分析化学系列课件紫外可见分光光度法学习课件(PPT课件).ppt

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1、紫外-可见分光光度法,Ultraviolet and Visible Spectrophotometry;UV-vis,分析化学系列课件,第11章 紫外-可见分光光度法,紫外-可见分光光度法简介11.1 紫外-可见吸收光谱的基本概念11.2 紫外-可见分光光度法的基本原理 11.3 紫外-可见分光光度计11.4 定量分析方法11.5 定性及结构分析,（7学时),引言,紫外-可见光区的波长范围,200400nm,UV-vis的特点和应用,特点：电子光谱，强度大 灵敏度高，10-710-4 g/mL 准确度0.20.5%应用：定性分析：定性鉴别、纯度检测定量分析：单组分、多组分(计算分光光度法)结

2、构分析：共轭体系信息,11.1 紫外-可见吸收光谱的基本概念,11.1.1 跃迁类型 11.1.2 紫外-可见吸收光谱中的常用术语11.1.3 吸收带及其与分子结构的关系11.1.4 影响吸收带的因素,11.1.1 跃迁类型,能在紫外光区产生吸收的有机化合物：不饱和且具有共轭系统,*,含杂原子的不饱和基团,远紫外区(max150nm),含杂原子饱和基团,饱和烃C-C单键,近紫外区,跃迁几率大，max104，强吸收,跃迁几率小，max102，弱吸收,C=C,（共轭）,远近紫外交界处,n*,n*,*,E,example,回主目录,分子中价电子能级及跃迁示意图,成键,反键,E,轨道和轨道示意图,+,

3、+,+,+,+,+,*,*,共轭双键的离域作用,；E,回主目录,电荷迁移跃迁,配位场跃迁,4、5周期过渡金属元素镧系、锕系元素d轨道和f轨道分裂d-d跃迁和f-f跃迁必须在配体的配位场作用下才能产生,几种常见的紫外-可见吸收光谱位置,*,n*,*,n*,回主目录,课堂练习,CH2=CH CH2CH2OCH3；上述两个分子能产生哪些类型的电子跃迁？*跃迁、*跃迁、n*跃迁*跃迁、*跃迁、n*跃迁有哪些生色团和助色团？生色团：C=C；助色团：OCH3生色团：苯环、C=O,11.1.2 紫外-可见吸收光谱中的常用术语,吸收光谱的特征生色团和助色团 红移与蓝(紫)移增色效应和减色效应强带和弱带,回主目

4、录,吸收光谱(absorption spectrum)的特征,吸收峰,吸收峰,谷,谷,末端吸收(end absorption),回主目录,吸收光谱的特征,吸收峰的数目取决于分子结构中不饱和基团的种类吸收峰的位置(max)取决于电子能级差吸收峰的强弱(max)取决于电子跃迁几率,回主目录,回主目录,生色团和助色团,生色团(chromophore)：*、n*助色团(auxochrome)：n*,红移(red shift)长移(bathochromic shift),增色效应或浓色效应(hyperchromic effect),example,11.1.3 吸收带及其与分子结构的关系,E1,E2,波

5、长较长 弱吸收,强吸收,中强吸收,芳香族化合物特征吸收,300,210250,230270重心256,max100（弱带）,max104（强带）,200,共轭*,n*,芳环共轭*,杂原子不饱和基团,共轭双键,芳环,回主目录,芳环的离域大键,芳环C=C骨架振动及环内*,example,B带和E带,苯的B带吸收光谱,苯蒸气,苯的乙醇溶液,苯异丙烷溶液的紫外吸收光谱,B带,E1带,E2带,苯乙酮的紫外吸收光谱,B带,R带,278,319,1100,50,B带,R带,苯乙酮的吸收带,lg,E2带,?,K带,回主目录,11.1.4 影响吸收带的因素,位阻影响跨环效应溶剂效应pH影响,共轭系统共平面性共轭

6、效应 max（短移），,溶剂极性 K带长移，R带短移,二苯乙烯顺反异构体的紫外吸收光谱,顺式,反式,位阻影响,溶剂效应,溶剂极性,(n*),K带长移R带短移,(*),*,非极性溶剂,极性溶剂,*,E非,n*,极性溶剂对两种跃迁能级差的影响,E极,非极性溶剂,*,n,极性溶剂,E非,E极,11.2 基本原理,11.2.1 Lambert-Beer定律11.2.1-1 Lambert-Beer定律数学表达式11.2.1-2 系光吸数11.2.2 偏离Beer定律的因素,11.2.1 Lambert-Beer定律,截面积S,厚度l,断层dl，含dn个吸光质点,含n个吸光质点的吸光介质,Ix,I0,I

7、,dS=kdn,入射光强,透射光强,Lambert-Beer定律公式推导,dS/S=(kdn)/S,n=VC，S=V/l,n/S=l C,Lambert-Beer定律的数学表达式,-lg(I/I0)=ECl,透光率(transmitance)：T=I/I0,吸光度(absorbance)：A=-lgT,Lambert-Beer定律：当一束平行单色光垂直通过均匀的非散射吸光物质溶液时，其对光的吸光度与溶液的浓度及厚度成正比，A=ECl。,定性和定量的参数,吸光系数(absorptivity),摩尔吸光系数(/EM)百分吸光系数(),C=1mol/L,C=1g/100ml,mol/L,g/100m

8、l,分子结构研究,含量测定,两种吸光系数的区别,两种吸光系数的换算关系：,C=2.00mg/100ml=0.002g/100ml,A=ECl,氯霉素(M=323.15)的水溶液，用纯品配制100ml含有2.00mg的水溶液，=278nm,l=1cm,A=0.614，求、。,吸光系数（计算示例）,11.2.2 偏离Beer定律的因素,吸光度(A)与浓度(C)关系曲线,11.2.2-1 化学因素11.2.2-2 光学因素11.2.2-3 透光率测量误差,11.2.2-1 化学因素,离解：,max350nm,450nm,max375nm,缔合：,溶剂化：,减免：控制一定的实验条件（稀溶液、pH范围、

9、溶剂等）,I2,CCl4紫色C2H5OH绿色,来源：n=VC,偏离Beer定律的因素：化学因素（图）,水溶液中Cr()两种离子的吸收曲线,亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱,Cr2O72-350nm,Cr2O72-450nm,CrO42-375nm,C=6.3610-6 mol/L(单体)660nm,C=1.2710-4 mol/L(二聚体)610nm,C=5.9710-4 mol/L,11.2.2-2 光学因素,非单色光杂散光(stray light)散射光和反射光非平行光,谱带宽度(band width,S),末端吸收处产生假吸收,溶液混浊,空白对比,实际光程l A,11.2.2-3 透光率的测

10、量误差(T),来源：仪器噪音(noise)性质：随机误差种类：,暗噪音(dark noise)散粒(讯号)噪音(signal shot noise),暗噪音与迅号噪音的误差曲线,暗噪音,迅号噪音,测量最适宜范围：A=0.20.7(或T=2065%),11.3 紫外-可见分光光度计,11.3.1 主要部件11.3.2 常见光路类型11.3.3 一般光学性能,11.3.1 紫外-可见分光光度计的主要部件,光源：提供能量激发被测物质单色器：将来自光源的连续光谱按波长顺序色散，并从中分离出一定宽度的谱带，获得所需单色光吸收池：盛放溶液并提供一定吸光厚度检测器：检测光讯号，并将光讯号转变为电讯号讯号处理

11、及显示器：迅号放大、数学换算,11.3.2 紫外-可见分光光度计的光路类型,单光束分光光度计,光栅,吸收池,特点：一束单色光,要求：光源稳定 校零,双光束分光光度计,光栅,扇面镜,参比池,样品池,I0,I,I0,扇面镜,优点：减免光源不稳误差；改变波长不需校零；T=I/I0缺点：不适于浑浊溶液的测定,特点：两束同波长单色光,双波长分光光度计,单色器1,单色器2,样品池,A=A1-A2,1,2,特点：两束不同波长单色光,优点：无需参比；可测浑浊溶液；可得一阶导数光谱,双重单色器分光光度计,光多道二极管阵列检测器分光光度计,特点：经先后两次分光优点：单色光较纯，杂散光降得很低(0.001%),特点

12、：多个二极管阵列紧密排列作为检测器 优点：扫描时间极短，1/10秒内完成一张紫外-可见全光光谱,11.4 UV-vis定量分析方法,11.4.1 单组分定量分析方法11.4.2 多组分定量分析方法11.4.3 光电比色法,11.4.1 单组分定量分析方法,测定波长的选择原则,吸光系数要大（max）尽可能不选末端吸收尖峰/平坦峰测定波长溶剂截止波长,A尖,A平,11.4.1-1 吸光系数法,适用：单色光较纯，符合Beer定律方法：绝对法：,比较法：,UV-vis单组分定量分析方法：吸光系数法（例题）,例1:VB12 max 361nm:E1%1cm=207,A=0.414,l=1cm，求C=？,

13、g/100ml,例2:样品VB1225.0mg1000ml，max 361nm：A=0.507，l=1cm，求VB12(%)=?,C=25mg/1000ml=0.0025g/100ml,=20g/ml,11.4.1-2 校正/标准/工作曲线法,适用：单色光不纯，不完全符合L-B定律（曲线不过零点，线性稍差）方法：,标准序列,固定条件,AC曲线,样品,同上条件,Ax,Cx,曲线,回归方程：A=ElC=KC,Ax,校正曲线法示意图,Cx,UV-vis单组分定量分析方法：校正曲线法（例题）,例3:芦丁的含量测定:标准品(0.200mg/ml)05ml25ml 样品3.0mg25ml,0.710mg/

14、25ml,0.845,回归方程：A=0.0105+1.162C(r=0.9996),11.4.1-3 对照法（外标一点法）,适用：线性关系较好要求：相同测定条件 Cs与Cx相近方法：,对照法示意图,As=ECsl；Ax=ECxl,UV-vis单组分定量分析方法：对照法（例题）,例4:VB12的含量测定VB12注射液：2.50mL10.00mL对照品溶液：25.00mg 1000mLmax 361nm:l=1cm,Ax=0.508,As=0.518,求C=?,对照法：,吸光系数法：,C=98.2mg/L,C=0.00982g/100ml=98.2mg/L,UV-vis测定一元弱酸HA的Ka,酸式

15、体：AHA=HAC,碱式体：AA-=A-C,A=AHA+AA-=HAHA+A-A-,UV-vis测定一元弱酸HA的Ka（例题）,例5:吸光度法求VB6的pKaVB625mg100ml贮备液，l=1cm，,pH=2:酸式体,max 230375nm,pH=7:碱式体,11.4.2 多组分定量分析方法,数值计算,条件：符合Beer定律、满足吸光度加合性、各组分吸收光谱有较大差异数学模型：A=KC方法：图解法（等吸收双波长消去法、系数倍率法）、信号处理方法、矩阵解法,两组分混合物的吸收光谱,吸收峰互不重叠,a、b互不干扰,吸收峰部分重叠,a对b干扰，b对a无干扰,1：A1a单组分定量Ca=A1a/E

16、1al 2：A2a+b=A2a+A2b=E2aCal+E2bCbl,1：A1a单组分定量Ca=A1a/E1al 2：A2b单组分定量Cb=A2b/E2bl,11.4.2-1 等吸收双波长消去法,吸光度加和性,适用：浑浊溶液、吸收光谱重叠的混合组分原理：双波长型分光光度计,A=A2-A1=(21)Cl=KC,干扰组分b：Ab=A1b-A2b=0待测组分a：Aa较大,选择波长1和2的两个基本条件：,吸收峰相互重叠,a、b互有干扰,等吸收双波长消去法示意图（消去b，测定a）,2,1,A1b=A2b,Aa,A=A1a+b-A2a+b,=A1a+A1b-A2a-A2b,=A1a-A2a=Aa=(E1a-

17、E2a)Cal=EaCal=KCa,数学运算：,ACa,UV-vis多组分定量分析方法：等吸收双波长消去法（消a测b）,等吸收双波长消去法示意图（消去a，测定b）,2,1,A1a=A2a,Ab,A=A1a+b-A2a+b=A1a+A1b-A2a-A2b,=A1b-A2b=Ab=EbCbl=KCb,数学运算：,ACb,优点：无需空白参比，可消除本底吸收及浑浊干扰，显著提高测定灵敏度和准确度。,11.4.2-2 系数倍率法,适用：干扰组分无合适等吸收波长或不呈峰形,掩蔽系数K=A1/A2,A=KA2A1=0,优点：待测组分信号同时放大，Ax增大，提高检测灵敏度。,原理：,一般K放大57倍,系数倍率

18、法示意图,待测组分,2,1,A1y,A2y,KA2y,A1y/A2y=K,KA2y=A1y,1：A1=A1x+A1y 2：A2=K(A2x+A2y),干扰组分y：Ay=KA2yA1y=0,A=A2A1=K(A2x+A2y)-(A1x+A1y)=KA2x-A1 x+(KA2y-A1y),=AxCxl=(KE2x-E1 x)Cxl=KCx,干扰组分,=,ACx,11.4.2-3 导数光谱法（数学变换）,应用：定性鉴别、结构分析及痕量测定原理：A=f()C一阶导数光谱(A/-)：(A/)i=(Ai+1Ai)/(i+1-i)二阶导数光谱(2A/2-)：2A/2=(A/)/,导数光谱：对普通光谱原函数求

19、导所得图象。,导数光谱的特点,零阶光谱的极大在奇数阶为0，偶数阶为极值（极大、极小交替出现）。,导数光谱的优点：突出特征，增加信息量，分辩率提高，消除杂质干扰。,零阶光谱的拐点，在奇数阶为极值，偶数阶为0。,阶数n增高，极值数目增加(n+1)，峰形尖锐，分辨率增高。高频信号随导数阶数增高而增大；低频信号（干扰组分）反之通过对吸收曲线求导，消除干扰。,极大,极大,0,0,极小,拐点,极小,极大,0,0,导数光谱的定量原理,导数光谱法对干扰吸收的消除,比尔定律：A=C(l=1cm),一阶导数：dA/d=(d/d)C二阶导数：d2A/d2=(d2/d2)C三阶导数：d3A/d3=(d3/d3)C,导

20、数信号C,A=C0+C1+C22+C33+Cnn,A=C1+C2+C32+C43+Cnn-1,微分级数消除阶次较低的背景干扰,微分,对求导,吸光系数在特定波长下的变化率,导数光谱定量数据的测量方法,采用导数光谱上适宜振幅作为定量信息,导数光谱的求导,定量方法：标准对比法求导条件：单色光的谱带宽度(狭缝宽)；波长间隔,p.峰谷法,d.基线法(正切法),z.峰零法,导数阶数：二至五阶。阶数分辩率抗干扰性S/N。奇数阶导数光谱易分辨，利于鉴别；偶数阶导数光谱易得到极值，利于测定。,导数光谱分析示例,导数光谱法检定乙醇中痕量苯,定性鉴别,定量分析,空白醇的吸收光谱,醇中含苯1ppm的吸收光谱,醇中含苯

21、10ppm的吸收光谱,醇中含苯10ppm的二阶导数光谱,醇中含苯10ppm的四阶导数光谱,含苯胺和苯酚5ppm的吸收光谱,含苯胺和苯酚5ppm的四阶导数光谱,FNC(苯胺),DCC(苯酚),导数光谱法测定废水中苯胺和苯酚的含量,11.4.3 光电比色法,显色反应的类型：配位反应、氧化还原反应、缩合反应、重氮化偶合反应显色反应的要求化学计量关系确定组成恒定，化学性质稳定选择性好(max60nm)试剂和产物的吸收区别明显(max60nm)灵敏度高(=103105),可见分光光度法：对能吸收可见光的有色溶液进行测定的方法。,光电比色法的显色反应条件,试剂（显色剂）：灵敏度、稳定性、选择性,用量：一般

22、过量；影响产物组成,NH4SCN作显色剂测Fe3+：0.01mol/L：Fe3+SCN-Fe(SCN)2+淡红色 0.1mol/L：Fe3+2SCN-Fe(SCN)2+淡血红色0.2mol/L：Fe3+4SCN-Fe(SCN)4-血红色,溶剂,控制：条件实验(A-C),影响物质对光的吸收显色反应产物稳定性控制：有机溶媒可提高生成物稳定性,酸碱度,酸度过大：影响配合物离解酸度太小：金属离子水解沉淀不同pH范围：生成配合物颜色不同控制：条件实验(A-pH)；缓冲溶液,时间,时间太短：反应不完全时间太长：有色配合物再次分解控制：条件实验(A-t),温度,影响反应速度合适温度：促使正反应迅速完全；防止

23、副反应发生控制：条件实验(A-T),UV-vis定量分析方法小结,单组分定量分析方法吸光系数法校正曲线法对照法多组分定量分析方法双波长法导数光谱法光电比色法,（单色光较纯）,（单色光不纯）,（线性关系较好）,（等吸收双波长消去法、系数倍率法）,（显色反应条件）,UV-vis定性及结构分析,定性鉴别的一般方法（光谱比较法）纯度检测方面的应用 有机化合物结构研究,UV-vis定性鉴别,定性鉴别的依据：,吸收峰数目吸收峰位置max吸收峰强弱max吸收光谱形状,吸收光谱的特征,定性鉴别的一般方法：标准对比法,比较光谱特征数据max、min、sh 比较A（或max）的比值比较光谱一致性,对比吸收光谱特征

24、数据,安宫黄体酮(M=386.53),炔诺酮(M=298.43),max=2401nm,max=2401nm,3,3,4,4,对比吸光度（或吸光系数）比值,适用：存在几个吸收峰的样品，可消除仪器、浓度、厚度或其它原因造成的误差。,V-B12鉴别：max=278、361、550(nm)中国药典规定：A361/A278=1.71.88 A361/A550=3.153.45,对比吸收光谱的一致性,三种甾体激素的紫外吸收光谱(10g/ml甲醇溶液）,醋酸泼尼松,醋酸氢化可的松,醋酸可的松,杂质检查,UV-vis纯度检测,吸收峰位置：化合物无吸收杂质有吸收检出吸光系数变化：,化合物强吸收,吸收光谱变形,

25、杂质无(弱)吸收吸光系数杂质吸收更强吸光系数,杂质限量检测,吸光度上限值,肾上腺素与肾上腺酮的紫外吸收光谱,max=310nm,肾上腺酮,肾上腺素,峰谷吸光度比值,药典规定：C=2mg/ml,l=1cm,max=310nm,A0.05,杂质,吸收峰处无(弱)吸收,吸收谷处有吸收,UV-vis结构研究简介,有机化合物的紫外吸收光谱,饱和碳氢化合物：*，短，远紫外区,不饱和脂肪族化合物,孤立双键：CH2=CH2(max=193nm)共轭双键：CH2=CHCH=CH2(max=220nm,104),EE,最低占有轨道,最高空轨道,跃迁几率,C=C 共轭 C=C,(*),;E,含孤立助色团和生色团的饱

26、和有机化合物,孤立助色团：n*跃迁，长孤立生色团：n*(275295nm),n*(190nm),*(150180nm),、-不饱和醛、酮、酸和酯,共轭C=C：K带(max=200260nm，104)C=O：R带(max=310350nm，100),共轭K带、R带都长移,酸、酯的K带比醛、酮长移得多 酸、酯的R带比醛、酮长移得少,芳香族化合物,苯和取代苯,苯,取代吸收带长移，B带精细结构消失,单取代苯,助色团取代：n*共轭，E带、B带生色团取代：E带和K带合并，B带，有时被K带掩盖 C=OR带极性溶剂,不同溶剂对苯酚吸收光谱的影响,环己烷,己醇,NaOH(0.1mol/L),双取代苯,各种取代基

27、长移效应强弱次序：邻、对位定位基：N(CH3)2NHCOCH3O-NH2OCH3 OHBr Cl CH3间位定位基：NO2CHOCOCH3COOHCOO-,CN-SO2NH2NH3+,对位二取代,200nm,381nm，=181nm52+30=82nm,265nm，只比硝基苯(252nm)长13nm,邻、对位基,间位基,252nm,=52nm,230nm,=30nm,邻、间位二取代,317.5nm 273.5nm 278.5nm,芳杂环类（五元或六元）：饱和：200nm不饱和：n*、*,推断官能团（可能性）,有机化合物分子结构研究,220800nm无吸收峰：脂肪族饱和化合物或仅含一个双键的烯烃

28、 270350nm弱吸收：羰基 250300nm中等强度吸收，重心256nm：苯环210250nm强吸收：含有两个双键的共轭系统 260350nm强吸收：35个共轭系统 化合物有色：共轭生色团5吸收峰延伸至可见光区：长链共轭或稠环化合物,推断构型和构象,结构异构体,松香酸,左旋松香酸,S-trans构型,S-cis构型,max(nm)283 273 max 15100 7100,顺反异构体,maxEtOH(nm)280 295.5max 10500 29000,顺式：短，小 反式：长，大,位阻效应,确定构象,互变异构现象,max 247nm 310nm,max(直立键）max(平伏键）,共轭,

29、推断化合物骨架,紫外吸收光谱一致：具有相同的生色团,VK1 1，4-萘醌,max(nm)249，260，325 250，330lg 4.28，4.26，3.28 4.6，3.8,推断化合物结构,水合氯醛可能有两种结构：,R带，290nm,UV-vis重点内容小结,掌握,基本概念：电子跃迁类型、生色团与助色团、透光率与吸光度基本理论：吸收带类型、特点及影响因素Lambert-Beet定律的物理意义、数学表达式及偏离因素吸光系数的物理意义、表达形式及其相互关系和有关计算紫外-可见分光光度法单组分定量的各种方法,紫外-可见分光光度计的基本部件、工作原理及光路类型紫外-可见分光光度法多组分定量方法用紫外吸收光谱进行定性鉴别及纯度检测的各种方法,熟悉,光电比色法的原理及应用紫外吸收光谱与有机物分子结构的关系,了解,