神经生物学方法.ppt

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1、,神 经 生 物 学 常 用 形 态 学 研 究 方 法,神经生物学常用的研究方法：,1.形态学研究方法：1）剖查法：病理解剖，组织化学，荧光免疫2）影象学：CT，MRI，PET3)活体示踪：放射免疫，免疫组化，HRP法，原位杂交4）共聚焦激光扫描显微镜：,神经生物学常用的研究方法：,2.生理学方法：给予刺激（物理、化学、生物），观察反应（分泌、电变化）灌流技术：保持脑片的存活或观察递质和调质的分泌（脑片灌流、突触小体）推挽灌流技术：观察递质和调质的分泌 免疫探针技术：观察递质和调质的分泌 微透析技术：观察递质和调质的分泌 3.电生理方法：微电极技术，电压钳,膜片钳技术,组织材料的处理1.固定

2、(fixation)目的：防止组织自溶，保护组织免受微生 物侵袭，保存组织成份不被破坏丢失，维持组织结构使之正确的反应生活状态。固定剂：4%多聚甲醛（常用）方法：浸泡固定，灌注固定 2.切片(section)：石蜡切片，冰冻切片,一般染色方法,（一）尼氏染色方法(Nissl staining)：1.定义：是用碱性染料染神经组织的一种方法，神经组织中可与碱性染料结合的主要成份是核酸，神经元胞体中有大量核糖核酸，主要以尼氏小体的形式存在。细胞核中染色质少，故染色浅，但有明显的核仁。神经胶质细胞的核中染色质较多，着色较深，但胞浆不着色。电镜下尼氏小体是许多规则平行排列并相互移动的粗面内质网以及其间的

3、游离核糖体组成。,2.用于尼氏染色的常用染料有：焦油紫（cresyl violet）硫堇（thionine）甲苯胺蓝(toluidine blue),焦油紫染色法:石蜡切片或冰冻切片0.1%焦油紫染液375-10min 蒸馏水洗 70%Alc 3min 95%Alc 3min 100%Alc 1min3次二甲苯5min 2次封片。结果:尼氏小体紫色，本底无色。,DLGDRG,DLG,DRG,Cresyl violet staining,Thionine staining,Cresyl violet staining,高尔基技术(Golgi technique)The Golgi(and rel

4、ated)methods work by staining tissue with silver nitrate which is then reduced to silver.This produces uniform dark coloring of the whole neuron.The morphology of dendrites and axon can be studied in detail.,Cerebellum cortex neuron,神经束路示踪利用轴浆运输现象追踪神经元之间联系的一种方法。示踪剂：HRP（horse radish peroxidase，辣根过氧化物

5、酶），快蓝（fast blue），荧光金（fluorogold），核黄（nuclear yellow），神经生物素（neurobiotin），生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine,BDA）,HRP Tracing Experiment,1，HRP的引入：压力注射法，电泳法，缓释法 2，Survial time：（束路长度 毫米/350毫米）+1日 3，Fixation and Section 4，Incubation Procedure:a,wash sections briefly in three changes of PB b,move the sect

6、ions to the incubating medium(0.2%DAB,1%H2O2)kept at room temperature for 30-40min.c,wash three times in PB for stop the reaction.d,mounting and observation.,HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat,10,40,HRP labellingneurons in dLGN,X40,Double-labelling of HRP and Glutamate in rat lateral

7、 geniculate nucleus,荧光染料示踪法1，荧光染料的配制：2，荧光染料的注射：3，动物存活期：一般存活2-4天。4，灌注固定、取材、冰冻切片。5，贴片后荧光显微镜观察：荧光容易褪 色，贴片后应立即观察。,Fast blue labelling neurons,DRG,Spinal cord,Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina,NADPH-diaphorase组织化学染色法,NO(nitric oxide)的生物合成：催化NO生物合成的酶称一氧化氮合酶（NO synthase,NOS),NOS以L-精氨酸（L-arg)和分子氧

8、为底物，消耗1.5mol NADPH和2mol分子氧生成NO和L-瓜氨酸。NADPH:nicotinamide adenin dinucleotide phosphate Diaphorase:黄递酶 在神经系统大部分区域NADPH-d组织化学染色和NOS免疫组织化学染色一致。,NOS与 NADPH-d活性的比较Nos活性：a.协同因子有Ca2+、CaM、NADPH阻断任何一个协同因子结合位点都可抑制Nos b.底物:L-Arg NADPH-d活性:a:不需CaM、Ca2+作为协同因子，只需NADPH b；底物：NBT(亚硝基四唑氮蓝）,NOS活性NADPH-d活性,使用NOS抑制剂后不能用N

9、ADPH-d组化染色来分析NOS活性。NADPH-d组化染色阳性细胞中可含有NOS,但不能说明有NOS 活性，NADPH-d组化染色阴性细胞中一般不含NOS.,NADPH-d组化染色,a:冰冻切片b:0.05M Tris缓冲液漂洗c:于含0.2%Tritonox-100的Tris缓冲液中室温下预孵育510min.d:在含0.3%Tritonx-100,1mg/mlNADPH,0.5mg/mlNBT的Tris缓冲液中37孵育11.5小时.e:Tris缓冲液漂洗，中止反应。,NADPH-d Staining In Caudate Nucleus,X40,NADPH,免疫组织化学(Immunohis

10、tochemistry),利用特异性抗体对神经组织中某种特异成份(抗原)进行抗原-抗体反应,达到检测组织细胞内是否有此特异性物质。其本质就是用标记的抗体追踪抗原(以确定组织细胞内的某种化学物质)。,是用特异性抗体显示组织化学成分的一种方法。免疫组化法的基本步骤有固定、制片、反应三步。常用于显示各种神经肽。常用的方法有：ABC法卵白素生物素结合的辣根过氧化物酶法。PAP法过氧化物酶抗过氧化物酶法。,应 用 与 评 价,应用：a.用已知抗体探测未知抗原：受体、酶、递质、肽类、细胞骨架蛋白等。b.示踪:示踪物抗体与示踪物反应。c.用已知抗原探测未知抗体。d.原位杂交的后续部分。结果评价:有阳性产物，

11、说明细胞内有此物质，但是否由此细胞产生不能完全肯定。定量:阳性细胞数、灰度值或光密度值。,Immunohistochemical procedures,1.Tissuue preparation:perfusion,section 2.Blocking:封闭，异种蛋白质间会有非特异性结合，常用正常羊血清（NGS）或牛血清白蛋白（BSA）封闭。3.Incubate in primary antibody:最佳浓度需摸索，为提高抗体向组织内穿透，可在抗体稀释液中加入0.1%0.3%TritonX-100。需长时间孵育时应加入0.01%0.3%NaN3防腐。产生一抗的动物一定要知道，以便选择二抗。,

12、4,Washing:去掉非特异性结合5,Incubate in second antibody:浓度1/100200,二抗必须针对一抗动物种属，二抗上结合的物质不同，显色用不同方法：ABC，PAP，荧光显色，IGSS。ABC，PAP经典、产物稳定，荧光法不需6,三抗，不需脱水透明。但荧光易淬灭。IGSS非常敏感，不用DAB做反应，但背景难以控制。,7，ABC复合物（avidin-biotin complex)or PAP复合物（peroxidase-anti-peroxidase complex)孵育，浓度1:100（或200）。8，React with DAB:DAB能致癌，在强光下可氧化（

13、应尽量避光），68分钟出现阳性产物，镜下控制反应。,对照实验1.阴性对照：a、NGS 或缓冲液代替一抗 b、去二抗 c、吸附实验：一抗加入后，再加入相应抗原，将抗体与过量的抗原一起孵育一段时间后，此混合液再作免疫组化染色 2.阳性对照：,PBS洗片0.5%3%H2O2 15min(灭活内源性过氧化物酶)PBS洗片5-10%NGS(或5 10%BSA)+0.2%TritonX-100 孵育12h(封闭)一抗4过夜 PBS洗片5min 3次 二抗2 4h室温 PBS洗片5min 3次 ABC 1 2h PBS洗片10min 3次 DAB显色,GAP-43-ir neurons in spinal

14、cord,GAP-43-ir,NS group,Anti-BDNF group,NeuN-ir,40,S-100-ir of Schwann cells,S-100-ir of Schwann cells,C-FOS-ir,C-FOS-ir,20,20,Neuronal stem cell spheres X10,Nestin-ir,10,Map-2 ir,Map-2-ir,GFAP-ir,40,40,40,40,TH-ir,ChAT-ir,GAD-ir,GABAAR-ir,NF 200-ir of sciatic nerve,Brdu-ir of retia,GFAP-ir,P75-ir,4

15、0X,40X,原位杂交(IN SITU HYBRIDIZATION),原位核酸分子杂交技术（In situ nucleic acid molecular hybridization)简称原位杂交技术。是用标记的NDA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内待定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。,基 本 原 理碱基互补配对原则 待测mRNA:探针(probe):digoxin-AGTCTAGT-+-UCAGAUCA-一定温度、时间与条件-AGTCTAGT-UCAGAUCA-+digoxin抗体 digoxin 碱性磷

16、酸酶-AGTCTAGT-UCAGAUCA-碱性磷酸酶 digoxin-digoxin抗体+NBT-显色,探针的类型,1.cDNA probe：杂交反应有较高的专一性。因其为双链结构，需加热变性解链。解链后只有半数DNA链与特定的mRNA杂交，另一半DNA链则与mRNA竞争，并导致DNA链的自我“退火”（既重新形成双链）。2.mRNA probe（互补的RNA）：为单链结构，杂交反应专一性高，杂交链稳定，制备复杂。3.Oligonucleotide probe:由DNA合成仪合成，制备简单，由于链不长，又是单链，较易穿过组织，操作方便，但杂交链因其链短而不够稳定。,Procedures of I

17、n Situ Hybridization,1.Preparation of tissue:a.组织取材：尽可能新鲜，由于组织RNA降解较快，新鲜组织和培养细胞最好在标本30min内固定。取材时应戴手套，防止外源性RNA污染。b.固定：4%多聚甲醛，灌注固定时固定剂的用量一般为动物体重的2倍，浸泡固定时，组织与固定剂的体积比不低于己于1:10。C.切片：冰冻切片或石蜡切片。,2.prehybridization treatment增强组织的通透性和探针的穿透性：a.稀酸和酸酐(0.2N HCL,0.25%acetic anhybdride)处理：防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合。b.去污剂

18、(0.010.3%TritonX-100)处理：增强组织的通透性，利于探针进入组织细胞。c.蛋白酶(proteinase K)处理:消化包围靶核酸的蛋白质，使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。,Prehybridization杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育一定时间，以阻断标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到降低背景的目的。为防止外源性RNA酶污染，杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一天置高温（180）烘烤，杂交前及杂交时所用的溶液均需经高温消毒处理。,Hybridization1.cDNA探针需变性解链：95100，

19、510min，探针变性后要马上进行杂交反应。2.杂交液：除含一定量的标记探针外，还含有较高浓度的盐类（高度Na+可使杂交率增加，减低探针与标本之间的静电结合）；甲酰胺（可使杂交温度降低）；硫酸葡聚糖（能与水结合，减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度）；BSA、载体DNA与RNA（变性鲱鱼精DNA、酵母转运RNA）（阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，减低背景）。,杂交温度：当杂交液含50%甲酰胺，盐浓度为0.75mol左右时,cDNA探针杂交温度约为42,mRNA探针为5055,寡核苷酸探针约为37 杂交时间:一般为1620h,杂交反应时间不要超过24h,反应时间过长,形成的杂交体会自

20、动解链,杂交信号反而减弱,杂交后处理:系列不同浓度、不同温度的盐溶液的漂洗，除去未参与杂交的过剩的探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合。杂交体的检测：非放射性核酸杂交，可用酶检测系显色（同免疫组织化学）,原为杂交的对照,阳性对照 1、已知阳性组织对照 2、Northern或Southern印迹反应 3、免疫组织化学 阴性对照 1、已知阴性组织 2、正义RNA(Sense RNA)探针 3、省去探针 4、杂交前用RNA酶或DNA酶处理标本 5、检测系统的阴性对照,GAP-43mRNA positive neuron in spinal cord 10,The expression of s

21、ynapsin 1 mRNA in the spinal cord anterior,Synaptoptophysin mRNA,C-ret mRNA positive neurons in spinal cord,a,b,Fig.a The expression of c-ret mRNA in the dentate gyrus of rat hippocampus Fig.b The expression of synapsin 1 mRNA in the CA3 region of rat hippocampus,神经细胞培养 神经细胞的分离培养1956年Nakai首创，利用机械的或酶

22、学的方法将神经组织分散为相互分离的单个细胞，然后把细胞悬液用于体外培养。,1，材料的来源：一般取材于胚胎动物的神经组织。2，神经元体外培养液：20%小牛血清或胎牛血清+DMEM/F12。3，有丝分裂抑制剂：阿糖胞苷、5-氟脱氧尿嘧啶常用。4，神经元的无血清限定培养液：N1、N2、N3。5，神经元体外培养的生长基质：多聚赖氨酸、多聚鸟 氨 酸、鼠尾胶原等。6，体外培养神经元的化学标志物：MAP-2、NF、NSE等。7，神经元体外培养的存活时间：一般地1-2周。,The culture neurons of hippocampu,MAP-2-IR of cultured hippocampal n

23、eurons 400,NF-200-ir of cultured hippocampal neurons 400,NF-200-ir of cultured spinal cord neurons 400,Synaptophysin-ir of cultured spinal cord neurons 400,激光共聚焦显微镜,用0.2 m的光束可透射厚0.51mm的细胞组织，用于神经递质、受体和转运体的定位；神经元结构的三维重建；活的神经细胞的动态变化；也可对活细胞进行连续扫描，显示细胞内某种成分（如Ca 2+）的变化过程，线粒体、内质网、高尔基体、染色体等的探测和分析，DNA、RNA、酶的

24、含量测定。,荧光显微镜下海马锥体层内荧光黄阳性染色的神经元,a 激光共聚焦显微镜下荧光黄染色神经元（黄色）和胶质原纤维酸性蛋白染色阳性星形胶质细胞（红色）：星形胶质细胞与神经元紧密接触点（），锥体细胞层（），未染色的锥体细胞（）,b 20pA直流电流刺激图a中荧光黄染色神经元（膜电位-70mV），使膜电位去极化至-60mV后引发的位相型动作电位发放,c 激光共聚焦显微镜下荧光黄染色神经元（黄色）和胶质原纤维酸性蛋白染色阳性星形胶质细胞（红色）：星形胶质细胞与神经元紧密接触点（），锥体细胞层（），未染色的锥体细胞（）,d 20pA直流电流刺激图c中荧光黄染色神经元（膜电位-71mV），使膜电位去

25、极化至-60mV后引发的非位相型动作电位发放,神经元电活动的记录,神经干的复合动作电位；神经细支的多单位放电；外周神经或脊髓背根分细束，记录单个感觉单位电活动；微神经图象(microneurography)；微电极记录单个神经元电活动，胞外记录和胞内记录。,The discharge change of A-fiber single after electrical stimulation to cutaneous nerve adjacent spinal segment,电刺激,神经生物学常用的研究：,4.行为学研究方法,X光计算机断层扫描(Computerized tomography,

26、CT),磁共振成像术（magnetic resonance imaging,MRI),正电子发射断层成像术(positron emission tomgraphy,PET),神经递质释放量的测定推挽灌流法：用于脑室或脑组织灌流，测定神经递质含量变化。,脑透析法：可测定不同脑区的多巴胺及其代谢产物，氨基酸，乙酰胆碱，去甲肾上腺素，5HT等。神经肽的测定较难，主要由于探头半透膜要求较高。,膜片钳(patch clamp)记录细胞膜上的单通道电流。用培养细胞或急性分离的细胞，将玻璃微电极的尖端吸附一小片细胞膜或整个细胞来记录通道电流。,高效液相层析(high performance liquid c

27、hromatography,HPLC),原理是利用分子间特异性及可逆性的结合，将其一方固定于层析的固定相中，使流动相中能特异性结合于该分子的物质与其结合，然后再改变条件，使被分离物质洗脱，用一定波长紫外光检测。HPLC是分离分析生物活性物质和受体的重要手段。,分子生物学方法,神经肽和蛋白质基因的分子克隆 人类染色体含有3109碱基和510万个基因。基因克隆是将特定基因从基因组中分离出来并在细菌中扩增的过程。克隆基因的目的是获得大量的纯DNA分子。,mRNA的检测,利用特异性探针可检测组织内mRNA含量的变化。Northern 印迹法：可显示mRNA的分子长度和含量变化。原位杂交法：可显示组织内

28、mRNA的分布和含量变化。此法可在细胞和亚细胞水平显示mRNA分布及相对含量。,聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction,PCR),PCR是一种扩增核酸分子的技术。可用于发现新基因，分析基因序列，测定mRNA含量等。,反向遗传学技术(reverse genetics),制造生物体内某些基因的突变以产生生物表型的突变，分析突变体的生理、生化改变有助于了解基因及其产物的功能。传统遗传学方法：利用生物表型改变筛选突变基因细胞分离鉴定突变基因。反向遗传学方法：制造定向突变基因引入细胞染色体观察生物表型改变。,生物芯片技术（biochip）,生物芯片技术是在1个平方厘米大小的

29、薄型载体上，通过微加工技术获得微米级结构，并与生物化学处理等技术相结合而发展起来的一种新型技术。它可以把多至几十万个的生命信息集成在一块芯片上，进行各种与生命科学和医学相关的生物化学反应，对基因、蛋白、活体细胞及组织等进行分析和检测。,用于样品制备过程的芯片：如样品分离和纯化，包括细胞的分离、破胞、蛋白、提取DNA等。用于生物化学反应过程的芯片：如核酸扩增、标记等。,用于检测和数据分析处理的芯片：如DNA杂交检测芯片、毛细管电泳芯片或飞行时间质谱仪检测芯片等。微型全分析系统（Micro Total Analysis System）或微缩芯片实验室(Lab-on-a-Chip)：是通过将生化分析全过程中不同的芯片集成在一起而实现的。,