连锁图，其基因向F-细胞转移的顺序不同。不同Hfr菌株转移的原点和转移方向不同。进一步说明了F因子和细菌染色体都是环状。,抗叠氮化物基因,乳糖基因,半乳糖基因,T1噬菌体敏感基因,苏氨酸,亮氨酸,脯氨酸,硫氨素,大肠杆菌染色体呈环形,而初看起来每个基因的转移似乎没有规律，但仔细分析可发现每个基因转移顺序是不变的，所以，Hfr细菌的基因顺序虽不相同，但不是随机的。它们的相

28、对位置未变；从原点O开始，F因子总是最后转移，在原点的另一端。,F因子的产生,F质粒的形成与转移,色氨酸,FF-接合,色氨酸缺陷型,色氨酸缺陷型,F菌有许多性质与Hfr和F+相同，其最大特点是构建部分二倍体菌（一个完整的基因组和一个不完整的基因组所构成的二倍体）。,Conversion of Hfr to F,整合的F质粒可以消失通常包括部分寄主染色体新质粒称为F质粒细胞与F结合形成部分二倍体(very useful for studying genetic regulation in bacterial systems),FF-接合,FF-接合,R-Plasmid Conjugation,C

29、onjugation,转导、转化与结合,结合,转化,转导,转导、转化与结合,转导,转化,结合,4.原生质体融合(Cytoplasmic fusion),通过人为方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并发生重组子的过程，称为原生质体融合或细胞融合。,原生质体融合,原生质体融合是将两种不同的细菌经溶菌酶或青霉素等处理，失去细胞壁成为原生质体后进行彼此融合的过程。聚乙二醇可促使二种原生质体的融合。原生质体融合是一种人工基因转移系统，本质上与基因转移无关或关系很小。,PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：可促使细胞凝结；破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融

30、合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。,聚乙二醇,原生质体融合,5.溶原性转换(lysogenic conversion),溶原性转换是当噬菌体感染细菌时，宿主菌染色体中获得了噬菌体的DNA片段，使其成为溶原状态时而致细菌获得新的性状。白喉棒状杆菌,溶原性转换,白喉棒状杆菌产生白喉毒素，是因其前噬菌体（-棒状噬菌体）带有毒素蛋白结构基因（tox基因）。A群溶血性链球菌受有关温和噬菌体感染发生溶原性转换，能产生致热外毒素。肉毒梭菌的毒素、金黄色葡萄球菌溶菌素的产生，以及沙门氏菌、志贺氏菌等的抗原结构和血清型别都与溶原性转换有关。,溶原性转换,二、真核微生物的基因重组,1.有性杂交(

31、Sexual hybridization)2.准性杂交(Parasexual hybridization)3.原生质体融合(Protoplast fusion)4.转化,1.有性杂交(Sexual Hybridization),有性杂交：一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。用于产有性孢子的微生物。,霉菌的有性生殖,两个性细胞结合产生新个体的过程,a）质配：两个性细胞结合，细胞质融合，成为双核细胞，每个核均含单倍染色体(n+n)。,b）核配：两个核融合，成为二倍体接合子核，此时核的 染色体数是二倍(2n)。,c）减数分裂：具有双倍体的

32、细胞核经过减数分裂，核中 的染色体数目又恢复到单倍体状态。,无性生殖,有性生殖,霉菌的繁殖和生活史,结合孢子(Zygospore),2.准性杂交(Parasexual hybridization),准性生殖：是一种在同种而不同菌株的体细胞间发生的融合，可不借减数分裂而导致低频率基因重组，并产生重组子的生殖方式。包括菌丝联结、形成异核体、核融合、体细胞交换和单倍体化。,准性杂交的类型,1）菌丝联结(amastomosis)：发生在形状相同而遗传性有异的同一菌种两个不同菌株间。频率极低。2）形成异核体(heterocaryon)：体细胞联结，原有的单倍体核形成了双相异核体。,3）核融合(nucle

33、ar fusion)：异核体中的双核偶尔可以发生核融合，产生双倍体杂合子核。4）体细胞交换(somatic crossing-over)和单倍体化：体细胞交换即体细胞中染色体间的交换。,准性杂交的类型,霉菌的准性生殖,形态上无区别、遗传特性有差别的体细胞之间,两体细胞融合形成异核 体；b)异核体中两个单倍体核 发生核融合，形成二倍体核；c)二倍体核有丝分裂期间，发生同源染色单体片段的交换，形成二倍体重组核。,3.原生质体融合(Protoplast fusion),细胞融合后形成杂交细胞，所含基因是两个细胞的总和，类似有性生殖过程中的基因重组。因此也归为基因重组技术。,动物细胞融合,与植物原生质

34、体融合的基本原理相同，诱导融合的方法类似。常用的融合剂有：聚乙二醇、灭活的病毒等。应用：制备单克隆抗体。,最常用的是灭活的仙台病毒(HVJ,最早在日本仙台一实验室分离出来)，为RNA病毒。HVJ含有细胞表面受体的结合位点，可以促使不同细胞凝聚，最终使细胞膜相互融合。病毒诱导细胞融合的过程有：细胞表面吸附许多病毒粒子；细胞发生凝集；几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失；该部位邻接的细胞的细胞膜融合；胞浆相互交流，形成融合细胞。,灭活的病毒,鸡血细胞融合,小鼠多核巨嗜细胞的原生质融合,单克隆抗体的制备,注入小鼠,细胞融合,分离,抗原注入小鼠体内,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,细胞培养,

35、选择培养细胞,培养基,体内培养,体外培养,从腹水提取,从培养液提取,单克隆抗体,能产生的特定抗体,能在体外培养条件下大量增殖,在灭活的仙台病毒或聚乙二醇的诱导下融合,细胞融合是一个随机的物理过程。在小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合细胞悬浮液中，经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的B淋巴细胞-瘤细胞、融合的B淋巴细胞-B淋巴细胞、融合的瘤细胞-瘤细胞、未融合的B淋巴细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。其中只有B淋巴细胞-瘤细胞的融合体是有用的。正常的B淋巴细胞在培养基中存活仅几天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。,选择培养基具有3种关键成

36、分：次黄嘌呤(hypoxanthine)、氨甲蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶核苷(thymidine)，故名HAT培养基。可通过抑制核苷酸合成，达到去除未融合瘤细胞的目的。,植物细胞融合,植物细胞培养,植物细胞A,植物细胞B,去掉细胞壁,去掉细胞壁,原生质体A,原生质体B,原生质体融合（诱导膜融合、核融合在杂种细胞第一次有丝分裂时进行）,杂合的原生质体,再生出细胞壁,杂种细胞,细胞分裂,分化发育,愈伤组织,杂种植株,纤维素酶、果胶酶,植物体细胞杂交,植物体细胞杂交,纤维素酶果胶酶,人工诱导原生质体融合：物理法是利用离心、振动、电刺激促使原生质体的融合；化学法是用聚乙二醇(PEG)等试

37、剂作为诱导剂诱导融合。,去壁：,somatic hybridization,分离基因,克隆到某中间载体,转化大肠杆菌,提取质粒,限制酶切/连接,克隆到植物表达载体,转化农杆菌,基因枪转化,pKS,pBR332,pGEM-T,JM109,TOP10,HindIII/EcroI T4 ligase,pBI121,pCAM1001,LBA4404,EHA,4.转化（转染）,用携带外源基因的农杆菌引瘤(Ti)质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株转基因植物,农杆菌:used extensively for geneti

38、c engineering of plants.包含Ti质粒:Tumor inducing plasmid.(bacterial plasmid)T-DNA(Transferred-DNA)可以转移进入植物基因组。,Tumor induced byA.tumefaciens,植物表达载体,Ti Plasmid,毒力基因,复制起始点,已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。,冠瘿碱代谢,冠瘿碱合成,质粒接合转移,植物生长素产生,致瘤基因,细胞分裂素生产,基本原理：将DNA包裹于微小的金属钨或金颗粒表面，在高压下使金属颗粒喷射，高速穿透受体细胞或组织，使外源基因进入细胞的核中进行整合并表达。缺点：转化效率较低，仪器昂贵。已使烟草、大豆、棉花、玉米等多种植物细胞得到转化。,基因枪法（微射轰击法）,Gene gun,