微生物反应器操作...ppt

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1、第三章 微生物反应器操作,一、微生物培养过程根据是否要求供氧的分类：厌氧培养：不通氧的深层培养好氧培养：液体表面培养 通风固态发酵 通氧深层培养,第一节 微生物反应器操作基础,二、通氧深层培养分类,(1)分批式操作（batch operation,batch fermentation）底物一次性加入反应器内，在适宜条件下接种进行反应，反应完成后将全部反应物取出的操作方式。是目前发酵制品生长采取的主要操作方式。,(2)反复分批式操作（repeated batch operation）是指分批操作完成后取出部分反应系，剩余部分重新加入一定量的基质，再按照分批式操作方式反复进行。,(3)半分批式操作

2、,半分批式操作(semibatch operation)也称流加式操作(feedbatch operation)。是指先将一定量基质加入反应器内，在适宜条件下接种使反应开始。反应过程中，将特定的限制性基质按照一定要求加入到反应器内，以控制罐内限制性底物浓度保持一定，当反应终止取出反应物料的操作方式。酵母、淀粉酶、某些氨基酸和抗生素等常用操作方式。,(4)反复半分批式操作（repeated semibatch opertion）是指流加操作完成后，取出部分反应系，剩余部分重新加入一定量基质，再按流加操作方式进行，反复进行。,(5)连续式操作（continuous operation）,是指在分批

3、式操作进行到一定阶段，一方面将基质连续地供给到反应器中，另一方面又把反应液连续不断地取出，使反应条件（如反应液体积等）不随时间变化的操作方式。活性污泥法处理废水、固定化微生物反应等多采取连续式操作。,第二节 分批发酵法,发酵工业中常见的分批方法是采用单罐深层培养法。每一个分批发酵过程都经历接种，生长繁殖，菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。这一过程中在某些培养液的条件支配下，微生物经历着由生到死的一系列变化阶段，在各个变化的进程中都受到菌体本身特性的制约，也受周围环境的影响。,一、分批发酵的特点,微生物所处的环境是不断变化的；可进行少量多品种的发酵生产；发生杂菌污染能够很容易终止操作；当运转

4、条件发生变化或需要生产新产品时，易改变处理对策；对原料组成要求较粗放。,（一）延滞期,把微生物从一种培养基中转接到另一培养基的最初一段时间里，尽管微生物细胞的重量有所增加，但细胞的数量没有增加。这段时间称之为延滞期。,延滞期细胞特点：细胞本身面临着一系列的变化，如pH值的改变、营养物质供给增加等。因而，延滞期的微生物主要是适应新的环境，让细胞内部对新环境作出充分反应和调节，从而适应新的环境。从生理学的角度来说，延滞期是活跃地进行生物合成的时期，为将来的增殖作准备。,延滞期长短对发酵结果的影响,种子培养基和培养条件必须合适，只有这样才能获得高的产量。接种后延滞期的长短关系到发酵周期的长短，而与产

5、物形成速率和产率并无必然联系。实际生产过程中，为缩短发酵周期、提高设备利用率、提高体积生产率，就必须尽可能地缩短延滞期。,延滞期长短的因素,接种材料的生理状态，如果接种物正处于指数生长期，则延滞期可能根本就不出现；培养基的组成和培养条件也可影响延滞期的长短。接种物的浓度对延滞期长短也有一定影响，加大接种浓度可相应缩短延滞期。,解决途径：一是尽量选择处于指数生长期的种子；二是扩大接种量。但是，如果要扩大接种量，又往往需要多级扩大制种，这不仅增加了发酵的复杂程度，又容易造成杂菌污染，故而应从多方面考虑。,不同营养对发酵酒精废液的米曲霉种子品质和形态的影响,（二）指数生长期,对细菌、酵母等单细胞微生

6、物来讲，单位时间内其细胞数目将成倍增加。而对于丝状微生物而言，单位时间内其生物量将加倍。此时，如以细胞数目或生物量的对数对时间作一对数图，将得一直线，因而这一时期称作指数生长期。,指数生长期细胞特点,细胞保持均恒生长。不断吸收培养基中的营养成分以合成自身物质，并不断向培养基中分泌代谢产物。由于此时培养基中的营养成分远远过量，且积累的代谢产物尚不足以抑制微生物本身的生长繁殖，因而微生物的生长速率不受这些因素的影响，而仅与微生物本身的比生长速率及发酵液中的生物量浓度X(g/L)相关。,对于单细胞的微生物来说，还可进一步简化为,N培养基中的细胞密度。,对于特定的微生物而言，其比生长速率只与三个因素有

7、关。限制性营养物质的浓度、最大比生长速率m、底物相关常数Ks。假定营养物质进入细胞后，立即被利用而不积累，则存在以下关系式：,如果各种营养物质均大大过量的话，则=m，这时便是指数生长期。也就是说，处于指数生长期的微生物，其生长繁殖不受营养物质的限制，因而具有最大比生长速率。如果发酵的目的是为了获得微生物菌体的话，则应尽量设法维持指数生长期。,微生物的最大比生长速率在工业上的意义,为保证工业发酵的正常周期，要尽可能地使微生物的比生长速率接近其最大值。最大比生长速率不仅与微生物本身的性质有关，也与所消耗的底物以及培养的方式有关。限制微生物生长代谢的并不是发酵液中营养物质的浓度，而是营养物质进入细胞

8、的速度。,（三）稳定期,在细胞生长代谢过程中，培养基中的底物不断被消耗，一些对微生物生长代谢有害的物质在不断积累。受此影响，微生物的生长速率和比生长速率就会逐渐下降，直至完全停止，这时就进入稳定期。处于稳定期的生物量增加十分缓慢或基本不变；但微生物细胞的代谢还在旺盛地进行着，细胞的组成物质还在不断变化。,当微生物赖以生存的培养基中存在多种营养 物质时，微生物将优先利用其易于代谢的营养物质，至其耗用完时，降解利用其他营养物质的酶才能诱导合成或解除抑制。,稳定期特点,此时，有的细胞开始老化、裂解，形成芽孢，并向培养基中释放出新的碳水化合物和蛋白质等，这些物质可以用来维持生存下来的细胞缓慢生长。微生

9、物的很多代谢产物，尤其是次级代谢产物，是在进入稳定期后才大量合成和分泌的。,（四）死亡期,在死亡期，细胞的营养物质和能源储备已消耗殆尽，不能再维持细胞的生长和代谢，因而细胞开始死亡。这时，以生存细胞数目的对数对时间作图，可得一直线，这说明微生物细胞的死亡呈指数比率增加。在发酵工业生产中，在进入死亡期之前应及时将发酵液放罐处理。,第三节 微生物生长动力学的基本概念,一、微生物在一个密闭系统中的生长情况：,时间,菌体浓度,延迟期,指数生长期,减速期,静止期,衰亡期,延迟期：,指数生长期:,倍增时间：td,减速期:,静止期：;,衰亡期:,二、分批发酵产物形成的动力学,(一)生产连动型产物形成(I型发

10、酵)微生物的生长、碳水化合物的降解代谢和产物的形成几乎是平行进行的，营养期和分化期彼此不分开。生产连动型产物通常都直接涉及微生物的产能降解代谢途径，或是正常的中间代谢产物。酵母发酵生成酒精，以及葡萄糖酸和大部分氨基酸、单细胞蛋白都属于这种类型。,二、Gaden对发酵的三分类与Pirt方程：,一类发酵 产物的形成和菌体的生长相偶联,x,p,分批生物工艺中各种比速率(生长速率、基质消耗qk和产物形成qp)之间关系的图示生产连动型,生产连动型产物的生成反应可表示如下：,产物形成的比速率则与微生物的比生长速率呈正比。所以，对于这种类型的产物来说，调整发酵工艺参数，使微生物保持高的比生长速率，对于快速获

11、得产物、缩短发酵周期十分有利。,(二)部分生长连动型产物形成(II型发酵)部分生长连动型产物又称混合型产物，它们通常都间接地与微生物的初级产能代谢途径相关，是由产能代谢派生的代谢途径产生的。,其生成反应可表示为；,柠檬酸、衣糠酸、乳酸和部分氨基酸为这种类型产物的典型代表。在分批发酵中，这种类型产物的形成分成两个极限：起初，微生物消耗大量底物用于产能代谢和生长，而产物形成很缓馒，甚至根本不形成；此后，当微生物的生长速率开始减慢后，细胞开始大量消耗底物以合成产物。对这类产物来说，营养期和分化期在时间上是彼此分开的。,二类发酵 产物的形成和菌体的生长部分偶联,x,p,分批生物工艺中各种比速率(生长速

12、率、基质消耗qk和产物形成qp)之间关系的图示(b)部分生长连动型,产物的形成只与发酵液中的菌体浓度有关，而微生物的生长速率对它无直接影响。对于这一类型发酵，只要能保证获得足够高浓度的生物量，就可以获得高速率的产物合成。,(三)非生长连动型产物形成(型发酵),非生长连动型的产物一般不是直接或间接来自微生物的产能降解代谢，而是通过两用代谢途径合成的。在这一类型的发酵中，起初是微生物的初级代谢和菌体生长，而没有产物的合成。此时，营养物质的消耗非常大。,当培养基中的营养物质消耗尽、微生物的生长停止以后，产物才开始通过中间代谢大量合成。即产生该类产物的微生物，其营养期和分化期在时间上是完全分开的。非生

13、产连动型的产物大多数是微生物的次级代谢产物，大多数的抗生素和生物毒素，以及维生素类。,三类发酵 产物的形成和菌体的生长非偶联偶联,x,p,分批生物工艺中各种比速率(生长速率、基质消耗qk和产物形成qp)之间关系的图示c)非生长连动型,Pirt方程,a+b,a=0、b0：可表示一类发酵,a0、b=0：可表示二类发酵,a0、b0：可表示三类发酵,例题1：以甘油为基质进行阴沟气杆菌分批培养，时间t=0时，X0=0.1g/L，S0=50g/L。反应方程式可以Monod方程表示，max=0.85h-1，Ks=1.23x10-2g/L，Yx/s=0.53g/g（以细胞/葡萄糖计），若不考虑诱导期和死亡期，

14、求培养至6h的菌体浓度。,由菌体得率定义式，带入已知数值：,变形，得：S=-1.89X+50.2,变形得：,因为：,将公式（3）带入到（4）中，积分得：,(1),(2),(3),(4),(5),X=16g/L,例题2：采用合成培养基，在1m3生物反应器中进行大肠杆菌分批培养，菌体的生长变化可利用Monod方程描述，已知max=0.935h-1，Ks=0.71kg/m3，基质初始浓度为50kg/m3，菌体初始浓度X0=0.1kg/m3，Yx/s=0.6kg/kg（以细胞/基质计），求当80%的基质已反应时所需时间。,当80%的基质已反应时的基质浓度为S=50-(50 x80%)=10kg/m3由

15、于在整体反应过程中SKs=0.71kg/m3Monod方程,可以写成：,S0=50kg/m3，S=40kg/m3，Yx/s=0.6(S0-S)Yx/s=40X0.6=24kg X=24.1,时间从t=0至t=t时，菌体增量由0.1kg增至24kg,(1)式积分,(1),第三节 分批补料培养技术,在传统的分批培养发酵工艺中，所有的物料都是在发酵开始前加入反应器中的。一般来说，微生物生长所需要的营养物质浓度并不十分高，往往在10Ks以上时就可达到最大比生长速率。在此基础上，即使营养物质浓度再进一步提高，比生长速率也不会再增加了。然而，在分批发酵工艺中，低浓度培养基中的营养物质会迅速耗尽，引起微生物

16、过早地从指数生长期向稳定期转变，这样，设备的利用率和产物的积累浓度都不高。,高底物浓度的优缺点,提高底物浓度可以延长微生物的指数生长期，从而提高发酵的设备利用率、容积产量和产物的积累浓度；但过高的底物浓度往往会引起一系列的不利影响，如底物抑制、粘度升高引起的传质效率降低等。尤为严重的是，微生物的许多次级代谢产物的产生，都受高浓度的葡萄糖、碳水化合物以及含氮化合物的降解产物的抑制。,所谓分批补料培养技术，就是指在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和

17、产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。,1.补料分批发酵定义,2、补料分批发酵的优缺点,优点使发酵系统中维持很低的基质浓度，解除底物抑制、葡萄糖效应、代谢阻遏等问题；和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；不会产生菌种老化和变异等问题对发酵过程可实现优化控制。缺点存在一定的非生产时间；和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。,3.补料控制目的,解除基质过浓的抑制解除产物的反馈抑制解除葡萄糖分解代谢阻遏效应,补充微生物能源和碳源的需要。补充菌体所需要的氮源。补充微量元素或无机盐。,4、补料的内容,控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的

18、方向发展。为实现这一目标，在中间补料控制时，必须选择恰当的反馈控制参数和补料速率。,5、补料的原则,分批补料培养特点,分批补料培养技术是介于分批培养和连续培养之间的一种发酵技术。由于在发酵过程中向发酵罐中补加了物料，分批补料系统不再是一个封闭的系统。分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液，因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是随时间和物料流速而变化的变量。,3、补料分批发酵的类型,补料方式连续流加不连续流加多周期流加补料成分单一组分流加多组分流加控制方式反馈控制无反馈控制,流加发酵目前应用范围非常广泛，几乎遍及整个发酵行业。补料分批发酵的理论研究在20世纪70年代以前几乎是个空白，在早期的

19、工业生产中，补料的方式非常简单，采用的方式就仅仅局限于间歇流加和恒速流加，控制发酵也是以经验为主。直到1973年日本学者Yoshida等人提出了“Fed-batch fermentation”这个术语，并从理论上建立了第一个数学模型，补料分批发酵的研究才进入理论研究阶段。,六、补料控制,1.基质浓度对发酵的影响,大多数补料分批发酵均补加生长限制性基质以经验数据或预测数据控制流加；以pH、溶氧、产物浓度等参数间接控制流加；以物料平衡方程，通过传感器在线测定的一些参数计算限制性基质的浓度，间接控制流加；用传感器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流加。,5、补料控制的策略,6、补料控制参数的选择,为

20、了有效地进行中间补料，必须选择恰当的反馈控制参数，以及了解这些参数与微生物代谢、菌体生长、基质利用以及产物形成之间的关系。采用最优的补科程序也是依赖于比生长曲线形态、产物生成速率及发酵的初始条件等情况。因此，欲建立分批补料培养的数学模型及选择最佳控制程序都必须充分了解微生物在发酵过程中的代谢规律及对环境条件的要求。,例如，在谷氨酸发酵过程中的某阶段，生产菌的摄氧率和基质消耗速率之间存在着线性关系。连续补料和分批补料发酵的比较,7、补料速率的确定,优化补料速率也是补料控制中十分重要的一环，因为养分和前体需要维持适当的浓度，而它们则以不同的速率被消耗，所以补料速率要根据微生物对营养等的消耗速率及所

21、设定的培养液中最低维持浓度而定。,例如，用连续培养方法测定了在不同比生长速率下青霉素生产菌产黄青霉的碳、氯、氧、磷、硫和乙酸盐及菌最适生长所需的各种基质的补料速率。,第四节 连续培养技术,与在密闭系统中进行的分批培养相反，连续培养是在开放系统中进行的。所谓连续培养，是指以一定的速率向发酵液中添加新鲜培养基的同时，以相同的速率流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定不变，使培养物在近似恒定状态下生长的培养方法（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）。,1.连续发酵法特点,从系统外部予以调整，使菌体维持在衡定生长速度下进行连续生长和发酵。要维持这一衡定的速度，

22、必须使发酵罐中发酵液的稀释度，恰恰等于该微生物的生长速度。大大提高了发酵的生长效率和设备利用率。,恒定状态可以有效地延长分批培养中的指数生长期。在恒定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物质浓度、产物浓度、pH值，以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可以始终维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速率。,2.单批培养与培养的关系,3.连续培养器的分类,4.连续发酵的优点,（1）有利于缩短发酵周期，提高劳动生产率。连续发酵减少分批发酵中的清洗、投料、消毒等辅助时间，大大缩短发酵周期和提高设备利用率。同时连续培养过程始终使细胞生长处于最高生长繁殖状态，因此可明显提高生产效率，特别是对生产周期短的产品

23、，效果更为显著。（2）连续发酵生产过程比较稳定、均衡，各项参数也较恒定，便于自动化控制，品质量稳定。（3）由于连续发酵采用管道化和自动化生产，明显降低劳动强度。生长与代谢产物形成的两种类型节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合理。,连续发酵优点,（4）高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；（5）自控，便于利用各种仪表进行自动控制；（6）产品质量较稳定。,5.连续发酵存在的问题,以中间代谢产物为发酵产品的发酵，在理论和实践上都没有完全解决，如发酵过程中微生物生理生化特性变化，发酵动力学等并未充分了解。在生产上要保持

24、在连续发酵的整个过程中，生产菌株不发生退化也十分不容易。长时间的连续发酵中对发酵设备和空气净化系统的无菌要求更高。不能保持长时间的无菌操作是导致连续发酵失败的主要原因。对于某些原材料价格昂贵的产品，由于连续发酵对基质利用率较低，往往造成生产成本的增加。,连续发酵缺点,菌种易于退化。其次是易遭杂菌污染。所谓“连续”是有时间限制的，一般可达数月至一、二年。在连续培养中，营养物的利用率一般亦低于单批培养。,6.连续发酵的应用,采用连续发酵的方法可以有效地提高产量，但是也存在着某些较难克服的困难，因此目前仅在些比较简单的发酵产品中应用，如酵母，单细胞蛋白，酒精发酵、丙酮乙醇、石油脱蜡、活性污泥废水处理等。其余产品的连续发酵尚未工业化生产。,