产琥珀酸菌LW 2的筛选 鉴定及发酵条件优化 附琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂专利技术综述.docx

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1、琥珀酸是一种重要的四碳二元较酸，在2004年，它被美国能源部列为12种 最有潜力的大宗生物基化学品之首。琥珀酸是一种新型、灵活性高、环境友好的 生物基平台化合物，可作为生产高附加值产品的原料，如四氢吠喃、己二酸、- 丁内酯和1,4-丁二醇等。因而它在食品、农业和制药等许多领域具有广泛的应用 前景。在食品领域，琥珀酸是影响啤酒口味的重要有机酸，还可用作奶类制品的 铁强化剂以及新型乳化剂，琥珀酸还可作为食品的鲜味剂和酸味剂等。目前，琥珀酸的制备方法主要为化学合成法和微生物发酵法。利用微生物发 酵法生产琥珀酸的生物技术路线替代化学路线具有更长远的意义。城珀酸是厌氧 或兼性厌氧微生物通过厌氧发酵获得的

2、最终产物之一。大肠杆菌由于其遗传背景 简单、生长速率快、易培养等诸多优点而受到越来越多的重视，被认为是最有潜 力的琥珀酸生产菌株。以牛瘤胃内容物作为菌源，用富马酸钠为碳源，在高浓度二氧化碳气氛下富 集筛选获得产琥珀酸菌株，以期实现葡萄糖和木糖高效转化制备琥珀酸的目的。 目前已报道的菌株多以葡萄糖为碳源发酵产琥珀酸，但很少有菌株利用木糖为碳 源，或既可利用葡萄糖也可利用木糖为碳源厌氧发酵产琥珀酸，研究旨在为木质 纤维生物质原料（水解后同时含有葡萄糖和木糖）生产琥珀酸提供理论支持。1琥珀酸产生菌筛选经过对瘤胃内容物大量菌株的筛选分离获得产酸菌株66株。分别以葡萄糖 和木糖为碳源进行琥珀酸发酵，其中

3、菌株LW-2利用葡萄糖和木糖产琥珀酸质量 浓度最高，分别为4.48gL和5.27gL,表明该菌株具有较好利用葡萄糖和木糖 发酵生产琥珀酸的能力。因此，选取菌株LW-2进行下一步形态、生理生化鉴定 和发酵条件优化实验。2菌种鉴定菌株LW-2菌落呈圆形、微凸、无色、边缘规则整齐、半透明、表面光滑湿 润。扫描电镜观测菌体呈短直杆状、不产芽抱、菌体大小为0.530.61 m.96 1.71 m （图1）；该菌有荚膜、有鞭毛、能运动、革兰氏阴性，在好氧和厌氧条 件下均能生长，最适生长温度为37 ,其他生理生化特征见表3。测序结果显示菌株LW-2的16S rDNA基因序列长度为1 479 bp,在BLAS

4、T 数据库进行相似性比对，并使用MEGA6.0构建系统发育树（图2）,菌株LW-2 与肠杆菌科弗格森埃希菌（ESCheriChia fergusonii）的相似性达99.98%,并且在 系统发育树上亲缘关系最近。根据菌株LW-2的形态特征、生理生化特征以及其 16SrDNA序列分析，鉴定菌株LW-2为弗格森埃希菌。3以葡萄糖和木糖分别为碳源的发酵3.1 发酵时间对菌体生长及发酵琥珀酸产量的影响以葡萄糖为碳源（图3A）, OD660nm在12h达到最高值5.15,城珀酸最终 产量在24 h达到最高值为4.71 gL,琥珀酸产率为15.70%。本实验所用菌株LW-2 以葡萄糖为碳源发酵获得的琥珀酸

5、产量为大肠杆菌JCLI208的1.44倍，获得的 琥珀酸产率为大肠杆菌CA79的1.74倍。以木糖为碳源（图3B）, OD660 nm在 24 h达到最高值4.85,琥珀酸最终产量在66 h达到最高值为6.21 gL,琥珀酸产 率为 20.70% o3.2 温度对菌体生长及发酵琥珀酸产量的影响以葡萄糖为碳源（图4A）,当培养温度为40 C,发酵24h,菌体生物量最 高，琥珀酸产量也达到最高为5.44gL,琥珀酸产率为18.13%,该最适温度与瘤 胃相似3941 C。以木糖为碳源（图4B）,当培养温度为37 ,发酵66 h, 此时菌体生物量值最大，琥珀酸产量也达到最高为6.21 gL,琥珀酸产率

6、为 20.70%。3.3 接种量对菌体生长及发酵琥珀酸产量的影响本实验不同接种量对琥珀酸发酵的影响见图5。以葡萄糖为碳源（图5A）, 当接种量为1%2.5%时，琥珀酸产量和菌体生物量缓慢增加；当接种量超过 2.5%时，琥珀酸产量未呈现增加的趋势。该结果说明葡萄糖主要被用于大量菌体 的自身生长代谢，而对城珀酸的积累不益；当接种量为2.5%时，发酵24 h, OD660 nm及琥珀酸产量最高分别为4.05和6.36 gL,琥珀酸产率为21.2%o本 实验虽然利用菌株LW-2以2.5%的接种量厌氧发酵,但是获得的城珀酸产量却是 大肠杆菌突变株QQSlOl的6.69倍,获得的琥珀酸产率是大肠杆菌JMO

7、Ol的1.47 倍。以木糖为碳源（图5B）,接种量低于7.5%时，发酵液发酵不充分，产城珀 酸量较低。随着接种量的增加，琥珀酸产生量逐渐增多。当发酵接种量高于7.5% 时，随着接种量的加大，菌体生物量缓慢增加并趋于平稳，说明菌体此时已进入 对数生长期，菌体生物量几乎不变，而琥珀酸产量呈现减少的趋势，表明此时发 酵液中的木糖多消耗在菌体细胞生长繁殖上，使琥珀酸产量减少。当发酵接种量 为7.5%时，发酵66h,琥珀酸产量最高可达7.51 gL,琥珀酸产率为25.03%。3.4 培养基中PH值调节剂对菌体生长及发酵琥珀酸产量的影响不同的PH值调节剂溶于水时有不同的特性，不同调节剂对城珀酸发酵的影 响

8、见图6。分别以葡萄糖和木糖为碳源时，4种调节剂MgCO3 CaCO3、Na2CO3 NaHCO3对琥珀酸发酵的影响相似。当Na2CO3和NaHCO3作为PH值调节剂时; 琥珀酸产量和菌体生物量均较低；当CaCO3作为PH值调节剂时，菌体生长较 好，但琥珀酸产量较低。而当以MgCo3作为PH值调节剂时城珀酸产量最高， 分别为6.36 g/L和7.51 g/L；琥珀酸产率分别为21.20%和25.03%。但是菌体生 物量不及CaCO3作为PH值调节剂时高。力口入Na2CO3和NaHCO3中和有.机酸，由于Na2CO3和NaHCo3溶在发酵 液中会使发酵液的PH值维持在8-10左右，而且过量的Na+

9、也不利于产城珀 酸菌的生长。加入MgCO3中和发酵所产生的有机酸，整个发酵过程菌体代谢旺 盛，发酵效果较佳。本实验不同PH值调节剂在琥珀酸发酵过程中的作用与文献 报道的相似，且反应过程中MgCO3可以释放出CO2,维持琥珀酸发酵所需的 CO2环境。另外，Mg2 +在维持细胞新陈代谢方面起重要作用，且Mg2+是磷 酸烯醇式丙酮酸竣化酶的一种辅助因子,对代谢流的分布起着关键的作用O因此， 当分别以葡萄糖和木糖作为碳源发酵时，均选定MgCO3作为发酵过程的PH值 调节剂。3.5 培养基中MgCO3用量对菌体生长及发酵琥珀酸产量的影响在琥珀酸发酵过程中，有机酸的积累会导致发酵过程中PH值下降，因此维

10、持发酵体系内PH值的稳定至关重要。不同质量浓度MgCO3对琥珀酸发酵的影 响见图7。不管是以葡萄糖还是木糖为碳源，均为MgCo3用量为30 g/L时，菌 体生长最好，琥珀酸产量最高，分别为6.36 g/L和7.51 g/L,琥珀酸产率分别为 21.20%和25.03%oMgCO3用量可能影响代谢流分布。当MgCO3用量低于30 g/L 时，随着MgCo3用量的增加，流向琥珀酸的代谢流增加。但是当MgCo3用量 高于30 g/L时;过量的MgCO3对菌体造成抑制。MgCO3不仅是琥珀酸的合成 来源，也是影响厌氧代谢流向的重要因素。结论本研究筛选获得1株尚未被报道的产琥珀酸菌弗格森埃希菌，且利用

11、木糖发酵获得的琥珀酸产量高于葡萄糖。该菌株利用葡萄糖产城珀酸的最佳工艺 条件为发酵时间24 h、发酵温度40 C、接种量2.5%、PH值调节剂MgCo3、 MgCO3用量30 gL,在该条件下所得琥珀酸产量为6.36 gL,比优化前提高了 41.96%；利用木糖产琥珀酸的最佳工艺条件为发酵时间66 h、发酵温度37 C、 接种量7.5%、PH值调节剂MgCo3、MgCO3用量30gL,在该条件下所得琥珀 酸产量为7.51gL,比优化前提高了 42.50%。研究为进一步利用该菌株以木质纤 维生物质原料（水解后主要含有葡萄糖和木糖）生产琥珀酸提供参考。琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂专利技术综述图2 S

12、I)Hl专利申请趋势图 AOIN AOIP 0)71) , AolC 6IKM C07C AOK； COM； Ml60Q B27K CI2N 6000。利数件摘要：琥珀酸脱氢酶抑制剂是甲氧基丙烯酸酯类和三噗类之后的第三大类 杀菌剂，化合物结构比较新颖、具有较高生物活性、可用于多种真菌病害防治， 同时兼具提高农作物产量和品质的功能。本文通过分析其申请量趋势、主要来源 国/地区、专利分布等方面对琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂进行了梳理和分析， 以期为琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂研发和应用提供理论支撑。关键词：琥珀酸脱氢酶抑制剂;杀菌剂;专利Abstract： Succinate dehydrogenas

13、e inhibitors are the third largest class of fungicides after methoxyacryIates and triazoles. The compound has a relatively novel structure, high biological activity, and can been used for the prevention and control of a variety of fungal diseases. It has the function of improving the yield and quali

14、ty of crops. This article sorts out and analyzes succinate dehydrogenase inhibitor fungicides by analyzing their application volume trends , main source countries/regions, patent distribution, etc., with a view to the research and development and application of succinate dehydrogenase inhibitor fung

15、icides provide theoretical support.Keywords： succinate dehydrogenase inhibitor; fungicide; patent1琥珀酸脱氢酶抑制剂简介琥珀酸脱氢酶抑制剂简称SDHIs类杀菌剂，是新划分出来的一类作用机制 和抗性机理相似的化合物。“酰胺”是琥珀酸脱氢酶抑制剂的重要特征之一，其化 学结构中主要包含竣酸部分、酰胺键部分和胺部分。具有代表性的SDHIs类杀 菌剂如图1所示。SDHIs类杀菌剂作用靶标为蛋白复合体H ,通过抑制病菌的呼吸链电子传递 系统，从而抑制病菌的生长，达到有效防除病害的目的1。SDHIs杀菌剂具有较

16、广的杀菌谱，可用于多种农作物、多种真菌病害的防治， 如水稻纹枯病、小麦锈病、葡萄灰霉病、玉米赤霉病和小麦白粉病等。但是目前 已知的SDHIs类杀菌剂中，均没有对卵菌具有较高防治效果的上市产品，因此 开发出可以防治作物卵菌病害的新SDHIs类杀菌剂品种，是非常值得研究的方 向之一 2-3。1.1发展脉络萎锈灵是由美国有利来路（现科聚亚）公司于1969年开发的第一个商品化 的靶向琥珀酸脱氢酶抑制剂，具有较好的内吸传导性生物活性，一般用于种子处 理以及叶面喷雾处理;种子处理用于防治麦类作物的禾谷类黑穗病，叶面处理用 于禾谷类作物锈病的防治。要锈灵的出现也是杀菌剂从保护性杀菌剂向内吸性毅 菌剂转变的标

17、志之一。经过50多年的发展，琥珀酸脱氢酶抑制剂的杀菌谱不断 扩展，目前已经广泛用于大田农作物、水果、蔬菜、经济作物以及观赏类作物病 害的预防和治疗。1975年，以萎锈灵为起点，美国有利来路公司成功合成出氧化萎锈灵，主 要用于禾谷类作物锈病的防治。此后，国外很多农药公司开始琥珀酸脱氢酶抑制 剂的研发。1981年，日本组合化学成功开发了灭锈胺;1986年，日本农药公司开 发出了氟酰胺;1986年，巴斯夫成功开发出了麦锈灵;1997年，住友化学开发出了 映此菌胺;前期开发的琥珀酸脱氢酶抑制剂多数用于种子处理，其杀菌谱比较窄。 由孟山都公司于1997年成功开发出的曝吠酰胺，它具有比较强的内吸传导性活

18、性，并具有较长的持效性，针对很多农作物病害都有良好的防治效果，是被用于 防治水稻纹枯病的药剂之一。2003年，巴斯夫创制第一个具有广谱杀菌活性的SDHIs杀菌剂咤酰菌胺， 其几乎对于所有类型的真菌病害都有显著地防效，主要用于白粉病、叶斑病、褐 腐病、灰霉病、菌核病等农作物病害的防治，并且对其他药剂已产生抗性的菌株 也有效。随后，巴斯夫公司在对咤酰菌胺基础上进一步开发出了氟喋菌酰胺，同样具 有很好的预防和治疗活性，具有广谱的抗真菌病害效果，可用于谷类作物、油料 作物、豆类蔬菜和花生等。2010年后SDHlS类杀菌剂得到充足的发展，相继出 现了氟哇环菌胺（2011年由先正达研发）、联苯口比菌胺（2011年由拜耳研发）、 氟喋菌苯胺和氟哦菌酰胺（2012年由拜耳研发）、苯并烯氟菌哇（2012年由先正 达研发）、异丙睡菌胺（2015年由日本石原研发）、氟喋菌酰羟胺（2016年由先 正达研发）、Pyraziflumid （2018年由日本农药研发）及isoflucypram （2020年由 拜耳研发）等。2017年，华中师范大学课题组成功得到了广谱性农药候选化合物氟苯酸酰 胺以及氯苯酸酰胺，可用于水稻纹枯病防治的。如今琥珀酸脱氢酶已经是杀菌剂 领域不可忽视的重要靶标之一 3-4。