血红蛋白的分离和提取.ppt
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1、课题3 血红蛋白的提取和分离,一、课题的目标:通过尝试对血液中血红蛋白的 提取和分离,理解色谱法、电泳法二、课题重点:凝胶色谱法的原理和方法三、课题难点:样品的预处理、色谱柱填料的处理 和色谱柱的装填,思考:“课题1-DNA的粗提取与鉴定”实验理想的材料是什么?“课题3-血红蛋白的提取和分离”这实验理想的材料又是什么?原因是?,答:鸡的红细胞具有细胞核,含有DNA,便于进行DNA的提取,哺乳类动物成熟的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,一、基础知识:(一)蛋白质分离原理(二)蛋白质分离的方法 1)凝胶色谱法:又称分配色谱法 2)电泳法(三)缓冲液的作用,二、实验操作
2、实验步骤,血液组成成分,1、样品 处理,3、纯化,4、纯度鉴定,2、粗分离,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度,凝胶色谱法进行纯化,注意事项,蛋白质提取与分离的依据 蛋白质的物理化学性质差异:1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子亲和力,1.凝胶色谱法,一些微小多孔的球体(内含许多贯穿的通道,具多孔的凝胶就叫分子筛),根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法,(2)概念:,(1)凝胶,3、原理:当不同的蛋白质通过凝胶时,()的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程(),移动速度(),而()的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在()移动,路程(),移动
3、速度(),相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,总结:大分子经过路程短,流动快;小分子经过路程长,流动慢。,洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液,促使蛋白质分子的差速流动。,4、具体过程,2凝胶电泳法:,1)原理:,不同蛋白质的带电性质(正电荷或负电荷)、电量、分子形状和大小不同,在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同,导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,2)影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳:带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,3)常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
4、在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳做对照,根据两者的电泳区带位置,利用相关计算公式算出相对分子量 SDS 带负电荷多的,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷的差别,使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,影响蛋白质分子运动速度的因素,由弱酸和相应的强碱盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3,NaH2PO4/Na2HPO4等,缓冲溶液洗脱剂(1)作用:(2)配制:,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。,(3)在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因?,目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能。,血
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