细胞生物学3.细胞生物学研究方法.ppt

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1、Techniques in Cell Biology,细胞生物学研究方法,光学显微镜技术（light Microscopy）电子显微镜技术(Electro microscopy)扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope）,第一节 细胞形态结构的观察方法,一 光学显微镜技术（light icroscopy）,复合显微镜：现今使用的光学显微镜都是由几个透镜组合而成，所以又称为复合显微镜。,构成：（1）光学放大系统:（2）照明系统：（3）机械和支架系统,原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。,显微镜适合的放大倍数 放大倍数：是眼睛看到像的大小与对应标本长度大小的比

2、值。放大倍数目镜的放大倍数X物镜的放大倍数,人眼的分辨能力在0.1 mm左右,固定：可使生物大分子交联，蛋白质成分凝固，防止细胞自溶和破坏而产生人工假象。常用固定剂：甲醛、戊二醛、乙醇 包埋：便于切片，防止样品移位,常用包埋剂：石蜡 切片：生物样品太厚，不能直接用光镜观察，需切成110m的薄片 染色:苏木精对负电荷分子有亲和力，可显示细胞内核酸的分布 伊 红可使细胞质染色,2、光学显微镜的样品制备与观察,苏木精-伊红染色，又称“苏木素-伊红染色”，或“H&E染色”（hematoxylin and eosin stain、HE stain），是组织学最常用的染色方法之一。,这种染色方法的基础是组

3、织结构对不同染料的结合程度不同。染料苏木精可以将嗜碱性结构染成蓝紫色，而伊红可以将嗜酸性结构染成粉红色。嗜碱性结构通常包括含有核酸的部分，如核糖体、细胞核及细胞质中富含核糖核酸（RNA）的区域等。嗜酸性结构则通常由细胞内及细胞间的蛋白质，如路易体（Lewy body）、酒精小体（Mallory body）、细胞质的大部分等。,正置显微镜,倒置显微镜,（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope,概念：是以紫外线为光源激发生物样品中的荧光物质，产生能观察到的各种颜色荧光的一种光学显微镜。特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；,自发荧光:由细胞本身存在的物质经紫外

4、线照射所发出的荧光。诱发荧光:一些细胞成分本身经紫外线照射后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱发荧光。,什么是荧光？当一个物体吸收了紫外光（短波光）的能量，物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出比原来吸收的波长更长的光为“荧光”。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。,染 色,不染色,激发光,发射光,荧光显微镜的种类 透射式 落射式,荧光显微镜的在生命科学中的应用：,荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。荧光显微镜是目前在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性

5、定位的最有力的工具。,蝾螈肺细胞的有丝分裂(240 x),荧光。/Alexey Khodjakov,纽约健康部门Wadsworth 中心。,（三）激光共聚焦扫描显微镜,是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像的一种光学显微镜。,WHAT IS CONFOCAL MICROSCOPY,The resolution of images obtained with conventional microscopy are seriously deteriorated by the contami

6、nation of the image plane with out-of-focus light,WIDEFIELD,CONFOCAL,共聚焦扫描显微镜的成像基本原理,分辨率可以比普通荧光显微镜的分辨率提高1.41.7倍,由于点对点扫描去除了杂散光的影响,可获取连续光学切片,优点：,多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物,LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton(green)and the nucleus(blue),2008年的诺贝尔化学奖授予了从事有关“绿色荧光蛋白质的发现,表达和发展”并取得重要成就的

7、三位科学家:下村修、马丁查尔菲和钱永健。,绿色荧光蛋白改造的蜜蜂,（四）相差显微镜,相差显微镜（phasecontrast microscope）是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。,用途：观察未经染色的玻片标本,相差显微镜观察的活细胞,（五）微分干涉差显微镜,在相差显微镜原理的基础上发明 其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。,DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）,微分干涉差显微镜的应用：,

8、(Differential-interference microscope)DIC显微镜使细胞的细微结构立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。微分干涉显微镜还可用于研究活细胞中较大的细胞器。将微分干涉显微镜接上录像机，可以观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。,二、电 子 显 微 镜,一、分类：透射电子显微电镜（Transmission electron Microscope TEM）扫描电子显微电镜（Scanning electron Microscope SEM）扫描隧道显微镜,各种光及电子束的波长,透射电子显微电镜,1、电子显微镜与光学

9、显微镜的基本区别,2、电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数,电子显微镜的分辨率可达0.2nm，其放大倍数为100万倍。上述放大倍数称之为有效放大倍数；如继续通过光学手段放大也不会得到任何有意义的信息，因此称之为“空放大”。电镜的分辨本领:是指电镜处于最佳状态下的分辨率。实际情况下，电镜的实际分辨率常常受到生物制样技术本身的限制，如在超薄切片样品中其分辨率约为超薄切片厚度的1/10，即通常切片厚度若是50nm，其实际分辨率约为5nm，远低于电镜的分辨本领0.2nm。,由于电子束穿透力很弱，因此用于电镜观察的标本须制成厚度仅2050nm 的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机制作。,1.

10、超薄切片技术,二、主要电镜制样技术：,取材:要快，避免损伤，标本必须薄，小固定:常用戊二醛和四氧化锇固定，四氧化锇除与蛋白共价结合外,还对脂类有良好的固定效果。脱水:等级梯度脱水，用脱水有利包埋。包埋:为制成超薄切片,并使切片耐受高真空、电子轰击,切片前需包埋,常用环氧树脂。切片:将样品制成50100nm厚的薄片。染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成,散射电子能力弱,无明暗反差,需进行染色。常用的染色剂：醋酸铀、枸橼酸铅。,透射电镜标本制备过程:,观察组织、细胞内部超微结构。分辨率0.2nm。,标本在荧光屏上呈黑白反差的结构影像。电子密度高、电子密度低：被重金属浸染呈黑色的结构，称电子密度高

11、；反之，浅染的部分称电子密度,用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处和样品周围铺了一薄层重金属盐，而凸出处则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,示肌动蛋白纤维,二 负染色（negative staining）技术,亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。,冰冻断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。,三 冰冻蚀刻技术,将标本于-100干冰中或-196液氮中，超低温冰冻。,冰冻蚀刻技术的操作步骤:,然后用冷刀骤然将标

12、本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，细胞内外凡含水多的地方因失水而下陷,暴露出了断裂面的膜和其它一些结构,增强了断面的浮雕效果蚀刻。,标本蚀刻后，再向断裂上以45喷金,90喷碳后将样品浸泡于腐蚀液中将生物组织腐蚀掉，只剩下铂碳复型膜。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，捞于载网上干燥后可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,复膜,细胞冰冻断裂后的电镜图像,（二）扫描电子显微镜,20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为610nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为20000X。,扫描电子显微镜原理,工

13、作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。,扫描电子显微镜生物样品制备的基本操作程序,扫描电镜照片展示,不同倍率的果蝇扫描电镜照片,扫描电镜照片展示,可以用计算机将黑白照片处理成彩色,扫描电镜照片展示,人类精子,（三）扫描隧道显微镜Scanning Tunneling Microscope，,分辨率：X-Y向0.1nm（原子级分辨率）,扫描隧道显微镜是用来显示物质表面原子排布的一种显微镜，它是根据量子力学中的隧道效应而设计的。,探针和物体之间加上电

14、压。如果探针距离物体表面很近大约在纳米级的距离上电子会穿过物体与探针之间的空隙，形成一股微弱的电流。如果探针与物体的距离发生变化，这股电流也会相应的改变。这样，通过测量电流我们就能知道物体表面的形状，,1、原子级高分辨率。如STM在平行和垂直于样品表面方向的分辨率分别可达0.1nm和0.01nm，即可以分辨出单个原子，具有原子级的分辨率。2、可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤。这些特点适用于研究观察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白质等)的原子布阵和一些生物结构(如生物膜、细胞壁等)的原子排列,而不需要特别的制样

15、技术，并且探测过程对样品无损伤纳米科学水平。,扫描隧道显微镜的优越之处：,第二节 细胞组分的分析方法,一、用超离心技术分离细胞器与生物大分子及其 b 复合物二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显 b 示方法三、特异蛋白抗原的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性,一、用超离心技术分离细胞器与生物大分子及其合物各种离心技术离心是研究亚细胞成分和生物大分子的基本手段。1924年 svdberg发明了世界上第一台分析超速离心机。,离心机：普通：8000rpm以下；高速：800025000rpm；超速：25000rpm以上，达十几万rpm。,（一）差速离心 Differential centri

16、fugation,主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。,差速离心,2、等密度离心法：按细胞组分的浮力密度不同进行分离的方法。适用于大小、形态相似而密度不同的组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化铯的密度梯度沉降在达到与自身密度相等的位置就停滞不再向下沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。,密度梯度离心分离溶酶体、线粒体和微体,CsCl 密度梯度离心分离DNA,密度大于1.3g/cm3,原理：利用一些显色剂与所检

17、测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括糖类、脂类、核酸、酶等。,二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法,核酸显示方法Feulgen反应,Feulgen和Rossenbeck(1924)发明，对DNA的反应具有高度专一性。原理:标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红与醛基反应，形成含有醌基的化合物，醌基为发色团，呈现出紫红色。,Feulgen反应,糖类显示方法过碘酸雪夫反应（periodic acid

18、Schiff reaction,PAS反应）,基本原理：过碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基变为乙二醛基，后者继而与Schiff试剂（无色亚硫酸品红复合物）结合，形成紫红色反应产物。,酶组织化学染色法,基本原理：是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作用，然后再使底物的反应产物与某种试剂发生反应，形成沉淀或有色的最终产物，借此检测该酶在组织切片或细胞内的分布及活性强弱。,Electron micrograph of a cell showing the location of a particular enzyme(nucleotide diphosphatase)in the Golgi app

19、aratus.A thin section of the cell was incubated with a substrate that formed an electron-dense precipitate upon reaction with the enzyme,2脂类显示方法,二十世纪70年代以来，免疫学的迅速发展为细胞生物学的研究提供了强有力的手段，特别是在细胞内特异蛋白的定位与定性方面，单克隆抗体与其它一些检测手段相结合发挥了重要作用。免疫细胞化学技术与免疫电镜是最常见的研究细胞内蛋白质分子定位的重要技术。,三、特异蛋白抗原的定位与定性,免疫细胞化学技术（Immunocytoc

20、hemistry）利用抗原和抗体的结合具有高敏感性和特异性的特点，用已知的经过标记的抗体检测组织与细胞中相应抗原的方法。,常用的标记方法：1)荧光标记：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明2)酶标记：辣根过氧化物酶（HRP）3)胶体金标记：即金的水溶液，具有一般溶液的特 性，用它与抗体标记后，经抗原抗体 反应可定位抗原的存在。,免疫荧光技术就是将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。常用的萤光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。实质就是用结合有荧光素的抗体与组织内抗原反应，在荧光显微镜下观察抗原的存在部位。也可分为直

21、接法和间接法。,炭疽杆菌24h培养物直接荧光抗体检测,间接荧光抗体检测细胞培养中的猪瘟病毒,核酸杂交原理,四、细胞内特异核酸的定位与定性,四、细胞内特异核酸的定位与定性,原位杂交(in situ hybridization)：在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术，称为原位杂交(in situ hybridization)。原位杂交技术首先是在光镜水平上发展起来的，放射性同位素标记的探针与样品中的DNA或RNA杂交后，用显微放射自显影的方法显示杂交物的存在部位；或用荧光素标记的探针进行杂交，在荧光显微镜下直接显示与探针杂交的核酸存在部位。原位杂交技

22、术在显微与亚显微水平上研究基因定位、特异mRNA表达等问题的研究中起重要作用。,荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH):,FISH技术的原理图解,放射性同位素发射出的各种射线能使照相乳胶中的卤化银晶体还原(感光)。利用这样的特性，用放射性化合物脉冲标记活细胞,经固定、切片后在暗处把感光乳胶覆盖于切片上,在此期间,由于放射性同位素衰变使乳胶曝光,经显影、定影,根据银粒所在部位,就可知道细胞中放射性物质的分布。这种利用放射性物质使照相乳胶膜产生该物质自身影像的技术，称为放射自显影术。,五、放射自显影术,细 胞 培 养,（一）动物细胞培养（二）

23、植物细胞培养,第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术,细胞培养,就是将动植物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞或直接以单细胞 生物，给予必要的生长条件，让其在培养瓶中或培养基上继续生长与增殖。,是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。,原代培养（primary culture）：,大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织,将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞

24、,传代培养：,细胞株:通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的细胞称为细胞株。如转基因、基因敲除、被标记等。,细胞株(Cell Strain)：,细胞系（Cell Line）：原代培养物经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。如果传代培养不超过10左右，称为有限细胞系（finite cell line）。如果细胞能连续传代培养的，称为连续细胞系（continuous cell line）。如果细胞能无限传代培养，称为永生化细胞系（immortal cell line）。,细胞系（cell line）:

25、,当培养细胞分裂增殖相互间密切接触时，细胞停止活动的现象为接触抑制。（非正常细胞如癌细胞除外）。,接触抑制和密度依赖性,实验室中常用的几种细胞系,Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养,正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。,细 胞 工 程(cell engineering),概念：是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和

26、细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。类型：就技术范围而言，大致有细胞融合技术、细胞拆合技术、细胞组织培养技术和胚胎移植技术等。,（一）细胞融合的概念 细胞融合（cellfusion）又称细胞杂交（cellhybridization）是指在自然条件下或人工方法（物理，化学，生物等方法）将不同种生物或同种生物不同类型两个或多个真核细胞合并成一个双核或多核细胞的生物学现象和过程。,一,细 胞 融 合,同核融合细胞：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)；异核融合细胞：来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。,两个细胞

27、正在融合,细胞膜的流动性是动物细胞融合的生物学基础。细胞融合就是利用细胞膜的这一特性，通过对参与融合的细胞施加生物、化学、或物理诱导因素，使细胞膜的脂类分子有序排列发生改变；当诱导因素解除后，细胞膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。,(二),动物细胞融合的原理,细胞融合过程,细胞融合可分为个过程：.细胞的接触.细胞质膜的融合.细胞质的重组.遗传物质的选择,(三),细 胞 融 合 过 程,许多病毒都具有凝集动物细胞并促使凝集的动物细胞发生融合的能力。如疱疹病毒，牛痘病毒，鸡瘟病毒和仙台病毒等其中常用的是经紫外线照射灭活的仙台病毒,.病毒介导的细胞融合,诱导细胞融合的方

28、法,仙台病毒,.电激介导的细胞融合,其中电诱导细胞融合和诱导细胞融合是动物细胞融合的常用方法。,.化学介导的细胞融合（如PEG）,细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，如动植物育种和制取单克隆抗体等。,在生命科学中应用价值极大的单克隆抗体的制备技术就是在细胞融合技术上发展起来的单克隆抗体的诞生，导致了免疫学技术的革命这项技术或年诺贝尔医学及生理学奖,二 单克隆抗体技术,荣获1984年诺贝尔生理学或医学奖发明单克隆抗体技术,杰尼Niels K.Jerne丹麦巴塞尔免疫研究所1911年-1994年,科勒Georges J.F.Khler德国巴塞尔免疫研究所1946年-1995年,米尔

29、斯坦Csar Milstein英国英国医学研究委员会分子生物实验室1927年-,三.单克隆抗体的概念和原理,由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗原决 定簇单克隆抗体 抗原分子表面具有特殊立体构型和免疫活性的化学基团称为抗原决定簇。,分泌抗体长命,分泌抗体短命,长命不分泌抗体,（二）HAT培养基筛选的原理,免疫脾细胞 经抗原免疫的BALB/c小鼠的脾脏小鼠骨髓瘤细胞 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT),胸腺嘧啶激酶（TK）缺陷型,亲本细胞,主途径：是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。可被氨基喋呤阻断 辅助途径：是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核

30、苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。如细胞含有此两种酶则可启动补救途径。,细胞DNA合成一般有两条途径:,HAT培养基筛选:,H,次黄嘌呤;T,胸腺嘧啶,A,氨基喋呤;可阻断内源性的DNA的合成。,单克隆抗体制备示意图,三 细胞拆合及显微操作技术,细胞拆合方法：可以分为物理法和化学法两种类型。物理法：用机械方法或短波光把细胞核去掉或失活，然后用微吸管吸取其它细胞的核，注入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。这种核移植必须用显微操纵仪进行操作。化学法：用松胞素B处理细胞，细胞出现排核现象，再结合离心技术，将细胞分拆为核体和胞质体两部

31、分。由于核体外表包有一层细胞膜和少量胞浆，因而在PEG或仙台病毒的介导下，核体可同另一胞质体融合，形成重组细胞。,细胞拆合：就是把核与质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。,显微操作技术micromanipulation technique,在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。,显微操作仪,现在显微操作装置的设计越来越精密，已经有可能对细胞核进行解剖和注入微量物质（如核酸分子片段）。,DNA,第四节 模式生物,病毒细菌酵母线虫果蝇斑马鱼小鼠拟南芥玉米,C.elegans的优势在于为一种多细胞真核生物。雌雄同体成虫有959个体细胞；雄成虫有1031个。且每一个体细胞的发育情况都研究得较为清楚。这个细胞世系的规律在各个个体之间是几乎不变的。,在国际上，斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入到生命体的多种系统（例如，神经系统、免疫系统、心血管系统、生殖系统等）的发育、功能和疾病（例如，神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等）的研究中，并已应用于小分子化合物的大规模新药筛选。我国开展斑马鱼相关的研究无论在规模还是在重视程度上都远远落后于国际形势发展的需要。,