生物化学教材.pptx

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1、生物化学教材,内容,第一章：糖类的结构与性质第二章：脂类的结构与性质第三章：氨基酸（重点）第四章：蛋白质的结构与性质（重点）第五章：酶（重点）第六章：维生素、抗生素与激素第七章：代谢概况、生物能学、生物膜与物质运输第八章：糖酵解（重点）第九章：三羧酸循环（重点）,内容,第十章：电子传递与氧化磷酸化（重点）第十一章：HMP途径、糖异生、乙醛酸循环（重点）第十二章：寡糖、糖原的代谢第十三章：脂肪酸代谢（重点）第十四章：氨基酸代谢第十五章：核苷酸代谢第十六章：光合作用与生物固氮第十七章：核酸分子生物学（重点）第十八章：基因工程,第一章：糖类的结构与性质,内容,一、糖类概况 二、糖的旋光性 三、单糖（

2、结构、性质、代表性单糖及衍生物）四、寡糖 五、复合糖（糖胺聚糖、蛋白聚糖、糖蛋白）六、糖链结构分析,糖类,寡糖,多糖,同多糖,杂多糖,复合糖,单糖,什么是糖类？,基本概念,异构 旋光异构 不对称碳原子 对映体 构型 构象 异头物 糖苷 还原糖判定异构：化合物具有相同的分子式，但原子连接次序或原子空间排布不同。构型：具有相同的分子式和结构式，但原子在空间的排布不同，称之构型。旋光异构：由于存在手性碳（不对称碳原子）而具有旋光性,不对称碳原子：与四个不同的原子或基团相连并因此失去对称性的四面体碳。用C*表示。,对映体 一个不对称碳原子的取代基在空间里的两种取向是物体与镜像的关系，并且两者不能重叠。

3、这两种旋光异构体称为对映体。两个对映体具有程度相同但方向相反的旋光性（D+与L-;D-与L+）和不同的生物活性，其他物理和化学性质完全相同。含n个C*的化合物，其旋光异构体的数目是2n,组成2n/2对对映体。任一旋光化合物都只有一个对映体，它的其他旋光异构体在理、化性质都与之不同，不是对映体的旋光异构体称非对映体。仅一个手性碳构型不同的非对映体称差向异构体（有几种情况）。异头物 单糖由直链结构变成环状结构后，羰基碳成为新的手性碳（异头碳），导致C1差向异构化，产生两个非对映体，称之。、异头物判断：有2种方式。见P9-10。,异构,结构异构（结构式）,立体异构,旋光异构（不对称碳原子）,几何异构

4、（顺反异构，双键或环）,糖的构型,D、L构型（最远手性碳与甘油醛比较）,RS构型（手性碳取代基优先性旋转）,糖的立体结构表示,Fischer投影式（线形）,Haworth式（环式）,吡喃型,呋喃型,透视式,注意：糖的构型（D、L）与旋光方向（+、-）并无直接联系。,单糖性质,异构化,氧化（重点：高碘酸氧化）,还原,成酯、成醚（酰基化、甲基化反应）,形成糖苷（重点）,高碘酸氧化：糖中邻二羟基间的C-C键被断裂，形成二醛基，继而有一个醛基被氧化成甲酸。测定聚合度、分支点数目和糖苷键位置；,糖苷（键）：环状单糖的半缩醛或半缩酮羟基与另一化 合物发生缩合形成糖苷；糖苷键有O-苷、N-苷、S-苷等；糖苷

5、是缩醛，无醛的性质。,重要的糖,单糖：甘油醛、二羟丙酮、D-核糖、Glc、Gal、Fru、GlcUA、GlcA、Fuc、GlcNAc、MurNAc、N-NeuNAc、Sia,寡糖：蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖,多糖：,同多糖：淀粉、纤维素、糖原、几丁质,糖胺聚糖（透明质酸、硫酸角质素）、蛋白聚糖,杂多糖：,细菌多糖（肽聚糖、脂多糖、磷壁酸）,糖蛋白：糖肽键（N、O型）；糖链（寡糖链，具重要功能）,-淀粉酶、-淀粉酶!,糖链结构分析（重点）：以糖蛋白为例,分离纯化糖蛋白,从糖蛋白释放糖链,糖链的分离纯化,化学法,酶法,N-糖苷酶F,O-糖苷酶,HPAEC-PAD,凝集素亲和层析,GPC,糖链的纯

6、度鉴定与相对分子量测定,单糖组成的测定,完整糖链的测序,糖链结构测定的常用方法,高碘酸氧化,甲基化分析：甲醚基 糖醇 乙酰化,寡糖顺序降解,化学法,测定直链多糖的聚合度和支链多糖的分支数目,确定糖苷键的位置,酶法,外切糖苷酶：从糖链非还原端,内切糖苷酶：从糖链内部,本章需掌握的知识点1、单糖构型的判定；、异头物的判定；2、糖的甲基化、酰基化、高碘酸氧化、硼氢化钠还原；3、糖苷键形成；4、重要糖的结构；5、糖链分析方法；本章习题：,本 章 主 要 内 容 一、什么是脂质？二、脂肪酸 三、三酰甘油 四、脂质过氧化 五、磷脂 六、糖脂 七、萜和类固醇 八、脂蛋白 九、脂质的提取、分离,第二章：脂类的

7、结构与性质,具 体 问 题 1、什么是蜡？2、生物膜中脂双层的结构 3、脂肪酸简写符号及代表性的脂肪酸 4、人体必需脂肪酸与多不饱和脂肪酸家族 5、前列腺素与阿司匹林 6、磷脂酸、甘油磷脂与鞘磷脂的结构与极性；鞘糖脂的结构 7、卵磷脂、脑磷脂、心磷脂；神经酰胺与脑苷脂、神经节苷脂 8、磷脂酶的分类及作用部位 9、胆固醇的结构及其衍生物 10、血浆脂蛋白的结构、分类与功能,上一页,脂质的分类,化学组成,单纯脂质,复合脂质,衍生脂质,取代烃,固醇类,萜,其它,皂化性质,可皂化脂质,不可皂化脂质,极性,极性脂质,非极性脂质,生物功能,储存脂质,结构脂质,活性脂质,上一页,脂质：是一类微溶于水而易溶于

8、非极性溶剂的有机分子，大多数是脂肪酸和醇所形成的酯类及其衍生物。两亲化合物：具有极性头部（亲水）和非极性尾部（亲脂）的分子称之。必需脂肪酸：亚油酸和亚麻酸对人体功能必不可少，但必须由膳食提供，称之。碘值：指100g油脂卤化时所能吸收碘的克数。,重要概念,上一页,脂质过氧化：一般是指多不饱和脂肪酸或多不饱和脂质的发生自动氧化产生过氧化物的现象，它是典型的活性氧参与的自由基链式反应；活性氧：指氧或含氧的高反应活性分子，如超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢、单线态氧等的统称；,上一页,脂 肪 酸 概 况,脂肪酸的种类及简写符号：分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸；偶数碳与奇数碳脂肪酸

9、（奇数碳脂肪酸含量极少！）；简写符号用碳数：双键数双键位号(含顺反式)表示，如18：2 9c,12c。多不饱和脂肪酸家族：分为-3和-6系列（指离羧基最远的双键到甲基末端3个碳和6个碳）。如亚油酸和-亚麻酸为-6系列，而-亚麻酸为-3系列。人体内二者不能互转！且二者对血脂的影响不同。见89页表格。,三酰甘油的化学性质,水解与皂化（皂化值）,氢化和卤化（碘值）,乙酰化（含羟基，乙酰化值）,酸败与自动氧化（酸值）,皂化值：皂化1g油脂所需的KOHmg数；碘值：100g油脂卤化时所吸收的碘的克数；乙酰值：中和1g乙酰化物所释放的乙酸所需要的KOHmg数；酸值：中和1g油脂中的游离脂肪酸所需的KOHm

10、g数,重要的脂质,磷脂,甘油磷脂,鞘磷脂,卵磷脂,脑磷脂,脂肪酸,必需脂肪酸（亚油酸、亚麻酸）,DHA EPA（-3系列）,花生四烯酸（衍生物为类二十碳烷：如前列腺素等）,心磷脂,鞘糖脂,鞘脂类,神经酰胺,鞘胺醇,神经节苷脂,脑苷脂,磷脂酸,饱和脂肪酸：月桂酸、软、硬脂酸、花生四烯酸,萜和类固醇,萜：由两个或多个异戊二烯单位组成；如类胡萝卜素为四萜；单萜、倍半萜等。类固醇：即甾类，环戊烷多氢菲衍生而来；,胆固醇衍生物,激素：5类,胆汁酸,维生素D,脂蛋白：由脂质和蛋白质以非共价键结合而成的复合物，血浆可分为乳糜微粒、VLDL、IDL、LDL、HDL五类；血浆脂蛋白的结构与各自的功能！,其它,胆

11、固醇的结构与极性！,上一页,第3章：氨基酸（重点）,氨基酸分类 氨基酸的酸碱性质 氨基酸的化学反应 氨基酸混合物的分离,知识点,氨基酸：是蛋白质的构件分子，具有酸碱性质、手性、聚 合能力、特定的侧链结构及多样的化学反应；兼性离子：指氨基酸分子含有一个正电荷和一个负电荷的形式。在氨基酸晶体中或中性水溶液中以兼性离子形式存在；等电点：指氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的pH。等电点与离子浓度无关，只决定于等电兼性离子两侧的pKa值；,氨基酸类别,非蛋白质氨基酸,蛋白质氨基酸（20种）,酸性氨基酸,天冬氨酸,谷氨酸,碱性氨基酸,赖氨酸,组氨酸,精氨酸,中性氨基酸,极性氨基酸,非极性氨基酸,丝氨酸

12、,苏氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰氨,谷氨酰胺,甘氨酸,丙氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,苯丙氨酸,甲硫氨酸,色氨酸,脯氨酸,颉氨酸,氨基酸的酸碱性质,根据酸碱质子理论，HA A-H+氨基酸是两性电解质，既是质子供体，又是质子受体。当氨基酸完全质子化时，可看作是多元酸；COOH和NH3+可以发生解离，用Ka表示它们的解离常数；在氨基酸溶液中，pH值计算公式如下：pH=pKalg（质子受体/质子供体）当pH大于等电点时，氨基酸带净负电荷；当pH小于等电点时，氨基酸带净正电荷！在一定的pH范围内，氨基酸溶液的pH离等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈大。,氨基酸的化学反应,-氨基参加的反应,与亚硝酸反应（生

13、成羟基氨基酸和氮气）,与酰化试剂反应（氨基被酰基化而被保护）,烃基化反应,DNFB反应（生成DNP-氨基酸）,PITC反应（生成PTH-氨基酸）,形成西佛碱反应（与醛类化合物）,脱氨基反应,-羧基参加的反应,成盐成酯,成酰氯（与二氯亚砜等）,脱羧基反应,叠氮反应（氨基酸酯与肼、亚硝酸）,-氨基与-羧基共同参加反应,与茚三酮反应（氨与还原茚三酮发生作用生成紫色物质）,成肽反应,侧链R基参加的反应,酪氨酸酚羟基,组氨酸咪唑,精氨酸胍基,色氨酸吲哚基,半胱氨酸巯基,氨基酸的旋光性与光谱性质,氨基酸的旋光性：氨基酸的构型（指-碳）也以甘油醛为参考物，从蛋白质的酸水解或酶水解液中得到的都是L型，但D型氨

14、基酸在自然界也存在；蛋白质用碱水解或有机合成氨基酸时，得到的都是无旋光性的DL-消旋物氨基酸的光谱性质：参与蛋白质组成的20多种氨基酸在可见光区没有光吸收，在红外区和远紫外区都有光吸收，但在近紫外区只有芳香族氨基酸有光吸收；,氨基酸混合物的分析分离,分离方法,柱层析,纸层析（相对迁移率，非极性性质）,薄层层析,离子交换层析（电荷和非极性）,气相层析,高效液相层析,氨基酸洗脱顺序的判定：氨基酸与树脂的亲合力主要决定于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂聚苯乙烯之间的疏水相互作用；亲和力愈大愈难洗脱！,第四章：蛋白质（重点）,蛋白质概况；蛋白质的共价结构；蛋白质的三维结构；蛋白质的结构与功能

15、的关系；蛋白质的分离、纯化与鉴定；,蛋白质概况,蛋白质的化学组成：碳（50%）、氢（7%）、氧（23%）、氮（16%）、硫（0-3%）、其它元素微量；蛋白质的平均含氮量为16%，此为凯氏定氮法测定蛋白质含量的基础。,蛋白质是一类最重要的生物大分子，英文称protein，意为“最原初的，第一重要的”。,分类,单纯蛋白质（如清蛋白、球蛋白、组蛋白、谷蛋白、硬蛋白等）,缀合蛋白质（如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金属蛋白、黄素蛋白等）,分类：按生物学功能可将蛋白质分为酶、调节蛋白、结构蛋白、转运蛋白等等；,分类,分类,纤维状蛋白质（一般不溶于水。典型的有：胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白、肌球蛋白等）,

16、球状蛋白质（可溶性好。典型的有：胞质酶类等）,膜蛋白（与细胞的膜系统结合而存在）,单体蛋白质,（寡）多聚蛋白质,蛋白质结构的层次,构象：指具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种形态；构象形态间的改变不涉及共价键的破裂！每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或三维结构，称之为蛋白质的构象；一个给定的蛋白质可以有多种构象，但只有一种或少数几种在能量上是有利的。,蛋白质的结构,一级结构（即共价结构，指多肽链的氨基酸序列）,二级结构（指多肽链借助氢键形成螺旋和折叠片）,三级结构（指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状结构）,四级结构（指多聚蛋白质的各亚基之间在空间上的相互

17、缔合关系）,蛋白质的一级结构即多肽链的氨基酸序列决定蛋白质的高级结构！,蛋白质的功能：催化、调节、转运、储存、运动、结构组分、支架作用、免疫、异常功能；,蛋白质的共价结构（一级结构）,氨基酸残基 肽（键）蛋白质一级结构的测定 氨基酸序列与生物功能 肽的人工合成,知识点,氨基酸残基：肽链中的氨基酸由于参加肽键的形成因而 不在是原来完整的分子，称为氨基酸残基；两个氨基酸形成一个肽键时失去一分子水，因此失去的水分子数比氨基酸残基数少一个。每个氨基酸残基的平均分子量为110。肽：由两个或多个氨基酸残基通过肽键相连而形成的化合物；肽有寡肽和多肽之分。一条肽链通常在一端含有一个游离的末端氨基，称为N-末端

18、，而另一端含有一个游离的末端羧基称为C-末端；,肽键,具有部分双键的性质,肽键比一般碳-氮单键短,与肽键相连的氢原子和氧原子呈反式构型,肽键不可自由旋转,肽的理化性质：肽键的酰氨氢不解离，肽的酸碱性质主要决定于肽键中的游离末端-NH2、-COOH及侧链R基上的可解离基团；肽中末端-羧基的pKa值比游离氨基酸的大，末端-氨基的pKa值比游离氨基酸的小；游离的-氨基、-羧基和R基可发生与氨基酸中相应的类似反应，如茚三酮反应等；蛋白质部分水解后所得的肽若不发生消旋，则具有旋光性，短肽的 旋光度约等于组成氨基酸的旋光度之和，较长的肽的旋光度则不是简单加和；,活性肽：具特殊的生物学功能的肽段，如脑啡肽、

19、谷胱甘肽、肌肽等；,肽,蛋白质一级结构的测定,测定多肽链的数目,蛋白质测序的步骤,拆分多肽链,断开多肽链内的二硫键,测定每一肽链的氨基酸组成,鉴定多肽链的N-末端和C-末端,裂解多肽链为较小的肽段,测定各肽段的氨基酸序列,利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构,确定二硫键的位置,蛋白质测序的重要方法,N-末端测定,二硝基氟苯（DNFB）法：肽游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-肽，最后水解生成黄色DNP-氨基酸,丹磺酰氯（DNS）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸,苯异硫氰酸（PITC）法：生成PTH-氨基酸，从肽上断裂下来,氨肽酶法：外切酶，但效果不好,C-末端测定,肼解法：测定C

20、-末端的最重要的化学方法，肽与肼反应，除C-末端氨基酸游离外，其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物,还原法：C-末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的-氨基醇,羧肽酶法：最有效、最常用,羧肽酶A,羧肽酶B,羧肽酶C,羧肽酶Y,二硫键的断裂,过甲酸氧化法：将二硫键氧化成磺酸基,巯基化合物还原法：将二硫键还原成巯基，然后用烷基化试剂如碘乙酸保护巯基，防止其重新被氧化,氨基酸组成的测定：,酸水解：是主要方法，多用HCl，同时辅以碱水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破坏，Ser，Thr，Tyr部分破坏，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu；,多肽链的裂解,酶裂解：,胰蛋白酶：专一性强，断裂Lys或

21、Arg的羧基参与形成的肽键,糜蛋白酶：断裂Phe，Trp，Tyr，Leu等疏水氨基酸的羧基端肽键,嗜热菌蛋白酶：专一性差，断裂Val，Leu，Phe，Tyr，Trp等氨基参与形成的肽键,胃蛋白酶：在酸性条件稳定，肽键 两侧均为疏水氨基酸。在确定二硫键位置时，常用到此酶。,其它酶：略,化学裂解：,溴化氰（CNBr）：只断裂Met的羧基形成的肽键,羟氨（NH2OH）：在pH9时，专一性断裂Asn-Gly之间的肽键，其它条件下不专一,肽段的氨基酸测序,Edman化学降解法：用Edman试剂PITC与游离氨基作用生成PTH-氨基酸，并可用各种层析技术分离；用此法降解，一次可连续测出60-70个氨基酸残

22、基的序列；工作量大，操作麻烦；现改用蛋白质测序仪。,酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难,质谱法：质谱仪,由核苷酸序列推定法：mRNA cDNA，推出 cDNA的核苷酸序列，然后推测出蛋白质的氨基酸序列,肽段在肽链中次序的确定：需借助重叠肽。重叠肽：由于不同的断裂方法即断裂的专一性不同，产生的切口彼此错位，使两套肽段正好跨过切口而重叠的肽段；获得重叠肽需要两种或两种以上的不同方法断裂同一多肽样品，得到两套或多套肽段。,二硫键位置的确定：一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。一是胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易分离鉴定；二是在酸性条件下，有利于防止二硫键发生交换

23、反应。,蛋白质的氨基酸序列与生物功能；肽合成,同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。同源蛋白质具有共同的进化起源。同源蛋白质具有明显的氨基酸序列相似性，称之为序列同源。根据同源蛋白质的氨基酸序列资料可建立系统树（进化树）。两个物种的同源蛋白质，其序列中氨基酸的差异数目与这些物种间的进化发生差异是成比例的。,蛋白质激活：在生物体内有些蛋白质是以前体形式合成，不具有活性，只有按一定方式裂解除去部分肽链后才具有生物活性，称之为蛋白质激活。如酶原激活。,肽的人工合成：,氨基酸共聚合（由一种或两种氨基酸反应）,控制合成（由不同氨基酸按一定顺序）：接肽反应需接肽试剂，为避免接肽

24、试剂与某些活泼基团反应，故在接肽前须首先将这些基团加以封闭或保护，如氨基保护或羧基保护等。在正常条件下，羧基和氨基之间不会自发形成肽键，即氨基或羧基需活化，通常是羧基活化。,固相肽合成：是控制合成技术的巨大进步，利用固相肽合成仪已成功合成多种肽和蛋白质。其实质是肽的羧基端第一个氨基酸共价挂接在树脂上，然后加入氨基受保护的第二个氨基酸并发生缩合反应，形成肽键，依次类推。最后是肽与树脂断裂并去掉氨基端的保护基团。,蛋白质的三维结构,研究蛋白质构象的方法：至今研究蛋白质三维结构的成就主要是应用间接的X-射线衍射法；研究溶液中蛋白质构象的光谱学方法（了解）。,稳定蛋白质三维结构的作用力,非共价键（次级

25、键）,氢键,范德华力,疏水作用：突出地位,离子键（盐键、静电引力）,共价键：二硫键，重要作用,蛋白质的二级结构,无规卷曲,转角,折叠片,螺旋：最常见、最典型、最丰富的二级结构元件,螺旋：是重复性结构，每圈螺旋站3.6个氨基酸残基，沿螺旋轴上升0.54nm，即螺距值；由氢键封闭的环为13元环；一般为右手螺旋；分子内或链内氢键使之稳定，减少R基间的相互作用或-碳原子无分支结构均利于其稳定，而Pro存在可中断之。,非重复性结构,折叠片：为重复性结构；折叠片的肽链处于曲折的伸展状态；借助链间或肽段间的氢键而稳定；分为平行和反平行折叠片，平行的比反平行的更规则。,纤维状蛋白质：动物体的基本支架和外保护成

26、分，分子具规则的线性结构。,纤维状蛋白质,不溶性（硬蛋白）,可溶性蛋白,角蛋白,胶原蛋白：结缔组织中（骨、皮肤等）大量存在,弹性蛋白：存在于结缔组织,角蛋白：主要存在于毛发中,角蛋白：天然存在于丝中,其它,肌球蛋白,血纤蛋白原,其它,说明：角蛋白经充分伸展后可转变成角蛋白，即折叠片结构。,球状蛋白质：其种类远比纤维状蛋白质多，蛋白质结构的复杂性和功能的多样性主要体现在球状蛋白质；球状蛋白质的整个肽链没有均一的二级结构，但具有多种二级结构元件如螺旋、折叠片、无规卷曲等，由此构建的三级结构结构域，并将球状蛋白质分成4大类；其三维结构具有明显的 折叠层次，且疏水测链球状分子内部，亲水侧链暴露在分子表

27、面；在多数的胞内酶、血浆蛋白及蛋白类激素都属于球状蛋白质。,超二级结构：由若干相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多，有规则的 二级结构串，并在多种蛋白质中充当三级结构的构件，称为超二级结构。已知有3种基本形式：、。,结构域：在多肽链上由二级结构元件或超二级结构形成的相对独立的 紧密球状实体，是三级结构的局部折叠区。较小的球状蛋白质或亚基是单结构域，而较大的球状蛋白质或亚基是多结构域。结构域可分4类：全结构、，结构、全结构和富含金属或二硫键结构域。,蛋白质变性与蛋白质折叠,蛋白质变性：天然蛋白质分子在受到理化因素的作用时导致溶解度降低、不对称性增高、生物活性丧失及理化特性改变

28、，此过程称之为蛋白质变性。蛋白质变性的实质是分子中次级键被破坏，引起天然构象解体。变性不涉及共价键破坏，即蛋白质一级结构仍保持完好。当变性因素除去后，变性蛋白质又可重新回复到天然构象，此为蛋白质的复性。是否蛋白质变性与复性可逆，仍有疑问。,蛋白质折叠：蛋白质折叠不是随机的而是通过累积选择找到自由能最低的构象；折叠需要折叠酶和分子伴侣参加。分子伴侣：是一类与蛋白质折叠有关的蛋白质家族（来源相同、结构相似、功能相关），它们通过抑制新生肽链不正常的聚集并排除与其他蛋白质不合理的结合而协助多肽链的正确折叠。,亚基缔合与四级结构：在同多聚体蛋白质中，原体就是亚基，而在杂多聚体蛋白质中，原体是由不同的亚基

29、组成；亚基缔合的驱动力主要是疏水相互作用，亚基缔合的专一性由相互作用的表面上的机性基团之间的氢键和离子键决定。,蛋白质的结构与功能的关系,肌红蛋白和血红蛋白是两个研究得最透彻的蛋白质，它们是蛋白质结构与功能的范例。肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质，它和血红蛋白的亚基在氨基酸序列上具有明显的同源性，它们的构象和功能也十分相似。,肌红蛋白,珠蛋白：含153个氨基酸残基，为1条肽链,辅基血红素：原卟啉与Fe的络合物称血红素。,卟啉化合物有很强的着色力，使生物组织呈现特定的颜色。卟啉环中心的铁原子有6个配位键，其中4个与四吡咯环的N原子相连，另2个沿垂直于卟啉环面的轴分布在环面的上下，这两个键合部

30、位分别称为第5和第6配位。铁原子可以是亚铁（Fe2+）或高铁(Fe3+)，相应的血红素称为亚铁血红素和高铁血红素，相应的肌红蛋白称为亚铁肌红蛋白和高铁肌红蛋白。类似的命名也用于血红蛋白。其中只有亚铁态的蛋白质才能结合O2。在肌红蛋白分子中，血红素共价地结合于肌红蛋白分子的疏水空穴中。其中血红素铁在第5配位键与珠蛋白第93位His残基的咪唑N配位结合；第6配位键处于开放状态，是O2的结合部位。当第6位被O2分子所占据时，即为氧合肌红蛋白；血红素中Fe2+能进行可逆氧合作用。血红素的铁原子如果处在水环境则容易被氧 化成Fe3+，失去氧合能力，此时H2O分子代替O2成为Fe3+的第6个配体。CO能与

31、O2竞争第6配位键，且结合能力远大于O2。,血红蛋白（Hb）的主要功能是在血液中结合并转运氧气，它存在于红细胞中。Hb的结构：脊椎动物的Hb由4个多肽链亚基组成，其中2个是一种亚基，2个是另一种亚基。如成人的血红蛋白主要是HbA，亚基组成为22，次要组分是HbA2，亚基组成为22；每个血红蛋白分子都有4个血红素，每个血红素分别位于每个多肽链中的裂隙处，并暴露在分子的表面。氧合过程中的构象变化：氧合作用显著改变Hb的四级结构，且氧合血红蛋白和去氧血红蛋白具有不同的构象。氧合曲线和别构效应：氧合曲线呈S形曲线（氧饱和度与氧分压之间），即血红蛋白的氧合具有正协同性同促效应，一个O2的结合增加同一Hb

32、分子中其余空的氧合部位对O2的亲合力；Hb对O2亲和力的影响因素：H+、CO2促进O2从血红蛋白中释放，O2也促进H+、CO2 在肺泡毛细血管中释放；BPG（2，3-二磷酸甘油酸）降低Hb对O2的亲和力，其只与去氧血红蛋白结合。血红蛋白分子病：导致一个蛋白质中氨基酸改变的基因突变能产生分子病，这是一种遗传病。了解最清楚的分子病是镰刀状细胞贫血病，该病人的不正常的血红蛋白称HbS，它只是在两条链的N端第6位上Glu被Val置换。这一改变使血红蛋白表面产生一个疏水小区，导致血红蛋白聚集成不溶性的纤维束，并引起红细胞镰刀状化和输氧能力降低。地中海贫血是由于缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因造成的。,

33、免疫球蛋白：人类具有5类免疫球蛋白，每一类别的生物学功能不同。最丰富的是IgG类，它由4条多肽链组成，2条重链，2条轻链。通过二硫键连接成Y形结构的分子。靠近Y的两臂顶端的结构域是可变区，形成两个抗原结合部位。其它抗体有IgA：主要存在于人体分泌物中如唾液、泪、乳中；IgM：只存在于血液中，抵制入侵血液的细菌；IgG：血液中最丰富的抗体，也是唯一能通过胎盘而进入人体的抗体；IgE：在过敏反应中起重要作用的抗体。,蛋白质的分离纯化,蛋白质的分离和纯化主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括蛋白质分子的酸碱性质、分子的大小和形状、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异亲合力。蛋白质的酸碱性质：蛋白质是

34、两性电解质。在蛋白质分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，此外还有少数的末端-羧基和-氨基。可以把蛋白质分子看作是一个多价离子，所带电荷的性质和数量是由蛋白质分子中的可解离基团的种类和数目以及溶液的pH所决定的。对某一种蛋白质来说，在某一pH时，它所带的 正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，这一pH称蛋白质的等电点。蛋白质的等电点在中性盐存在下可发生明显的变化，这是由于蛋白质分子中的可解离基团可与中性盐中的阳离子或阴离子相结合。在没有其他盐类干扰时，蛋白质的 质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为蛋白质的等离子点。蛋白质分子的形状：测定蛋白质分子的形状或构

35、象，最精确的方法是 X射线晶体结构分析，但这种方法只能测定晶体状态的蛋白质空间结构。对于溶液中的蛋白质分子的形状，只能借助间接的方法来描述蛋白质分子构象的轮廓。,测定蛋白质分子相对质量的方法,根据化学组成测定最低相对分子质量：测定某一微量元素或某一氨基酸的含量如铁原子或色氨酸，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子或一个色氨酸，即最低相对分子质量=铁的原子量/铁的百分含量,渗透压法：在半透膜存在时，蛋白质溶液将产生渗透压（平衡时的静水压力）。理想溶液的渗透压与溶质的浓度呈线性相关，其关系可用范托夫公式表示：=cRT/Mr，在高分子溶液中，/c=RT/Mr+Kc，渗透压法简单、准确、且不受蛋白质分子的

36、形状和水化程度影响，但受pH的影响，不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。,沉降法：离心力作用,沉降速率法：单位离心场的沉降速度是个定值，称沉降系数s。见P296页,沉降平衡法：沉降产生浓度梯度,凝胶过滤法：标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球体），分子形状为线型或与凝胶发生吸附的蛋白质不可用此法测定。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：加入SDS和少量巯基乙醇，则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量，而与电荷和分子形状无关。,蛋白质的胶体性质：蛋白质溶液属于胶体系统，其具备形成胶体系的条件：分散相（蛋白质分子颗粒）的质点大小在1100nm，能在分散介质中作布朗运动

37、；分散相的质点带同种电荷，不易凝聚成大颗粒而沉淀；分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层如水化层而不易凝聚。蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的，相对的。如果条件改变，则蛋白质就会从溶液中沉淀出来，如改变质点大小、电荷或水化层等。沉淀蛋白质的方法如下：,盐析法：加入大量的中性盐，脱去水化层而沉淀,有机溶剂沉淀法：加入极性的有机溶剂如甲醇等，脱去水化层并增加质点间的相互作用而沉淀,重金属盐沉淀法：当pH大于等电点时，蛋白质颗粒带净负电荷，易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀,生物碱或酸类沉淀法：当pH小于等电点时，蛋白质颗粒带净正电荷，易与生物碱或酸根负离子结合成不溶性盐而沉淀,加热变性沉淀法：蛋白质因加热

38、变性而凝固,蛋白质沉淀法,蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度，即设法除去变性的和不需要的蛋白质以增加单位蛋白质重量中所需蛋白质的含量或生物活性。分离纯化蛋白质的程序为：前处理（细胞或组织处理）、粗分级分离（除去杂蛋白）和细分级分离。,蛋白质的分离纯化方法,分子大小,透析和超过滤：透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。,密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被

39、分离成不同的区带。见P302页。,凝胶过滤：即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。,溶解度,等电点沉淀和pH控制,盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。,有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水化水。,温度沉淀：温度对溶解度有影响，低温稳定，高温不稳定。在040，大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。,蛋白

40、质分离纯化方法,电荷,电泳（净电荷、分子大小、形状）,区带电泳,聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）,毛细管电泳,离子交换层析,等电聚焦：外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。,层析聚焦：层析柱中建立连续的pH梯度，蛋白质样品由柱上端随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点pH处，形成区段。,吸附：吸附层析，吸附剂（硅石、氧化铝、活性碳）和疏水吸附剂，与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。,特异亲和力：亲和层析,其它：如高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC）,蛋白质纯度的鉴定方法：采用物理化学方法如电泳、离心沉降、HPLC和

41、溶解度分析等。纯的蛋白质电泳时，其电泳图谱只呈现一个条带或峰，离心时以单一的沉降速度移动；纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度，即溶解度曲线只有一个折点，在折点以前直线斜率为1，在折点以后斜率为零；此外，N-末端分析也用于纯度鉴定（单体蛋白质而言）。必须指出，采用任何单独的一种方法鉴定纯度只能作为蛋白质均一性的必要条件而非充分条件，即蛋白质往往在一种鉴定中表现为均一性，而在另一种鉴定中又表现为不均一性。,蛋白质含量测定与纯度鉴定：测定蛋白质含量的常用方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法，标准测定方法）、紫外吸收法、染料（考马斯亮蓝）结合法、胶体金法（带负电的

42、疏水胶体，洋红色，遇蛋白质变蓝色，灵敏度最高）,第五章：酶（重点）,酶概论；酶促反应动力学；酶的作用机制和酶的调节；,酶概论,知识点,酶的本质 全酶 辅酶 辅基 单体酶 寡聚酶 多酶复合体 酶的分类 酶的专一性 酶活力酶单位 比活力 转换数 核酶 抗体酶 固定化酶,酶具有生物催化功能的蛋白质或核酸。酶作为生物催化剂具有高效性、高度专一性、活性调控和易失活等特点。多酶复合体由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成，也称酶系。酶的分类国际酶学委员会根据催化反应类型，将酶分为6大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。分别用16来表示，在根据底物中被作用的基团或键分为亚类，每一亚

43、类在细分为亚亚类等，亚类和亚亚类均按顺序编成1，2，3，4等。每一个酶的分类编号由4个数字组成，数字间用“.”隔开，编号前冠以EC(Enzyme Commision)。酶活力即酶活性，指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，二者呈线性相关。所以测定酶活力就是测定酶促反应速率，酶促反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。,酶单位（U）在一定条件下，一定时间 内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。酶的含量用每克酶制剂或酶毫升酶制剂含有多少酶单位表示（U/g或U/ml）。国际单位（IU）：在最适反应条件下（温度 25）下，每分钟

44、内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量为一个酶活力单位，即1IU=1umol/min。Katal单位（Kat）：在最适条件下，每秒钟催化1摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1Kat单位。酶的比活力每mg蛋白质所含的酶的活力单位数表示，其代表酶的纯度，也可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。转化数在一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟每微摩尔酶分子转化底物的微摩尔数。抗体酶一种具有催化能力的免疫球蛋白（抗体），即抗体具有酶的属性，也称催化性抗体。核酶（ribozyme）某些具有催化功能的RNA，即为核酶。核酶的发现，开辟了生物化学研究的新领域，提出了生命起源的新概念：即RNA可能早

45、于蛋白质和DNA，是生命起源中首先出现的生物大分子。,酶的专一性即酶对底物的高度选择性，酶一般只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类底物。酶的专一性可分为结构专一性和立体异构专一性，用“诱导契合说”解释酶的专一性已被广泛认同。酶的分离纯化是酶学研究的基础，大多数酶的本质是蛋白质，故可用分离纯化蛋白质的方法纯化酶。但要选择合适的材料，操作条件要温和，且在制备过程中，每一步都要测定酶的总活力和比活力，以了解酶的回收率和提纯倍数。酶工程是将酶学原理与化学工程技术及基因重组技术有机结合而形成的新型应用技术，是生物工程的重要组成部分，并必将成为一个很大的生物技术产业。,酶促反应动力学,反应分子数与反应

46、级数 米氏方程 米氏常数（Km）双倒数作图法 酶的抑制类型 温度、pH、激活剂对酶反应的影响,反应分子数在反应中真正相互作用的分子数目。仅有1个反应的分子参加的反应称为单分子反应，有2个反应物分子参加的 反应称为双分子反应，依此类推。即：A P 属于单分子反应，动力学方程（速率方程）为：-dc/dtkc；A+B p+Q 属于双分子反应，动力学方程为：-dc/dtk c1c2；反应级数指整个化学反应的速率服从哪种分子的反应速率方程式，则这个反应即为几级反应。若总反应的速率与浓度关系能以单分子反应的速率方程式表示，即为一级反应，若能以双分子反应的速率方程式表示，则为二级反应，依此类推，把反应速率与

47、反应物浓度无关的反应称为零级反应。,知识点,各级反应的特征,一级反应：c c0 e-kt 半衰期 t 1/2 0.693/k,二级反应：-dc/dtk c1c2 半衰期 t 1/2 1/ka(a为底物的初浓度),零级反应：-dc/dtk 半衰期 t 1/2 a/2k(a为底物的初浓度),酶促反应动力学：底物浓度与酶促反应速率的关系呈双曲线，即当底物浓度较低时，反应速率与底物浓度呈正比关系，表现为一级反应；当底物浓度逐渐增加时，反应速率不再按正比关系升高，反应表现为混合级反应；当底物浓度达到 足够高时，反应速率与底物浓度几乎无关，反应达到最大反应速率，表现为零级 反应。米氏方程1913年Mich

48、aelis和Menten在前人工作基础上，根据酶反应的中间复合物学说，即：E S ES E P假定 E S ES 迅速建立平衡，底物浓度远大于酶浓度下，ES分解成产物的逆反应忽略不计，推导出一个数学方程式来表示底物与酶反应速率之间的定量关系，称为米氏方程，表达式如下：,Vmax S/(Km S)式中Km为米氏常数，其物理意义是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L，与底物浓度的单位一样。米氏常数Km的意义如下：Km是酶的一个特征常数，其大小只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关；Km值随测定的底物、反应温度、pH及离子强度而改变，即Km作为常数只是针对一定的底物、温度、pH

49、和离子强度而言；Km值可以判断酶的专一性和天然底物：有的酶可作用于几种底物，因此就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物或天然底物。Km值随不同底物而异的现象可以帮助判断酶的专一性；若已知某个酶的Km值，可以计算出在某一底物浓度时的反应速率相当Vmax的比例；Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径：同一种底物往往可以被几种酶作用，催化不同的反应走不同的途径，究竟走哪一条途径决定于Km值最小的酶，只有Km值小的酶反应比较占优势。利用作图法测定Km和Vmax值：Km值可用公式计算求得，Km（k2 k3）/k1；当k3远小于k2 时，Km k2/k1 Ks，在此时，Km相当于ES复

50、合物的解离常数Ks！，,Vmax=k3 Et(Et 为总酶浓度)；Km和Vmax可根据实验数据通过作图法直接求得：即将米氏方程进行变换，使其成为直线方程，然后用图解法求出Km与Vmax值。例如，Lineweaver-Burk双倒数作图法：1/Km/Vmax 1/S1/Vmax，横轴截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax；酶的抑制：酶主要是蛋白质，使酶蛋白变性而导致酶活力丧失的作用称为失活作用；若由于酶的必需基团化学性质的改变，但酶并未变性，而引起酶活力的降低或丧失称为抑制作用。引起抑制作用的物质称为抑制剂。抑制类型如下：,抑制类型,不可逆抑制：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合，不能用物理方法