微生物次级代谢.ppt

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1、,4 微生物次级代谢与调节,4.1 引论,初级代谢与次级代谢定义：初级代谢：为生物提供能量、合成中间体及其关键大分子，如蛋白质、核酸等的各种相互关联的代谢网络(包括分解与合成)。次级代谢：主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢物对菌生长不是必需的，对其生命活动可能具有某种意义，通常在生长后期开始形成。,次级代谢产物(Secondary Metabolites)是某些微生物在生命循环的某一个阶段产生的物质，它们一般是在产生菌生长中止后合成的。,微生物产生的次级代谢物有：抗生素:青霉素、万古霉素、红霉素色素:放线紫红素(Act)、Red生物碱(alkaloid):吗啡、喜树碱毒素,研究微生物次级代谢

2、的意义：,获得与次级代谢有关的基础理论知识，并用于设计更为有效的途径来合成这类复杂的化合物或改造它们，以获得所需的生物性质；有助于优化次级代谢产物的工业生产。借助于生物合成途径的知识，利用基因工程技术可以帮助构建在遗传学上能产生新化合物的突变株。,一般不在生长期产生，而在生长后期形成,（一）微生物次级代谢的特性,抗生素晚合成的原因之一可能是避免生长受其自身产物的抑制；次级代谢产物的合成过程一般是在培养基中缺乏某种营养物质，菌体生长受到限制时才启动的。,种类繁多，结构特殊，含不常见的化学键：,氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、麦角生物碱、戊二酰胺、多烯、吡咯、喹啉、萜烯、四环类抗生素等；-内酰胺

3、环、聚乙烯和多烯的不饱和键、大环内酯的大环和含有普通AA和经修饰的AA组成的环肽等；,一种菌所合成的次级代谢物往往是一簇结构相似的化合物。,举例：产黄青霉能产生10种具有相同母核、不同侧链的天然抗生素，结构上的差别使它们具有不同的生物活性。(参阅表4-1/P159)一簇抗生素中组分的比例取决于遗传和环境因素，这是由于参与次级代谢物合成的酶的专一性不强所致；而初级代谢方面的特异性总是很高，因差错会导致致命性的后果。次级代谢方面的差错对细胞的生长无关紧要，改变后的代谢产物有些还保留生物活性。,一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异的次级代谢物。例如：灰色链霉菌可生产链霉素、白霉素、吲哚霉素、灰霉

4、素、灰绿霉素和灰争霉素等；,不同种类的微生物亦能产生同一种次级代谢物。例如：如产黄青霉、点青霉、土曲霉、构巢曲霉、发癣霉属的一些真菌都能产生青霉素；,微生物由生长期向生产期过渡时，菌体在形态学上会发生一些变化。例如，一些产芽胞的细菌在此时会形成芽胞，真菌和放线菌会形成孢子。因此，有人把次级代谢产物的合成作用看作是细胞分化的伴随现象。,次级代谢产物的合成比生长对环境因素更敏感。其合成信息的表达受环境因素调节。,例如：菌体生长可在0.3300 mmol/L磷酸盐浓度下进行，而次级代谢物合成的最适浓度为0.110mmol/L。,次级代谢产物的合成是由多基因控制的代谢过程。,这些基因不仅位于微生物的染

5、色体中，也位于质粒中，并且染色体外的基因在次级代谢产物的合成中往往起主导作用。,（二）次级代谢物的生物合成,生源学(biogenesis)指的是代谢产物分子中构建单位的各种原子的起源；（有机化学）生源学又称为生物发生学，是指一些天然物质（包括有生命的物质）为什么会发生、存在的原因，及它对宿主，环境有何作用的科学。（生物化学）生物合成指的是各构建单位在多种酶的作用下合成次级代 谢产物的过程。（生物化学）,次级代谢物生物合成步骤：养分摄入细胞内；通过中枢代谢途径养分转化为中间体；次级代谢物前体的生物合成；中间体：对初级代谢而言；前体：对次级代谢而言；有时二者是同一物质，有时前体在中间体的基础上结构

6、略有改变。如有必要，改变其中的一些中间体；前体进入次级代谢物生物合成的专有途径；次级代谢的主要骨架形成后，作最后的修饰，成为产物。,次级代谢物通常由初级代谢中间体产生,氧化还原反应：一般涉及醇的氧化或羰基的还原，双键的引入或还原，氧原子的引入和芳香环的氧化裂解，这些反应是由脱氢酶或加氧酶催化的。生物甲基化是各种代谢物，特别是聚酮化物的生物合成中的重要反应。甲基的主要来源为甲硫氨酸、高半胱氨酸、甘氨酸和丝氨酸。卤化作用对分子中含卤元素(大多数是氯)的次级代谢物是很重要的。,将初级代谢中间体转化为次级代谢终产物有三个生化过程：,抗生素的生源学,抗生素生源学研究一些微生物会产生这类对其它微生物、甚至

7、对其自身有害物质的原因及这类物质的功能。在这方面的了解将有助于解释抗生素的形成机制和控制其生产。,抗生素的生源学(Biogenesis),1)合成次级代谢物是作为储藏物。2)作为正常代谢的无用的副产物。3)大分子消化后残留的碎片。4)解除体内有害代谢物的毒性。5)支路代谢物。6)竞争需要，用于抑制其它微生物，争夺有限的养分。,抗生素的生源学(Biogenesis),7)进化遗留所致。8)在自然界具有生态上功能。9)调节功能，至少与形态学，分化方面有关。10)代谢维持产物，其作用主是代谢过程，而不是产物本身。,可根据次级代谢产物分子中的主要组分与初级代谢的关系，把次级代谢产物分成五个基本类型：,

8、（二）次级代谢物的类型,次级代谢产物的类型,糖类 许多次级代谢产物在结构上明显与糖类物质有关。它们的前体物质都是葡萄糖，但是它们的结构在次级代谢过程中被修饰了。例如，链霉素，新霉素和卡那霉素等均是分子结构被修饰了的寡糖类抗生素。,次级代谢产物的类型,多肽类 同糖类物质一样，氨基酸或其聚合物(多肽)在次级代谢过程中常常被修饰，形成多肽类抗生素。例如链霉菌产生的放线菌素是由寡肽构成的。还包括芳香族氨基酸或其他氨基酸合成途径的中间体产物被修饰后形成的抗生素。例如，委内瑞拉链霉菌产生的氯霉素和头状链霉菌产生的丝裂霉素C等。,次级代谢产物的类型,聚脂酰类 这类化合物均以活性脂酰作为前体，通过聚合作用形成

9、的。由乙酰辅酶A可以形成两类自身缩合产物：一类是通过头尾联接的聚乙酮(酰)化合物；另一类是通过新形成的活性异戊二烯的寡聚作用形成的化合物。这类化合物可形成萜类、甾类和类胡萝卜素类次级代谢产物。属于这类次级产物的有水稻恶苗病菌产生的赤霉素等。,次级代谢产物的类型,核酸碱基类似物类 此类次级代谢产物的合成明显地与核酸碱基的合成相关。它们或者由细胞中现成的核苷酸经化学修饰转变而来，或者通过与核苷酸生物合成相似的过程合成而来。例如6-氨基嘌呤，焦土霉素，狭霉素，蛹螬菌素等。,次级代谢产物的类型,其它类型 微生物还产生一些不属于上述四种类型的次级代谢产物。因为人们很难根据这类化合物分子中的组分的来源，把

10、它们归于上述任何一种类型的次级代谢产物。,4.2 次级代谢物生物合成的前体,1、前体的定义,（一）前体的概况和来源,前体现代定义：指加入到发酵培养基中的某些化合物，它能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。,中间体：指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。,前体与中间体的区别：前体的结构往往略需改变后才进入到代谢途径中去；有时指同一物质。有些中间体可直接用作前体。但有些需经修饰才能作为前体。,次级代谢物前体的种类：,Betina认为，次级代谢物的前体大多数源自初级代谢的中间体：,糖类；莽草酸和

11、(或)芳香AA；非芳香AA；C1化合物；脂肪酸(尤其是乙酸和丙酸)；TCA循环的中间体；嘌呤和嘧啶。,Martin等将可作为次级代谢物前体的初级代谢的中间体分为：,短链脂肪酸；异戊二烯单位；AA；糖与氨基糖；环己醇与氨基环己醇；脒基；嘌呤与嘧啶碱；芳香中间体与芳香AA；甲基(C1库)。,次级代谢物的生物合成过程，除了在前体的形成和聚合过程外，遵循一般的生物合成规律。次级代谢途径同初级代谢的分解代谢、无定向代谢和组成代谢紧密相关。其前体通常是正常的或经修饰的初级代谢的中间体。,小结：,乙酸、丙酸、丙二酸、甲基丙二酸，形成乙酰 CoA、丙二酰 CoA、甲基丙二酰 CoA 等前体，作为抗生素建筑材料

12、进入次级代谢途径。,乙酰CoA与几个分子丙二酰CoA或甲基丙二酰CoA线性缩 合生成聚酮（polyketide）代谢物。如：四环素簇，大环 内酯和多烯大环内酯环骨架。,2、前体的来源由初级代谢物衍生次级代谢物的途径,（1）短链脂肪酸途径,（2）芳香中间体,莽草酸途径的中间体或终产物：莽草酸，对氨基苯甲酸，色氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，形成许多次级代谢物的芳香部分。莽草酸途径负责大多数放线菌和许多植物次生代谢物的生物合成；而大多数真菌产生的芳香代谢物是由乙酸通过聚酮（polyketide）途径合成。,举例：氯胺苯醇和棒杆菌素的生色团是由分枝酸衍生的。利福霉素的芳香成分来自莽草酸。绿脓菌素的吩嗪骨架源

13、自邻氨基苯甲酸。新生霉素和黄青霉素的芳香部分来自酪氨酸。放线菌素、吲哚霉素、硝吡咯菌素的芳香环源自色氨酸。,（3）经修饰的糖前体,氨基糖苷类抗生素：其糖大多数来自葡萄糖，其碳架以整体方式结合到抗生素中。但往往需要经过修饰或转化。糖的修饰：差向异构化，异构化，氨化，去羟基，重排(生成分枝糖)，脱羧，氧化和还原。糖的转化：以核苷二磷酸衍生物，如UDP-葡萄糖形式进行。UDP-葡萄糖由葡萄糖-1-P的葡萄糖基转给UTP获得。但是，大环内酯类抗生素的糖的生物合成是以TDP-衍生物作为中间体形式进行的。己糖胺的形成是通过己酮糖和谷氨酰胺的转氨作用完成的。,（4）异戊二烯单位异戊二烯单位是甾体化合物和萜类

14、的形成单位。,（5）甲基的来源 抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以甲硫氨酸（Met）作为甲基供体，通过甲基转移酶进行。而Met的甲基源自N5-四氢叶酸。转甲基时Met先活化，即在Mg2+和ATP存在下生成高能甲基供体：S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)。以SAM进行甲基化后自己变成S-腺苷酰高半胱氨酸(SAH)，后者可被水解为腺苷和高半胱氨酸。,形式：N-甲基化；O-甲基化,（1）抗生素建筑材料,（二）前体的作用,例如：丙酮酸可用于Ala、Val、Leu等的合成，是几种肽类抗生素（头孢菌素簇或青霉素簇）合成的重要中间体。,许多次级代谢物是用不同的中间体作为建筑单位合成的。,例如：大环内酯类抗生素：

15、其糖苷配基是由脂肪酸衍生的，其糖部分是由葡萄糖衍生的。真菌毒素和橘霉素：是由五个C2单位(Ac-CoA加上4个丙二酰CoA)，2个甲基和由C1库来的羧基合成的。新生霉素：具有更为复杂的来源，它是由葡萄糖、莽草酸、GLN、C1库、Tyr和乙酸或Leu合成的。,（2）诱导抗生素生物合成 前体具有调节抗生素生产的作用，尤其在细胞中的特殊合成酶的活性已被激活的情况下。,例1：在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中头霉素C的一种前体，-氨基己二酸是由赖氨酸合成途径来的。它与蛋白质合成竞争此前体的供应。加入过量的Lys，Lys途径中间体，二氨基庚二酸或-氨基己二酸到发酵液中可

16、增加头霉素的发酵单位。,例2：产黄青霉的青霉素酰基转移酶可转化异青霉素N，除去青霉素N的侧链，换上天然青霉素的其他侧链。侧链的置换取决于发酵液中含有适当的前体，如苯乙酸或苯氧乙酸等。故苄青霉素的发酵单位随发酵液中的限制性苯乙酸的增加而提高。,例3：L-Val被认为是环孢菌素A的前体和生物合成的诱导物。加入Val可促进T.inflatum固定化细胞合成环孢菌素A。例4：赤霉素受葡萄糖的阻遏。这可通过加入3-甲基-3,5-二羟基戊酸克服。,例5：丙醇和丙酸具有促进红霉素生产的作用，丙酸的作用稍差些。在发酵前期加入丙醇会干扰生长，从而降低抗生素的合成。先前认为，丙醇的促进作用完全是由于起前体的作用，

17、现已清楚，除了作为前体外，它还能诱导红霉素链霉菌的Ac-CoA羧化酶。此诱导作用似乎发生在转录水平，因在发酵中加入放线菌素D可以阻抑这种作用。,（3）前体与诱导物的区别,诱导作用在次级代谢物的合成控制上起重要作用。有时难于区分这种促进作用是真的诱导物的作用还是前体的作用。,诱导物与前体的作用时期不同。一般把那些能在生长期内，生产期前促进抗生素生物合成的化合物看做诱导物，而前体往往只在生产期内起作用，甚至蛋白质合成受阻的情况下也行。,诱导物应能被非前体的结构类似物取代。如Met除了可作为头孢菌素合成的前体，提供S的作用，更为重要的作用在于诱导节孢子的形成，而后者的多寡影响头孢菌素的合成。Met可

18、被Leu取代。诱导物的另一个特征是其诱导系数特别高。如诱导链霉素形成的A因子，给链霉素生物合成受阻的突变株1g 纯的A因子(在接种时)，可诱导1g链霉素的形成，其诱导系数为106。,（三）前体的限制性,前体常常是次级代谢物生物合成的限制因素。例1：在发酵过程中加适量苯乙酸可强烈促进苄青霉素的生产；例2：丙酸或丙醇促进大环内酯抗生素的生物合成。例3：肽类抗生素的形成中非蛋白的AA成分通常是限制因素。如粘菌素的生物合成受-氨基丁酸和,-二氨基丁酸的限制；杆菌肽的生产受鸟氨酸的限制。,例4：乙酰CoA(Ac-CoA)缺少会限制四环素的生产。金色链霉菌低产菌株的特征是Ac-CoA倾向于走TCA循环而被

19、氧化；高产菌株没有这一倾向。(表现为ATP水平高)例5：诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei var polifungini)合成制霉菌素的能力的提高与其前体，丙二酸和甲基丙二酸合成的增加有关。,（3）添加前体的策略,外源前体在发酵液中的残留浓度过高，会使生产菌中毒，不利于抗生素的合成。但前体不足也不行。研究前体添加策略对有些抗生素高产稳产有重要意义。,举例：青霉素G生产需要加入苯乙酸或苯乙胺，发酵培养基中常用玉米浆的原因之一是这种原料含有苯乙胺。苯乙酸具有促进青霉素生物合成的作用，可在基础料中和过程中添加，其理论用量为0.47g苯乙酸/g青霉素G；0.50g苯乙酸/g青霉素

20、V。实际用量应考虑利用率。高产菌株对前体的利用率(可90)比低产菌株高许多。添加前体时宜少量多次或流加，控制发酵液中前体的残留浓度在适当范围。例如：苯乙胺浓度在0.050.08。,4.3 次级代谢物的生物合成原理,(1)把前体引入次级代谢物生物合成的专用途径,前体一旦合成，便流向次级代谢物生物合成的专用途径。前体聚合作用是次级代谢特有的、普遍的合成机制。通过前体聚合作用的次级代谢物有四环类、大环内酯类、安莎霉素类、真菌芳香化合物的聚酮类和肽类、聚醚和聚异戊二烯类抗生素。这些特有的生物合成中间产物需作后几步的结构修饰，修饰的深度取决于产生菌的生理条件。有些复杂抗生素是由来自不同生物合成途径的几个

21、部分组成的。,了解这方面所涉及的生物合成酶很重要，尤其是专用途径的第一个酶，因它决定了前体进入次级代谢物合成途径的通量、中间体的流向和途径的生产能力。,途径的其他关键酶也可能是控制步骤，这类酶常受碳、氮分解代谢物的阻遏以及磷和反馈调节。其中有些酶可能受胞内积累的高浓度前体的诱导。,次级代谢专用的关键酶通常受次级代谢物的控制：例1：麦角生物碱生物合成的第一个酶受Trp或其类似物的诱导作用。从生长期到生产期的过渡期间较高的Trp库存量导致DMAT合成酶的浓度增加。例2：苯恶嗪酮合成酶是放线菌素生物合成的关键酶，受葡萄糖分解代谢物阻遏。例3：磷酸阻遏灰色链霉菌的对氨基苯甲酸合成酶的形成。,通过前体单

22、体聚合的次级代谢物有：四环类、大环内酯类、安莎霉素(ansamycin)类、真菌芳香化合物的聚多酮类和肽类(包括同型、杂型和缩酚肽)抗生素，以及聚醚和聚异戊二烯类抗生素。这些聚合过程所涉及的生物合成机制对上述次级代谢物均适用。这说明这类合成酶具有共同的进化渊源。,(2)前体聚合作用过程,聚合反应是由高相对分子质量的合成酶催化的：,例如：肽类抗生素合成酶(NRPS,non-ribosomal peptide synthases)聚多酮合成酶(PKS,polyketide synthases),聚合后许多次级代谢物的化学结构通过多步酶反应修饰完成。,(3)次级代谢物结构的后几步修饰,例1：在四环类

23、抗生素生物合成中聚合的九酮化物中间体通过闭环转化为6-甲基四环化物，后者经几步转换，包括C-4的氧化，C-7的氯化(金霉素合成的情况下)，C-4的氨化，随后在氨基上的甲基化。,例2：红霉素生物合成的最后几步(即红霉内酯形成后)为连接两个脱氧糖，和这些糖的O-甲基，N-甲基或C-甲基化。,例3：头孢菌素生物合成的最后几步为去乙酰氧头孢菌素C(经闭环和扩环步骤产物)被羟基化为去乙酰头孢菌素C，后通过乙酰CoA(去乙酰头孢菌素C酰基转移酶以乙酰CoA作用乙酰基给体)转化为头孢菌素C。,某些次级代谢物是由单一类前体衍生的，例如，同型肽。许多次级代谢物由几类不同的前体合成的。例如，杂肽类抗生素是由氨基酸

24、和脂肪酸组装成的。,(4)复合抗生素中不同部分的装配,例1：在缩酚(depsi)肽抗生素中AA与羟酸连接。例如，缬氨霉素含有乳酸和D-羟异戊酸(图4-7)。,图4-7 缬氨霉素分子的排列,例2：链霉素、诺卡菌素A、杀假丝菌素和新生霉素是由几种不同前体组装的典型抗生素。,诺卡菌素：由L-高丝氨酸、修饰过的L-对羟苯甘氨酸、L-Ser和未经修饰的L-对羟苯甘氨酸组成。,次级代谢物合成酶往往只具有簇的专一性，即对基质分子的某一部分有要求，对分子的其他部分无绝对要求。,(5)次级代谢物合成酶的专一性,例如：产黄青霉的青霉素酰基转移酶能催化青霉素N的a-氨基己二酰侧链，使转化为疏水性的酰基侧链。此反应的

25、专一性较高，因它不能酰化7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)，但接受广泛的内源与外源酰基CoA衍生物。,参与初级代谢物和次级代谢物生物合成的基本差别之一在于引物和延长单位的异质性。例如：如由于缺少高度专一性，乙酰CoA、丙二酰CoA和丙二酰胺CoA可在四环类抗生素合成中作引物。大环内酯生物合成中的延长单位有丙二酸、甲基丙二酸和丁酸。,然而，不是所有参与次级代谢物合成的酶都缺乏基质专一性。有些具有高度专一性。例1：红霉素合成酶形成红霉内酯糖苷配基时只接受甲基丙二酰CoA作为延长单位，而不用丙二酰CoA单位。杀假丝菌素合成酶总是按既定的顺序聚合适当的前体单位。,通过基因操纵可以改变次级代谢物合成酶的专

26、一性。其突变株常能形成特殊的次级代谢物，形成新的终产物。,4.4 抗生素的生物合成,天然产物类别,天然产物,萜类,生物碱,辅酶因子,非核糖体多肽,脂肪酸衍生物与聚酮,聚酮和非核糖体肽化合物是复杂天然产物中的两大家族，分别由简单的羧酸和氨基酸单体构成，具有重要的医药和农用化学品的特性，其生物分子的结构极其复杂多样。虽然两者利用的底物不同，但他们的生物合成均是在一个大的多功能蛋白的控制下完成的，前者命名为PKS，后者命名为NRPS。两种复合酶均包含线性、连续重复的活性区域称之为模块，每个模块可催化多聚酮或多肽连的一轮延伸并进行适当的修饰，最后解链得到相应的产物。,非核糖体多肽合成酶(NRPS,no

27、n-ribosomal peptide synthases)聚酮合成酶(PKS,polyketide synthases),一、聚酮体生物合成途径,基于商业性的原因，迄今为止，一些具有聚酮体生物合成（polyketide synthases，PKSs）途径的“天然产物”，如红霉素、阿维菌素、泰乐菌素、柔红霉素、阿克拉霉素、西罗莫司和利福霉素等；,具PKS途径的抗生素,由7个丙酸单位按照与脂肪酸合成过程相似的机制形成:以丙酰CoA为引物，依次以甲基丙二酰 CoA 作为延伸单 位接上6个丙酸单位。,前体：活化丙酸单位；,大环内酯类：红霉素,结构：一大环内酯和两种糖，脱氧氨基己糖和红霉糖；,红霉素的

28、生物合成途径,红霉素产生菌的生物合成,参与红霉素生物合成的PKSs，或6脱氧红霉内酯合成酶（6-deoxyerythronolide B synthase，DEBS）有6个模块组成，每个模块负责合成聚酮体中的一部分。由于各模块之间的协调性，以及每个模块编码决定延伸单位的选择、功能和立体化学性质的催化结构域，因此，就有可能通过对PKSs结构域或模块的操作获得具有新颖结构的化合物。PKSs基因簇的大小在10100 kb左右不等。,PKS中的每一个模块的组成,酮基合成酶（ketosynthase，KS）酰基转移酶（acyl transferase，AT）酰基载体蛋白（acyl carrier pro

29、tein，ACP）这些域对于聚酮链的二碳单元的得加长是必需的。-酮基修饰酶：包括酮基还原酶（ketoreductase，KR）、脱氢酶（dehydrogenase，DH）和烯酰还原酶（enoylreductase，ER）大多数典型的聚酮体合成途径的产物包括对PKS产物的修饰，如将脱氧糖或氨基糖进行糖苷化以及通过细胞色素P450进行氧化。图中所示的LD为装载域（loading domains），TE为释放域，即硫酯酶（esterases）。,C,Monocistronic：单顺反子，一个启动子后仅具有一个编码序列。Polycistronic：多顺反子，若干个基因由一个启动子控制，转录在一条mRN

30、A上。,Organization of natamycin gene cluster,a tetraene macrolide antibiotic produced by S.natalensis,转录因子,原核生物转录,转录因子对靶基因启动子区域DNA序列的识别与结合是整个调控的核心。发现次级代谢途径特异性转录调控因子，深入研究其转录调控机理，是微生物生理与代谢、生化与遗传的核心关键问题之一。,纳他霉素,纳他霉素（natamycin），也称游链霉素或匹马霉素（pimaricin）是由纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）产生的一组多烯大环内酯类抗生素，其化学结构如图

31、。恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanovgensis）和褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）也能够产生该类混合物。,纳他霉素,纳他霉素能够专一性地抑制酵母和霉菌，阻止丝状真菌中黄曲霉毒素的形成。与其他抗真菌物质相比，纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低，可以广泛用于由真菌引起的疾病。除此之外，由于纳他霉素的溶解度低，可用其对食品表面的处理以增加食品的保质期，却不影响食品的风味和口感。因此，40多年来食品行业对它的兴趣不减。纳他霉素作为一种天然的食品防腐剂已被批准用于某些乳制品、肉类、水果和饮料等许多食品工业中。目前，已成为世界30多个国家广泛使用

32、的一种天然食品防腐剂和抗菌添加剂，美国FDA于1982年批准纳他霉素可作为食品防腐剂，我国于1997批准作为食品防腐剂。,纳他霉素,纳他霉素之所以被广泛用于食品工业，主要是具有四个特点：1）剂量低，效率高，抑菌作用比山梨酸强50倍左右；2）适用pH范围广，而一般适用的山梨酸的防腐效果随pH的升高而降低；3）无特殊感官形状；4）抑制有害真菌而不影响有益菌群。,二、非核糖体多肽生物合成途径,非核糖体生物合成（non-ribosomal peptide synthases，NRPS）途径的“天然产物”，如青霉素、头孢菌素、多粘菌素、放线菌素、纳塔霉素和短杆菌肽S等；,不用蛋白质合成所用的转录翻译机构

33、，故无需核糖体、tRNA和mRNA,青霉素的合成机制青霉素、头孢霉素C合成的前体物质有半胱氨酸（cys)、缬氨酸(val)、-氨基己二酸及苯乙酸等。3个前体氨基酸由葡萄糖转化而成，首先，在三肽合成酶（ACVS）的作用下，将它们缩合成三肽（LLD-ACV），然后，由异青霉素N合成酶（IPNS）催化LLD-ACV氧化闭环（环化），生成异青霉素N（IPN），再与活化的侧链前体苯乙酰CoA或苯氧乙酰CoA将IPN转化成青霉素G或青霉素V（转酰基）。,L-氨基己二酸,L-半胱氨酸,L-缬氨酸,青霉素生物合成前体,（LLDACV）,（异青霉素N）,（青霉素G）,三肽合成酶,异青霉素N合成酶,异青霉素N酰基

34、转移酶 酰基辅酶A、苯乙酸,青霉素的生物合成途径,NRPS中的每一个模块的组成,腺苷酰化(adenylation,A)缩合(condensation,C)肽基结合蛋白(peptidyl carrier protein,PCP)，又称硫化域(thiolation,T)这些域共同作用于氨基酸使其添加到延伸的寡肽上。3个修饰结构域：差向异构化结构域(Epimerization,E)，N-甲基化结构域(N-methylation,M)、氧化结构域(Oxidation)。PKS中模块的顺序决定了编码的结构，模块的数量决定加入的二碳单元的数量(或模块的链长度)。NRPS与PKSs基因簇相似，其模块的顺序、

35、特性和数量分别决定了氨基酸寡肽的性质和长短。,Chloroeremomycin（氯伊瑞霉素，万古霉素类似物）生物合成,乳链球菌素,乳链球菌素（nisin）也称乳链菌肽，是某些乳酸链球菌产生的一种多肽化合物，由34个氨基酸组成，其化学结构如图2316所示。乳链球菌素在英国已经有近50年的使用历史，全世界有50多个国家正在使用。,乳链球菌素的化学结构,乳链球菌素,乳链球菌素能有效地抑制引起食品腐败的许多革兰阳性菌（如肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、溶血链球菌和利斯特菌）的生长和繁殖，尤其对产生孢子的革兰阳性菌（如枯草芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌）等有很强的抑制作用。广泛被用于乳制品、罐装食品、植物蛋白食品

36、，以及肉制品的防腐和保鲜。在添加乳链球菌素的食品中，可以降低灭菌温度和缩短灭菌时间，以及改善食品的品质和降低能耗。我国于1990年批准用于食品添加剂。,万古霉素的生物合成,另据研究，天然的万古霉素生物合成共有35步，其先以五种自由的氨基酸单体合成一线形的七肽，然后芳基边链在交联酶的催化下适时地组合、交联，形成复杂的七肽骨架，最后UDP-glucose和UDP-4-epi-vancosamine在糖基转移酶的作用下连接到七肽骨架上。,万古霉素生物合成的五种起始自由氨基酸单体,万古霉素生物合成的逆向合成分析图,以经修饰的糖为前体的抗生素链霉素的合成为例,分子中带有经修饰的糖的抗生素主要有：氨基糖苷

37、类、大环内酯类和蒽环类抗生素。链霉素属于氨基糖苷类抗生素。生产菌灰色链霉菌,链霉素的合成,链霉素由N-甲基-L葡萄糖胺、链霉糖和链霉胍三个部分组成。此三种糖均由葡萄糖衍生而来。转脒基酶和链霉胍激酶是参与链霉素合成的两个关键酶。开始合成的时间生产期。链霉素分子的连接：dTDP-双氢链霉糖与链霉胍-6-P形成拟二糖，拟二糖再与N-甲基-L葡萄糖胺合成双氢链霉素-6-P，再经两步氧化、水解生成链霉素。,链霉素生物合成的假设途径,调节,碳源的调节cAMP的调节作用磷酸盐的调节作用A因子,什么是A因子：,2-S-异辛酰基-3-R-羟甲基-丁酸内酯是链霉菌产生的一种生理代谢自调节物质-丁酮内酯的一种。-丁

38、酮内酯具有调节次级代谢物与气生菌丝与孢子形成的作用，类似真核生物的激素。已分离出11种-丁酮内酯自调节物质。A因子能促进链霉素的合成，所有生产用菌株都能产生A因子。A因子参与菌丝的分化作用，孢子形成及菌株对自身链霉素的抗性与此有关。,The A-factor regulatory cascade of Streptomyces griseus,作用机制：是一种级联调控方式。,生长期，A因子水平低，与其受体蛋白ArpA结合，但不能使其从启动子处解离，关键基因adpA处于关闭状态。AdpA编码一种次级代谢物或气生菌丝形成的必需的转录聚合物。随A因子浓度增加到一定值，ArpA从DNA上解离，adpA

39、的转录启动。受adpA基因产物的激活，专一性链霉素合成基因strR被表达，其基因产物继续激活链霉素合成的所有基因的转录。,根据微生物药物的生物合成原理发现微生物新药的方法和途径,通过非基因定向改变、基因定向改变，以及组合生物催化的技术，或是改变原有微生物药物的生物合成途径，或是对原有的微生物药物（或先导化合物和中间体）进行生物催化，以发现微生物新药。,已有的研究表明，在抗生素等次级代谢产物生物合成中酶底物的特异性足以使结构相关的代谢产物在其发酵液中积累；但由于生物合成酶的底物专一性较低（宽泛性），其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程中添加一些已知结构类似物作为前体物质，可以产生含有与这种已知结构

40、类似的新衍生物；这种获得新次级代谢产物的途径，可以被称之为非遗传操作的定向生物合成(directed biosynthesis)。,定向生物合成,应用实例,应用非遗传操作定向生物合成的方法能够制备获得许多新的抗生素，其中目前已进行工业化生产的有：青霉素G和V；培罗霉素；四环素和金霉素等。,青霉素和6APA分子结构及各种天然青霉素的结构与名称,青霉素分子的化学结构,6APA的化学结构,各种天然青霉素具有的侧链和名称,四环类抗生素的定向生物合成,微生物发酵产生的一些四环素类抗生素,四环类抗生素的定向生物合成,在生产金霉素时需添加氯化物作为前体，而当生产四环素时，则必须要在发酵培养基中添加氯离子抑制

41、剂，如溴化物或M-促进剂等，从而抑制金霉素的合成而得到四环素产物。另外，用金色链霉菌在发酵的金霉素过程中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺胺嘧啶钠，能够获得去甲基金霉素。,突变生物合成,突变生物合成（mutational biosynthesis）是指野生型产生菌经化学或物理等因素诱变处理后，丧失合成原来次级代谢产物的能力而成为阻断突变株，然后在发酵培养阻断突变株时添加某种外源物质，参与生物合成以获得新的次级代谢产物的过程。另外，突变生物合成也包括由于突变而引起产生新的次级代谢产物。,突变生物合成与微生物新药发现,.,突变生物合成原理 阻断突变株的类型,营养缺陷型突变株(auxotroph)：由于

42、编码菌体生长之必须的酶的基因发生了突变，而使菌体不能生长，导致不能合成次级代谢产物。因此，这类突变株也可以称为初级代谢阻断突变株。独需型突变株(idiotroph)：这种突变株的生长和初级代谢正常，但由于编码次级代谢产物合成的某一基因发生突变，而使丧失了合成次级代谢产物的能力。这是突变生物合成所需要的突变株。双重阻断突变株：即突变既发生在编码初级代谢酶的基因上，也发生在编码次级代谢酶的基因上。,红霉素生物合成途径,.,突变生物合成产生的新抗生素,.,4.5 微生物次级代谢的调控,The regulation of antibiotic production is complex(P205),次

43、级代谢产物的诱导调节次级代谢产物碳源分解调节次级代谢产物氮源分解调节磷酸盐调节抗生素生物合成启动的控制抗生素生物合成的终止,1.两种可能的诱导机制诱导物刺激影响初级代谢，造成代谢流的改变大量生成次级代谢物诱导物次级代谢物合成酶的合成大量生产次生代谢物2.实例色氨酸对麦角碱的作用甲硫(蛋)氨酸能提高头孢霉素C的产量的诱导剂3.大多数分解代谢酶属于诱导酶，可以通过加入诱导物使酶的产量提高。,3.1 次级代谢产物的诱导调节,The A-factor regulatory cascade of Streptomyces griseus,A-factor is detectable in the cul

44、ture medium just before the onset of streptomycin production.The signal(s)(?)that trigger its synthesis,mediated in some manner by AfsA,are not known.,1.涉及对终产物阻遏实例1：20世纪40年代初期发现，青霉素发酵过程中，虽然葡萄糖被菌体利用最快，但葡萄糖不利于青霉素合成，而乳糖虽利用缓慢，但能提高青霉素产量。实例2：头孢霉素C的生物合成中，抗生素比产率递减顺序为：蔗糖半乳糖果糖麦芽糖葡萄糖，其中蔗糖是葡萄糖的两倍多。不同的碳源对次级代谢产物积

45、累的作用是不一样的，一般认为速效碳源都比较差。,3.2 次级代谢产物碳源分解调节,2.抗生素受碳源分解调节的可能机制(1)可能与菌体生长速率控制抗生素合成有关。菌体生长最好的碳源能抑制抗生素合成，因此，在低生长率的情况下(例如青霉素合成中缓慢补加葡萄糖)可减少葡萄糖的干扰作用。(2)可能与分解代谢产物的堆积浓度有关。乳糖之所以比葡萄糖优越，是因为前者被水解为可利用单糖的速度正好符合青霉素在生产期合成抗生素的需要，而不会有分解代谢产物如丙酮酸的堆积。,1.定义：氮源分解调节主要指含氮底物的酶(如蛋白酶、硝酸还原酶、酰胺酶、组氨酸酶和脲酶)的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。,3.3 次级代谢

46、产物氮源分解调节,(1）pH值质子梯度 改变能量代谢 细胞壁物质和 结构的功能；(2)谷氨酰合成酶和丙氨脱氢酶的合成；(3)高度磷酸化的核苷，如ppGpp和pppGpp可能通过级联机制调节次级代谢，而ppGpp等受氨基酸过量的负控制调节。,2.氮源分解调节的可能机制：,已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多烯大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。所以，在工业生产中，磷酸盐常常被控制在适合菌体生长的浓度以下，即所谓的亚适量。,3.4 磷酸盐调节,磷酸盐是一些次级代谢的限制因素，高浓度磷酸盐表现出较强的抑制作用。,磷酸盐浓度高低还能调节发酵合成期出现的早晚，磷酸盐接近耗尽后，才开始进入

47、合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。例：金霉素、万古霉素等的发酵都有此现象。磷酸盐还能使处于非生长状态的、产抗生素的菌体逆转成生长状态的、不产抗生素的菌体。,磷酸盐调节抗生素的生物合成的机制按效应来说，有直接作用和间接效应；磷酸盐影响抗生素生物合成中的磷酸酯酶和前体形成中某种酶的活性（直接作用）；磷酸盐调节胞内其它效应剂（如ATP、腺苷酸能量负荷和cAMP），进而影响抗生素合成（间接作用）,3.5 次级代谢过程的启动的原因,可能是生长期末细胞的酶的组成发生变化，与次级代谢物合成有关的酶的突然出现有关；也可能是前体的积累，起诱导物的作用或编码次级代谢产物的基因从分解代谢物阻遏

48、中解除阻遏所致。,启动抗生素的几种调控机制,尽管抗生素具有非常重要的社会和经济重要性，但并不存在一个能够解释它们生理调节的通用的控制模型。此类调节往往发生在转录水平，具体证据为：直到生长速率下降时，才出现编码抗生素合成的mRNA。,次级代谢物启动的假想机制,比生长速率（）下降限制性养分的耗竭几种调节因子的联合作用（cAMP,碳源，氮源，或磷源的同化速率)严谨响应(stringent response)微生物信号因子,碳源，氮源为限制性基质时，抗生素生产动力学,碳源为限制性基质时，指数生长期出现较早，抗生素合成较氮源限制的要晚。碳源限制时，比生产速率高峰出现在比生长速率高峰之后。氮源为限制性基质

49、时，上述两个峰是同步出现的。,生长速率下降对大分子合成速率的影响,碳源限制的培养的指数期，蛋白质合成速率达最大后，很快下降，当蛋白质合成速率下降到检测不到时，抗生素合成启动。氮源限制的培养，蛋白质合成速率始终很低，当下降到0.49mg protein/mg.h时，抗生素合成启动。,空载tRNA与抗生素合成的诱导,严谨响应的relC基因产物ppGpp是导致抗生素合成的因素relC编码核糖体蛋白L111986年，Ochi等人发现，在淡紫灰色链霉菌中随着氨基酸饥饿诱发的ppGpp的积累，间型霉素（Formycin）的产量提高了近8倍.,空载tRNA与抗生素合成的诱导,ppGpp水平的上升本身，并不能

50、启动抗生素的合成。空载tRNA浓度的上升可以刺激抗生素的生产，可以绕过直接包含ppGpp的机制。链霉素加入的效果与此结论一致。（抑制了核糖体的功能）ppGpp实际上只是空载tRNA浓度上升引起的结果。空载tRNA上升与抗生素合成基因激活的关系有待进一步阐明。,空载tRNA与抗生素合成的诱导,氨酰tRNA与空载tRNA的比率下降到最低值时，抗生素合成开始。研究表明，在指数期早期，加入亚致死量蛋白质抑制剂，使氨酰tRNA与空载tRNA比率上升，导致抗生素合成推迟。,3.6 抗生素生物合成的终止,抗生素生产周期取决于产生菌的遗传特性和环境条件。在抗生素合成酶形成后抗生素生物合成的速率在一段时间直线上