微生物的遗传与变异.ppt

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1、第八章 微生物的遗传与变异,第一节 遗传的物质基础及其特性第二节 微生物的遗传物质 第三节 细菌的基因转移和重组第四节 微生物的诱变育种和遗传工程,一、遗传物质的鉴定二、基因组DNA和染色体三、染色体以外的遗传因子,第一节 遗传变异的物质基础,一、遗传物质的鉴定,证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验,1928年英国人Griffith发现转化的现象1944年very 等人证实是遗传物质1953年美国人利用噬菌体证实DNA是遗传物质 3 1956美国人H.Fraenkel-Conrat植物病毒的重建实验证实是遗传物质,有 荚 膜菌落光滑分泌毒素致 病,无 荚 膜菌落粗糙无 毒不 致 病,SSS三个

2、血清型,RRR三个血清型,实验材料：肺炎双球菌,转化实验,转化实验（1）动物实验,结论：加热杀死的型细菌，在其细胞内可能存在一种具有遗传转化能力的物质，它能以某种方式进入型细胞，并使型细菌获得表达型荚膜性状的遗传特性,转化实验（2）细菌培养实验,转化实验（3）S型菌无细胞抽提液试验,Cncnc-micro,以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。,噬菌体感染实验,步骤,1：用含同位素35,P32的培养基培养大肠杆菌,2：让T2感染上述大肠杆菌使其打是S35P32标记 3:让标记的

3、T2感染没有标记的大肠杆菌,A.D.Hershey和M.Chase，1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,说明进入细胞的是DNA，是遗传物质,沉淀中含25%放射性,以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含75%放射性,DNA,说明进入细胞的是DNA，是遗传物质,植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.,植物病毒的重建实验,原始株 拆开 重建 感染 分离纯化,植物病毒的重建实验,结论,细胞生物的遗传物质是DNA或,朊病毒的发

4、现和思考,朊病毒含有微量的核酸，仍未发现？朊病毒仅由蛋白质构成朊病毒的遗传物质为蛋白质？,亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为 发现该蛋白内含有核酸。,其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠状态为PrP sc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。,人的库鲁病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease,CJD)等,羊搔痒症(scrapie),牛海绵状脑病(spongiform encephalopathy),引起人与动物的致死性中枢神经系统疾病,基因是一段DNA,第二节 微生物的遗传物质,DNA就是脱氧核糖核酸（长链）,腺嘌呤

5、（A）,鸟嘌呤（G）,胸腺嘧啶（T）,胞嘧啶（C）,基因测序就是读出 A-C-G-T-G-G-A-C-G.,基因控制Pr因而控制性状,基因是什么？,Cncnc-micro,基因是生命的密码。基因记录和传递遗传信息。基因决定生物体的生长、病、老死等一切生命现象。,基因组（genome）：一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称,真核生物和原核生物的遗传物质,细胞质基因2um质粒F因子R因子Col质粒毒性质粒降解性质粒,遗传物质类型,核染色体核外染色体(质粒),真核生物细胞核原核生物核区真核生物的原核生物的,线粒体叶绿体,与组蛋白相结合,真核生物的核DNA,核小体是染色体的基本结构单

6、位，由DNA和组蛋白(histone)构成，由4种组蛋白H2A、H2B、H3和H4，每一种组蛋白各二个分子，形成一个组蛋白八聚体，约200 bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体,染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；,链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白蛋白质,原核生物的染色体,性质：质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的存在方式：游离态或附加体重组：质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。功能：进行细胞间接合并带有

7、一些基因，如产生毒素、抗药性、降解功能等。,一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,原核生物的质粒,在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。,类型：严紧型 松弛型,质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应,致育因子（Fertility factor，F因子）抗性因子（Resistance factor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（Metabolic plasmid）,质粒的主要类型,1、致育因子(Ferti

8、lity factor，F因子),又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。,携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。,质粒的常见类型,存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、等细菌中，决定性别。,2、抗性因子（Resistance factor，R因子）,包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。,抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,质粒的主要类型,抗性转移因子,抗性决定子,R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（mercuric ion，mer）四环

9、素（tetracycline，tet）链霉素(Streptomycin,Str)、磺胺(Sulfonamide,Su)、氯霉素(Chlorampenicol,Cm)夫西地酸（fusidic acid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。,3、Col的质粒（Col plasmid）,大肠杆菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。,质粒的主要类型,编码大肠杆菌（E.coli）产生的大杆菌素为（colicins），的质粒。,产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。,4、毒性质粒（virulence plasmid）,许多致病

10、菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。,苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒,根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子,质粒的主要类型,5、代谢质粒（Metabolic plasmid）,质粒上携带有分解多种特殊有机化合物能力的因子。,将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。,假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药(2,4dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟脑等的能力。,质粒的主要类型,第三节细菌的基因转移和重组

11、,接合转化转导原生质体融合,野生型：从自然界中分离到的没有发生任何突变的微生物。能在基本培养基中生长，如以A和B两个基因表示这两种物质的合成能力。遗传型A+B+突变型：野生型突变之后，丧失了合成某物质的能力。不能在基本培养基上生长，只能生长在完全培养基上，如以A和B两个基因表示其丧失这两种物质的合成能力。遗传型A-B-,根据微生物对生长因子的需要存在差异，可分为：,所含的营养物质能满足一般微生物生长繁殖所需的氮源、碳源和无机盐等。(基础培养基),（一）接合（conjugation）,通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子conjugant研究方法：1946年J.Lederberg等采用E.c

12、oli的两株营养缺陷型进行实验，为以后的微生物遗传学提供了必要的条件。,定义：通过细胞间的直接接触能进行大段的转移的过程，叫接合,1946年用E.coli的两个营养缺陷型所作的实验：,1、接合及其发现,A,B,供体菌 受体菌,F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛（sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。,接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导,含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛,不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛,2.机制,接合的具体过程,F因子的四种细胞形式,a）F-菌株，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作

13、用接收 F因子而变成雄性菌株（F+）；,b）F+菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。,c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。,d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因 子。细胞表面同样有性菌毛。,F菌株 和F因子,可逆的,F+（“雄性”）菌株与F 相接触时，可通过性菌毛将F因子转移到F 细胞中，使之也变成F+菌株。F因子以很高的频率传递，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般并不被转移。,接合的几种杂交结果,1 F+F,2 Hfr F,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移

14、过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。该菌株与F 接合后的重组频率比F+菌株高几百倍而得名,Hfr(high frequency recombination)高频重组菌株,1.Hfr染色体双链中的一条单链在F因子处发生断裂，F因子位于环状单链DNA的两端，F因子的头先进入受体细胞，然后是细菌核染色体组，只有细菌核染色体组完全进入受体细胞之后，F因子的尾才能进入受体菌细胞，完成DNA的传递。在没有外界干扰的情况下，全部转移过程的完成需要约120分钟。2.由于种种原因DNA转移过程常会发生中断，所以越是前端的基因进入F 细胞的机会越大。F因子位于线

15、状DNA的末端，进入受体细胞的机会最小，故这种接合引起转性的频率最低，但可以出现各种重组子。,接合过程:,接合中断试验与染色体图：,接合中断试验：由Wollman和Jacob首创（1955），首先认识了原核微生物染色体的环状特性。原理：接合试验的DNA转移过程存在着严格的顺序性，在接合进行中采用定时人为中断的方法，可以获得呈现不同数量 Hfr 性状的 F 接合子，最后，根据F中出现Hfr菌株中各种形状的时间顺序（分钟），可以绘出较为完整的环状染色体图（chromosome map）。,a,b,c,d,e,利用HfrF-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体

16、细菌基因型，以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。,3 F F-,F+F,FF-与F+F-的不同：给体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞,R型活菌+S型死菌 S型活菌定义：受体菌直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。有关名词：受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者供体菌：donor，转化基因的提供者转化因子：来自供体菌的DNA片段转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色体组的重组子,（二）转化（transformation）,1、转化及其发

17、现：,受体细胞要处于感受态.感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态.只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，从出现到消失约为分钟(对数期的中期),2、转化发生的条件：,感觉态出现原因,细菌失去部分细胞壁的结果细菌在细胞表面产生某种酶引起,感受态的决定因素,细胞遗传性决定和菌龄有关环腺苷酸CAMP可提高10000 倍Ca2+能促使细胞进入感受态,感受态因子,是受体细胞表面上的一种蛋白质功能使转化因子结合在受体细胞表面,供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1 107 D 左右 菌株间的亲缘关系密切,降解,吸附,切割成45106,单链入胞

18、,同源部分配对、整合,复制分裂，只有一个子代DNA分子获得供体基因,感受态细胞的建立DNA的结合和摄取转化子和染色体重组,3转化的过程,转化的机理,1 外源DNA在DNA结合蛋白的帮助下与受体细胞相结合2外源DNA被感受态细胞膜上的核酸酶降解成小分子DNA,并进一步降解小分子DNA的其中的一条链3 没有被降解的DNA与感受态细胞上的感受态特异蛋白的作用下,进入受体细胞内4 整合,转化中基因交换过程示意图,4 转化的特点,不需两个细胞直接接触，供体DNA提取出来，注入受体即可。,5、转化的类型：,根据感受态建立的方式，可以分为：自然遗传转化natural genetic transformati

19、on人工转化artificial transformation,能发生转化作用的菌属主要有：嗜血杆菌属、奈瑟氏球菌属、假单胞菌中多见。在放线菌和蓝细菌以及粗糙脉胞菌和黑曲霉两个菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。,自然转化的普遍性：,人工转化,人工转化是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人工地将DNA导入细胞内。方法：CaCl2处理细胞，使其成为能摄取外源DNA的感受态状态.电穿孔法electroporation：用高压脉冲电流击破细胞膜，或击成小孔，使各种大分子（包括DNA）能通过这些小孔进入细胞。,冰浴10min,三.转导（transducti

20、on）,定义：以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。,混合培养,A,J.Lederberg等（1952）在Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）中发现的。,1.转导及其发现,色氨酸缺陷型,色氨酸野生型,2.转导的种类,完全普遍转导 普遍转导 流产普遍转导 转导 低频转导 局限转导 高频转导,2.1 普遍性转导（generalized transduction）,定义：通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转

21、导现象，称为普遍性转导。1952年发现，在Salmonella typhimurium中存在转导现象。：以其野生型菌株作为供体菌营养缺陷型菌株作为受体菌P22噬菌体作为转导媒介，对供体菌是烈性噬菌体，对受体菌是温和噬菌体,流产转导,完全普遍性转导,没有形成转导子,普遍转导的过程,1 噬菌体浸染供体菌2噬菌体发生增殖,同时把供体菌的部分DNA降解成许多小片段3 包装,发生错误包装(噬菌体中的DNA全是供体菌的DNA,完全缺陷型)4完全缺陷型侵染受体菌,将供体菌的基因整合进受体菌,2.2 局限性转导,特点：噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的

22、基因）缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率（约10 5）“误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体）分类：低频转导与高频转导,定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。,部分缺陷的噬菌体,前噬菌体,脱落,复制,部分缺陷的噬菌体,局限性低频转导的过程,低频转导（LFT）裂解物的形成,局限性转导的机制-”杂种形成模型”,在转导中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的（10 6）。用LFT裂解物感染宿主，可获得极少量的局限转导子，即低频转导。特点:诱导的一般都是溶源菌(供

23、体菌),低频转导（LFT，low frequency transduction）,特点:诱导的是双重溶源菌与dgal(含有供体菌gal基因的部分缺陷噬菌体)同时整合在一个受体菌的核染色体组上,成为一个双重溶源菌（double lysogen）。当被紫外线等诱导时,正常噬菌体的基因可补偿dgal缺失的部分基因功能,两种噬菌体就同时获得复制的机会.所以在双重溶源菌中的正常噬菌体被称为助体（或辅助）噬菌体（helper phage）双重溶源菌的裂解物中含有等量的和dgal粒子,称为HFT（高频转导）裂解物。,高频转导（HFT，high frequency transduction）,部分缺陷的噬菌体

24、,前噬菌体,脱落,复制,部分缺陷的噬菌体,局限性低频转导的过程,双重溶源菌:含 噬菌体和dgal部分缺陷体,含有供体gal+基因,噬菌体正常脱落,裂解,释放,形成噬菌斑,转导子,双重容源菌【E.coliK12(/dg)】,转导噬菌体（dg）+辅助噬菌体（）,转导子菌落,噬菌斑,U.V.,附,普遍性转导和局限性转导的比较,Conjugation,Transformation,Transduction,原生质体融合（protoplast fusion）,概念：将双亲株的微生物细胞分别通过酶解去壁，形成原生质体，然后在高渗条件下混合，并加入物理的、化学的或生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互

25、凝集和融合的过程,可以提高重组率 可进行多亲本融合 有利于不同种间、属间微生物的杂交 通过原生质体融合提高产量,原生质体融合的优点：,原生质体融合技术的理论与应用价值,打破了微生物的种属界限，可以实现远缘菌株的基因重组 用于改良菌种特性、提高目的产物的产量、使菌种获得新的性状、合成新的产物等 可用来探索重大理论问题，研究外源DNA转化、质粒转移以及核与核、核与质之间的关系,原生质体融合技术及育种步骤,原生质体的制备原生质体再生 原生质体融合融合子的检出与鉴定,原生质体融合操作示意图,去壁 A+B-（高渗下）A+B-PEG或电脉冲 离心促融 去壁 A-B+（高渗下）A-B+融合子（AA,BB,A

26、B）长成菌落-检出A+B+融合子 筛选优良性状的融合子,甲乙,有性生殖异核现象准性生殖,二、真核微生物的基因重组,一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，都能采用有性杂交方法进行育种。,（一）有性杂交,质配,核配,先有丝分裂再减数分裂,子囊孢子的繁殖,（二）异核现象,概念：在一些真菌菌丝体的菌丝细胞内存在一个以上不同遗传型细胞核的现象原因：基因突变或不同遗传型菌丝之间的联合，导致细胞质或细胞核转移,(三）准性生殖,准性生殖的概念：,不产生有性孢子的丝状真菌，不经过减数分裂就能导致染色体单元化和基因重组的过程。1953年发现,准性生

27、殖与有性生殖的不同,重组体细胞和营养体细胞相同，不产生特殊的囊器染色体的交换及单倍体化过程没有规律,准性生殖的过程,异核体的形成核融合和杂合二倍体的形成单倍体化,菌丝联结 异核体形成（质配）核配形成杂合二倍体体细胞交换和单倍体化。,体细胞交换和单倍体化,杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离导致个别染色体减半，直到最后形成单倍体的过程，而产生具有新性状的单倍体杂合子,A,B,A+B,（同核体）,（异核体）,A,A,B,B,AB,A,A,B,B,（杂合二倍体）,单倍体杂合子,突变（mutation）：指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。染色体畸变细胞

28、学上可以看到染色体的变化突变 基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化野生型（wild type）：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株,第五节 微 生 物 的 突 变,(一)几个概念,定义：每个细胞在每一世代中发生突变的几率。突变率为108是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2108个细胞时，如果发生一次突变的突变率也是108。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数,（二）突变率,（三）突变的特点,

29、适用于整个生物界,以细菌的抗药性为例子不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性：突变率低且稳定,一般为10-6-10-9。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性：诱变剂可提高突变率。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation），突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（back mutation或reverse mutation）。,（四）基因突变的自发性和不对应性的证明,在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争

30、论十分激烈。一种观点认为：突变是通过适应而发生的，(比如某种细菌从对药物敏感到产生抗性是由于药物长期作用的结果)突变的原因和突变的性状间是相对应的。另一种看法则认为：基因突变是自发的，且与环境是不相对的。,证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！,如何证明基因突变的非对应性？,三个经典实验,变量实验、涂布实验、影印实验,实验证据,(在同一个大管中作整体培养),3 7 1 4 4 3 5,抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数,变量试验,甲管,乙管,突变发生在接触噬菌体之前，因为突变率极低，先分散后培养，在培养中发生突变的时间不同，突变细胞繁殖的代数也不同各皿的突变细胞数量就有很大差异了；而先培

31、养后分散，突变细胞繁殖的后代均匀突变发生在接触噬菌体之后则无论先分散还是后分散，突变的频率都应相同，平板上的抗性菌落数目应基本一致；,2 涂布试验,接触噬菌体之前,抗性突变已经出现并分裂数次,重新涂布会把它们分散开各自成菌落.说明抗性突变是发生在未接触噬菌体之前的,涂布试验,平板影印培养法,使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的培养方法,影印培养试验,(五)自发突变,定义:微生物自然发生的突变,一般发生频率为10-9-10-6,引发原因:DNA复制微生物自身产生诱变物质环境对微生物的诱变作用,应用:1从生产中选育优良突变菌株2定向育种优良品种:在某一特定条件下,长期培养某一微生物菌群，通过

32、不断转接传代以积累其自发突变,并最终获得优良菌株的过程举例：卡介苗特点:由于自发突变率低,缓慢,(六)诱发突变,定义:通过诱变剂的诱导作用来加快突变的过程诱变剂:,物理诱变剂：紫外线,激光；X射线,射线和快中子等。化学诱变剂：主要有烷化剂,碱基类似物和丫啶类化合物。由于一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNA，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起突变。,紫外线诱变作用机理,可使链裂断，破坏核糖和磷酸间的键联引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂能使胸腺嘧啶成二聚体，使结构发生改变,光复活作用 把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用,由DNA

33、光解酶(photolyase)完成：此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。,光修复,在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射及处理照射后的菌液。,化学诱变剂,亚硝酸,碱基的置 换,碱基类似物：5-溴尿嘧啶（胸腺嘧啶结构类似物）、2-氨基嘌呤（腺嘌呤类似物）在DNA复制过程中能够整合进DNA分子，因此产生异构体频率高，出现碱基错配频率也高，从而提高突变频率。,5溴尿嘧啶（酮式）,5溴尿嘧啶（烯醇式）,间接引

34、起置换的诱变剂,碱基的置 换,碱基的置换,移码突变,DNA分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起,造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误,增添一个碱基,缺少一个碱基,诱变剂与致癌物质的检测 Ames试验,a）利用各种诱变剂获得各类遗传突变，进行诱变育种；,）危害人类自身的健康,如致癌等,很多种化学物质，能以各种机制导致DNA的突变,b,人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良后果。化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比,发明人:美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为

35、Ames试验,回复突变(reverse mutation或back mutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，第二次突变称为回复突变,Ames试验,Ames试验方法原理：鼠伤寒沙门氏菌的突变型（his-）菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型（表现），因而在无组氨酸培养基上也能生长。his-his+故可根据菌落形成数量，检查受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统多用鼠肝匀浆液,The Ames Test fo

36、r Chemical Carcinogens,具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率,对照实验,检测实验,利用回变检测致癌剂 艾姆斯试验法,培养基中含有微量的组氨酸，经培养后，如在平板上无大量菌落产生，说明试样中不含诱变剂；如在纸片生长大量菌落，说明诱变剂具有致突变作用,突变株的表型,选择性突变株,非选择性突变株,营养缺陷型（株）抗性缺陷型（株）条件致死突变型（株）,形态突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）,按方法分：按突变株的表型是否能在选择性培养基上加以鉴别来区分。,七 突变株的类型,按是否比较容易、迅

37、速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株（selective mutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。,形态突变型营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而

38、在另一条件下却无法生长繁殖的突变型,诱变育种:是用诱变剂使微生物的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，进一步引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的育种方法。,诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,第六节微生物遗传变异的应用,一诱变育种,效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1 单位,从 青 霉 素 产 量 看 诱 变 育 种,诱变育种的基本过程：,选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验,出发菌株用来育种处理的起始菌株出发菌株应具备：对诱变剂的敏感性高；具有特定生产性状的

39、能力或潜力；出发菌株的来源；自然界直接分离到的野生型菌株：历经生产考验的菌株：已经历多次育种处理的菌株：,1.出发菌株的选择：,(一)基本原则和过程,2 处理单孢子（或单细胞）悬液,芽孢杆菌应处理芽孢放线菌，霉菌应处理孢子细菌指数期，放线菌霉菌要稍加萌发后使用出发菌株应制成均匀悬夜,3.诱变处理：诱变剂的选择：提高突变的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变移动诱变剂量的选择：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。诱变剂的致死率是30%-80%,选用最适剂量,剂量以诱变剂浓度和处理时间

40、来表示,合适剂量：凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。,经培养后，出现三种情况：如在平板上无大量菌落产生，说明试样中不含诱变剂；如在纸片周围有一抑制圈，其外才是大量菌落，说明试样中某诱变剂的浓度很高；如在纸片周围即生长大量菌落，说明诱变剂的浓度合适。,4.菌种筛选,筛选方案：为了提高筛选效率，将筛选工作分为初筛和复筛两步。初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为

41、主，应精确测定每个菌株的生产指标。,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.,诱变育种的基本环节,Cncnc-micro,以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：,突变株的筛选方法,高产突变菌株的筛选方法,抗性突变体的筛选方法,营养缺陷型的的筛选方法,Cncnc-micro,与突变株的筛选相关的几个概念,与突变株的筛选相关的几个概念,相关培养基,基本培养基-,完全培养基,补充培养基,三类遗传型,野生型 A+B+,营养缺陷型型A+B-,原养型 A+B+,高产突变株的筛选,琼脂块培养法筛选 春日霉素高产菌种,抗性突变体的筛选方法,青霉素浓缩法,梯度培养皿法,青霉素浓缩法,梯度培养皿法,含异烟

42、肼,接敏感菌含突变株,营养缺陷型的筛选办法,中间培养,淘汰野生型,检出缺陷型,夹层培养法,限量补充培养法,影印接种法,鉴定缺陷型,菌丝过滤法,菌丝过滤法筛选营养突变株,夹层培养法及结果,逐个检出法,影印接种法,限量补充培养法,微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株,1.衰退（degeneration）：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。2 衰退的原因：基因突变，环境条件。3 常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能

43、力下降；,第六节 菌种的衰退、复壮及保藏,一、菌种的衰退,1 定义:使衰退的菌种恢复原来优良性状指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的进行纯种的分离和生产性能测定工作，使菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种的过程2 菌种的复壮措施：1纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法）。2淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。3 用有效的菌种保藏方法。,二 菌种的复壮（rejuvenation）：,1 目的存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种2.原则：,三、菌种保藏：,挑选典型菌种的优

44、良纯种 一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）创造适于微生物长时期休眠的环境条件（如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸碱中和剂等）3 原理：低温、干燥、缺氧,斜面保藏法方法：菌种管置4冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。液体石蜡油覆盖保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。,载体保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。,4.菌种保藏的方法,冷冻干燥保藏法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。液氮超低温保藏法

45、将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,微生物是遗传学研究的最好材料和对象,微生物结构简单营养体一般都是单倍体微生物繁殖速度快易积累不同的中间及最终代谢产物环境条件对微生物作用直接均匀存在多种方式的繁殖类型微生物的变异易被识别参与基因工程的载体、供体、受体 三角色,