分子生物学PPT.ppt

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1、第二章 遗传的物质基础DNA,1、遗传物质的本质2、DNA的一级结构3、DNA的二级结构4、DNA物理结构的不均一性5、DNA的变性、复性和杂交6、DNA二级结构的多样性7、DNA超螺旋和拓扑异构现象,遗传物质的本质The Nature of Genetic Material,Background1869年，瑞士科学家Friedrich Miescher从绷带上的白细胞核中分离出一种含磷的物质，命名为核素（nuclein）。核素的主要成分是染色质，是DNA和蛋白质的混合物。这是首次对基因的化学本质进行探索。核酸(nucleic acids)这一名词于Miescher发现核素20年后才被正式启用

2、。,19世纪末期，DNA和RNA已经从细胞中分离出来，为进一步的化学分析奠定了基础。20世纪30年代，P.Levene和W.Jacobs等搞清了DNA和RNA的基本化学组成。他们还注意到了DNA和RNA所包含核糖的差异。,1928年，英国细菌学家Frederick Griffith发现了肺炎链球菌的转化现象，这一发现表明活的无毒R型细菌从死去的有毒S型菌得到了一些什么东西从而使无毒的R型转化成有毒的S型肺炎球菌。但转化源（transforming principle）的化学本质仍是一个谜。,细菌转化实验（Transformation in Bacteria）,1944年，美国纽约洛克菲勒医学研

3、究所（Rockefeller Institute for Medical Research）的细菌学家Oswald Avery、Colin Macleod和Maclyn McCarty用有机溶剂去除细菌提取物中的蛋白质成分、用胰蛋白酶（trypsin）和胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）消化蛋白对细菌的转化都没有任何影响。但DNA酶消化却可以使转化作用不能发生。,Avery等对转化物质又进行了超速离心、电泳、紫外分光光度测定等一系列分析，发现转化物质具有高分子量、高电泳迁移率等特性，在260 nm波长有光吸收，N/P比在1.67左右。这些都已经说明转化源就是DNA。但Avery等人的发现

4、并没有产生多大的影响，因为当时蛋白质是遗传物质的观点盛行。怀疑派所提出的问题是转化因子究竟是纯DNA还是和DNA混杂在一起的少量蛋白质。,HersheyChase噬菌体侵染实验,1952年，美国冷泉港实验室Hershy和Chase用32P和35S分别标记噬菌体的DNA和蛋白质，发现只有DNA进入宿主细菌内，而蛋白质则没有。HershyChase的实验进一步说明DNA是遗传物质。,HersheyChase实验,1950年以后，Chargaff、Markham等人测定了大量生物的DNA碱基组成后，发现不同生物的DNA碱基组成不同，具有严格的种的特异性。这也给当时反对DNA是遗传物质的“四核苷酸学说

5、”以致命的打击。1953年，DNA双螺旋结构模型的提出才真正确立了DNA是遗传物质的观点。,RNA也可以作为遗传物质,所有已知的有机体和许多病毒的遗传物质都是DNA双螺旋，但一些病毒也采用另一种核酸RNA作为遗传物质，如逆转录病毒。类病毒（viroid）只由很小的环状RNA分子组成，其RNA本身就是一个感染因子。,是否存在核酸以外的其他遗传物质？,自然界似乎有特例表明，还有除核酸之外的遗传物质。朊病毒是迷一样的感染性粒子。目前唯一鉴定的组分是蛋白，所以这种感染性粒子不是核酸，而是一种蛋白质病原，称为朊病毒（prion）。,1997 年美国加州大学旧金山分校（UCSF）的Stanley Prus

6、iner 教授在被朊病毒感染的病体中发现了一种具有传染性、可以抗蛋白酶的特殊蛋白质，称为朊病毒蛋白（Prion Protein，PrP）并对其感染机制进行了探讨。朊病毒蛋白（prion protein，PrP）以两种形式存在：正常的脑组织中发现的PrPC不具有感染性，对蛋白酶敏感，可以被完全降解；而PrPSC具有感染性，具有抗蛋白酶的性能。,PrPC和PrPSC的一级结构完全相同，但二级结构却有很大差异：前者螺旋的含量约为40，几乎没有片层结构；而后者含有高达50的片层结构，只有20的螺旋。正常朊蛋白构型发生异常改变后导致疯牛病，无需DNA或RNA的参与，致病因子朊蛋白就可以传染复制。所谓朊病

7、毒的繁殖就是正常的PrPC蛋白质转变为PrPSC的过程，而且朊病毒感染后也具有指数增长的特性。,朊病毒的繁殖过程实际上就是朊病毒PrPSC和PrPC结合，以PrPSC为模板把PrPC的立体构型的信息输入到PrPC的过程。因为这是个繁殖过程，自然就是一个遗传信息的传递过程。这种遗传过程是蛋白质和蛋白质之间遗传信息的输出与输入的过程。,2001年加里福尼亚大学的Peter Chien和Jonathan Weissman通过实验模拟了朊病毒在两种不同酵母菌之间的传染过程。他们发现一个朊蛋白分子可以有多种致病构型，并能将其它朊蛋白转化而不需要其它蛋白的协助，为阐明朊病毒跨物种传染机制打下基础。,2 D

8、NA的一级结构,20世纪40年代中期，生物化学家已经搞清楚了DNA和RNA的基本组成。DNA和RNA均为核苷酸（nucleotide）组成链状大分子，核苷酸之间通过3-5-磷酸二酯键（phiosphodiester）相连。DNA的一级结构就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学组成。,PhosphodiesterBackbone,组成DNA分子的碱基虽然只有4种，它们的配对方式也只有AT和GC两种，但是碱基可以按任何顺序排列，构成了DNA分子近乎无限的多样性。DNA分子一级结构中的显著特点是核糖的2位上没有自由的羟基，这也是DNA这一主要遗传物质极其稳定的根本原因。,DNA

9、一级结构的意义不仅在于它蕴藏了遗传信息，而且还决定了DNA的二级结构和高级结构。DNA一级结构的测定进展迅速。,3 DNA的二级结构,WatsonCrick右手双螺旋结构Background20世纪40年代，W.T.Astbury就用X射线晶体衍射研究DNA的结构。1950年，Chargaff从大量的不同来源的DNA样品的分析中发现了DNA组成的当量规律，即AT，GC，AGCT。,理论化学家Linus Pauling在蛋白质-螺旋的氢键连接以及对-螺旋的解释方面作出了重要的贡献。Maurice Wilkins、Rosalind Franklin等在DNA的X射线晶体结构方面作出了重大的贡献。特

10、别是1952年，Rosalind Franklin得到的高分辨率的DNA X-射线衍射图对于Watson和Crick 右手双螺旋模型的提出起了非常重要的作用。,Rosalind Franklin的X-射线衍射图,Watson-Crick右手双螺旋结构模型的要点主链 脱氧核糖和磷酸通过3,5磷酸二酯键交互连接，成为螺旋链的骨架（backbone）。两条链方向以反向平行的方式组成右手双螺旋。,碱基对 只有A和T配对，G和C配对才能满足正常螺旋（直径20）的要求和chargaff的当量规律。,A very useful number:660,氢键 配对碱基之间能够形成氢键，而同一条链中的相邻碱基形成

11、一种碱基堆积力。两种力量的协同作用维持了双螺旋结构的稳定性。螺距 每个螺距为34，其中含有10个核苷酸。,大沟和小沟 对于遗传上有重要功能的蛋白质识别DNA双螺旋结构上的特定信息是非常重要的。,bHLH转录因子对DNA大沟的识别,决定双螺旋结构状态的因素,氢键 GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，这是DNA双螺旋结构的重要特征之一，DNA的许多物理性质如变性、复性以及Tm值等都与此有关。加入尿素或甲酰胺等可以使Tm值显著降低。,碱基堆集力 DNA同一条链相邻碱基之间的非特异性作用力，包括疏水作用力和van der Waal力。疏水作用力使DNA相邻的碱基有相互堆集在一起的趋势，这是形成碱基

12、堆集力的重要因素之一。DNA双链中存在大量的嘌呤环和嘧啶环，其累积的van der Waal力是相当可观的，这是形成碱基堆集力的另一个重要因素。,氢键与碱基堆集力的协同作用 已经堆基的碱基更容易发生氢键的键合，相应地已经被氢键定向的碱基更容易堆集。两种作用力相互协同，形成一种非常稳定的结构。如果一种作用力被消除，另一种作用力也大为减弱。,带负电荷的磷酸基的静电斥力 DNA溶液中的离子浓度降低时，阳离子在磷酸基周围形成的屏蔽作用减弱，使得磷酸基地静电斥力增大，因而Tm值随之降低。所以纯蒸馏水中的DNA在室温下就会变性。碱基分子内能 温度升高，碱基分子内能增加时，碱基的定向排列遭受破坏，消弱了碱基

13、的氢键结合力和碱基的堆集力，会使DNA的双螺旋结构受到破坏。,总之，氢键和碱基堆集力有利于DNA维持双螺旋结构，而静电斥力和碱基分子内能则不利于DNA维持双螺旋结构。,4 DNA物理结构的不均一性,DNA的一级结构中，A、T、G、C远非均匀分布，DNA长链各处的物理结构并不完全相同。反向重复序列（迴文序列，inverted repeats）较短的迴文结构可能是作为一种信号，如限制性内切酶的识别位点。另外，转录作用的终止与迴文结构也有关系。,富含AT的序列 在很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT。特别是在复制起点和启动子的Pribnow框（真核生物为TATA框）的序列中，都富含AT碱基对，对

14、于复制和转录的起始十分重要。嘌呤和嘧啶的排列顺序对双螺旋结构稳定性也会产生一定的影响。,DNA双螺旋的呼吸作用 配对碱基之间的氢键迅速断裂和再生的过程，成为DNA链的呼吸作用。特别是富含AT的节段更为明显，经常发生瞬间的单链泡状结构。这对于某些特殊的蛋白质与DNA发生反应并阅读DNA链内部储藏的信息具有重要的作用。,5 DNA的变性、复性、杂交,DNA的变性 当DNA被加热或在某些试剂的作用下，配对碱基之间的氢键和相邻碱基之间的碱基堆集力就会受到破坏，DNA由天然状态转变为近似无规则线团构型的过程称为变性，又称为熔解。,常用的DNA变性方法主要是热变性和碱变性方法。pH11.3时，全部氢键都被

15、破坏，DNA完全变成单链的变性DNA。DNA变性后会引起光吸收的增加，即增色效应。,DNA的复性 变性的单链DNA重新形成双螺旋结构的过程称为复性。复性的条件有两个（1）有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力；（2）有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高，一般使用比Tm值低2025。,复性的机制 一般认为需要1020个碱基对，特别是富含GC的节段首先形成一个（或几个）双螺旋核心，这一步叫成核作用。然后两条单链的其余部分就会迅速形成双螺旋结构。绝大部分的复性DNA分子都不是原配的。,多聚酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是一种DNA体外扩增技术，其

16、基本原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。,杂交 复性DNA中，如果两条链的来源不同，就叫杂交分子。DNA和DNA杂交技术、DNA和RNA杂交技术以及RNA和RNA杂交技术分子生物学中占有很重要的地位。,6 DNA二级结构的多样性,1953年，Watson和Crick提出的右手双螺旋模型所用的资料来自相对湿度为92时所得到的DNA钠盐纤维，基本上相当于B型。除此之外，人们还发现了A构象、C构象、D构象和E构象等右手双螺旋构象以及左手双螺旋的Z构象。,在相对湿度75以下获得的DNA纤维具有不同与

17、B-DNA的结构特点，称为A构象。DNA-RNA杂交分子和RNA-RNA双链结构均采取A构象。Z-DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤和嘧啶交替排列所造成的，比如CGCGCGCG或CACACACACA。Z-DNA的出现在热力学上是不利的，因此Z-DNA会在DNA链上形成一个局部的不稳定区，成为潜在的解链位点。而解链是复制和转录的中心环节，因此Z-DNA与基因调节有关。,B-DNA是活性最高的DNA构象，B-DNA变构成为A-DNA后，仍有活性，但若局部变构为Z-DNA后活性明显降低。B-DNA和Z-DNA之间的变构是转录调节的一种模式。在活的生物体内，不论是DNA的二级结构还是高级结构，都存在一

18、个动力学的平衡。,二级结构的其他形式单链核酸形成的二级结构 RNA是主要的单链核酸，RNA分子内部存在部分序列之间的碱基配对，核酸链自身回折配对产生反向平行的双螺旋结构，叫发夹结构（hairpin）。发夹结构由碱基配对的双螺旋区茎和末端不配对的环构成。,7 DNA超螺旋和拓扑异构现象,绝大多数原核生物都是共价封闭环（covalently closed circle）,简称CCC分子。这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构（superhelix或supercoil）。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式。超螺旋是有方向的，有正超螺旋和负超螺旋两种。,所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产

19、生的。DNA拓扑异构酶催化反应的本质是先切断DNA的磷酸二酯键，改变DNA的链环数之后再连接之，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能。,超螺旋DNA分子的结构紧密，有较大的沉降常数，有较大的电泳迁移率。这是实验室中分离纯化并鉴定超螺旋DNA的重要依据。很多能够嵌入相邻碱基之间影响碱基堆集作用的试剂，特别是片状的染料分子，也能改变DNA的拓扑状态。最明显得例子就是溴化乙锭（ethidium bromide，EB）。,DNA携带着两类不同的遗传信息,一类是负责蛋白质氨基酸组成的信息，是以三联体密码子方式进行编码的。另一类遗传信息是关于基因选择性表达的信息。基因组中大部分DNA序列是用来编码基因选择性表达信息的。这种选择性除了时序调节和环境调控外，某些调控DNA序列还可以与调控蛋白质相互作用而修饰自己的双螺旋空间结构。,