2023核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识（最全版）.docx

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1、2023核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识(最全版)摘要核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)技术在结核病与非结核分枝杆菌病病原学和耐药性诊断中的应用越来越多，为早期诊断、鉴别诊断和耐药鉴定提供了快速、准确的依据。然而，在实际应用中，临床医生对标本的选择、留取、送检时机及注意事项、报告结果的解读等的理解和掌握参差不齐，尚需规范化。本共识总结了核酸MALDI-TOFMS检测技术应

2、用于结核病和非结核分枝杆菌病诊断的临床适应证和标本采集注意事项，介绍了如何正确解读核酸MALDI-TOFMS技术鉴定分枝杆菌菌种和耐药性的报告结果，以进一步规范核酸MALDI-TOFMS技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用，提高临床诊断水平，指导临床开展早期精准有效的治疗。结核病是严重威胁人类健康的重要传染性疾病之一。世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)估计，2021年全球有1060万例新发结核病患者，死亡近160万例，新增45万例耐多药/利福平耐药结核病患者。其中，我国新发78万例结核病患者，新增耐多药/利福平耐药结核病患者约3.3万例，是全球结核

3、病及耐药结核病高负担国家之一1-2;肺外结核占所有结核病的15%40%3-6,因其容易导致器官或组织功能性损伤和器质性障碍而成为近年来结核病领域关注的重点；全球由非结核分枝杆菌(non-tuberculousmycobacteria,NTM)引起的疾病比例呈现上升趋势7-8,在很多发达国家，NTM病甚至超过了结核病9-10。我国的NTM分离率也逐年增高11-15,南方和沿海地区高于北方和内陆地区11,16。宿主及环境因素对NTM病的流行也有很大影响8,17-18。临床上以NTM肺病最为常见19,NTM肺病的临床表现、放射影像学特征和痰涂片抗酸杆菌染色检查特征与肺结核极其相似，且大多数NTM对常

4、用抗结核药物呈天然耐药或耐药率高11-12,需要经过数月至数年的漫长复杂的治疗，有时因不能耐受药物的不良反应，导致治疗不完全或再感染而复发20-22,对人类健康构成重大威胁，已成为全球关注的公共卫生健康问题。因此，准确快速诊断和鉴别诊断结核病与NTM病及其耐药性，对指导临床开展早期精准有效治疗至关重要。第一部分核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的基本原理与特点基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)技术是一种直接分析大分子的质谱技术

5、。来自生物样本的核酸、蛋白质、脂质等提取物与基质混合后置于合成金属板孔的芯片中，使得样本在基质中被晶体化。将该金属板芯片放入质谱仪中，氮气激光的短脉冲将在此轰击金属板，吸收能量后的基质将导致生物样本解离、蒸发并在气象阶段离子化。离子化分子在静电场中加速，喷射通过真空的金属飞行管直到抵达检测器，离子化分子的飞行速度取决于质荷比，其中相对分子质量小的离子抵达时间短于相对分子质量大的离子。基于以上原理，样本解离的离子根据其飞行时间而被分开，产生一系列由不同强度的质荷比峰组成的质谱结果，且每个样本产生一个质谱23。1996年，第一个MALDI-TOfMS试验成功鉴定出细菌24。自2010年以来，逐渐应

6、用于临床微生物检测领域，在分枝杆菌领域也有应用，但是绝大多数应用都是基于蛋白质的相对分子质量差异，而非基因序列多态性11,25-33o基于蛋白质的MALDi-TOFMS技术需要进行分枝杆菌培养，无法达到快速诊断的目的，因此，基于基因序列多态性的核酸MALDI-TOfMS技术应运而生。核酸MALDi-TOFMS技术是以核酸作为细菌鉴定的生物标志物34-35z基本原理是通过对多靶点基因片段进行多重PCR特异性扩增，去除脱氧核糖核苗酸后，进行各个位点的单碱基延伸反应，经处理后的延伸反应产物同质谱所需基质混合，放入飞行时间质谱仪中运行，每份样本会得到独特的指纹质谱图，经过判读后获得菌种及耐药信息。核酸

7、MALDI-TOfMS技术可以同时针对分枝杆菌的保守基因片段，例如16SrRNA、hsp65等基因的多态性进行设计，从而快速鉴定分枝杆菌菌种。同时，根据耐药相关的基因多态性进行设计，获得rpoBxkatGxgyrA、erm(41)等分枝杆菌相关的耐药基因突变结果。常见的基于核酸扩增技术的结核分枝杆菌检测均基于IS6110JS1081等位点进行扩增，选择其中的1个或2个，而核酸MALDI-TOfMS技术可以在此基础上考虑增加其他位点的多态性检测，例如内转录间隔区(internaltranscribedspace,ITS)、rpoB等基因,因此鉴定分枝杆菌的敏感度更高；而且由于有多基因结果的验证，

8、可以在提高敏感度的同时，保证结核分枝杆菌检测的特异度。同时，在耐药性检测方面应用范围更广，几乎覆盖了目前常用的抗结核和抗NTM病的药物，检测针对性强、准确性高。在飞行时间质谱仪检测的过程中，从激光发射到信号接收检测只需几毫秒，因此在短时间内对数百例样本同时进行检测分析，具有高通量、快速、灵敏、高分辨率、低成本等特点，且不依赖于荧光探针等荧光类试剂，检测周期短于一代和二代测序，对少量样本也能进行多基因多位点检测。通过提取生物样本中的核酸分子继而进行特异性扩增，实现单个核昔酸碱基的直接鉴定，无需培养，实现快速诊断，可以满足临床早期诊断并指导治疗的需求。表1简要概括总结了常用分枝杆菌病原学及其耐药性

9、鉴定的分子诊断方法的优劣势。1”0阡等0a0怆”于0为送S比B,出1应用同中险资通较低仅崎迸行原学的鉴定.不辍检测耐打性.*.*沼.试剂不JSiO交叉沔及 会出现Wa怪绪票所需样本大.怆霸的射割g点有*.点交.冼芬以较聚域.费时2厮方法施用优势实时英:定可授松赛W幡本,技术成熟，应用广泛,或寒度桁构Hflr均校高PCR技术校无需温度”厦循环保持工度恒定.对设笛费家不快速检jw分悚杆,闵可疑er基因芯片/区怪田计技ffiB.可一次兀成押建和个好为相关因位点的检利.SlSflIfO特R度均蛟术史凶维测序可同时怆富于4病原R生%.可检M巳卬射种位点以外的交交,可用于发现新的射割机IR向痴序技术对悻本

10、.没修和结事X试制.P肉制笊技术可险1所有的附的相关“因的突变类型.一代方库常作为分子为方UI蛇窝结里的要求扃.一代海序对的JK性酎杓的松和表型种福敬域哈舞培里不一致时的喳证手段测受赋MMMALDi高通，可一次性所1一线15物和大都分启用二线的福的耐杓H因位点,可很好区分络搐分枝杆*只1a!已知的酎杓“因位点，依族于-TOFMStsa和结摘分校HBLIlfJ蛟高的贡;由5,50度相拘R度可哈舞混合EG、A属性耐百、阿义交交耐丹机*发现已有研究证实，核酸MALDI-TOfMS技术鉴定分枝杆菌及其耐药性具有较高的准确性。2017年，来自中国台湾的研究团队将此技术应用于鉴定结核分枝杆菌复合群和NTM

11、,结果表明该技术的检测限为5个拷贝数，同时检测耐药的敏感度和特异度都达到了较高水平34。有文献报道，通过对168株临床结核分枝杆菌分离株进行抗结核药物的耐药性分析，发现核酸MALDI-TOfMS技术检测结核分枝杆菌耐药性有很好的表现，大部分药物的检测结果与表型药物敏感性(简称药敏)试验结果具有很好的一致性36。针对复治结核病患者的结核分枝杆菌耐药性检测研究显示,核酸MALDi-TOFMS技术与液体培养药敏检测具有很好的一致性37;针对涂阴或无痰肺结核患者的支气管肺泡灌洗液样本的检测结果显示，核酸MALDI-TOfMS技术的敏感度和曲线下面积(areaundercurve,AUC)均优于Gene

12、XpertMTB/RIF和培养法38。来自西安市胸科医院的一篇研究报道，相比于高分辨率熔解曲线方法(high-resolutionmeltingcurve,HRM),核酸MALDI-TOFMS技术表现出更高的准确性39。核酸MALDI-TOfMS技术检测分枝杆菌及其耐药性具有较好的诊断价值和临床应用前景。为了规范核酸MALDI-TOFMS技术在分枝杆菌病诊断中的应用，结合中国临床证据及专家实践，在借鉴国际研究证据的基础上，解放军总医院第八医学中心、中国防腐杂志编辑委员会和中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会基础和临床学术部联合组织专家共同拟定核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病

13、和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识，供临床医生在临床诊疗时参考，并为将来进一步制定临床相关指南提供基础。第二部分共识制定的过程2022年3月，解放军总医院第八医学中心结核病医学部和中国防痍杂志编辑委员会依托中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会基础和临床学部组建核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识专家组。专家组成员必须满足以下条件：（1）担任中国防腐协会专业分会或中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会委员或中国防腐杂志编委、通信编委；（2）具有高级专业技术职称；（3）从事结核病临床、检验和基础研究工作10年以上，具有丰富的相关工

14、作经验，在结核病领域有较高的学术地位；（4）自愿参加专家组，能够全程参加专家共识的讨论与制定，并积极提出自己的意见和建议。专家组成员来自全国结核病专业诊疗机构，历时1年时间，对国内外核酸MALDI-TOfMS技术在结核病和NTM病诊断中的临床应用及进展进行了文献检索和复习，并对国内各地相关临床问题及应用经验进行了深入调查和相互沟通。虽然核酸MALDI-TOfMS技术作为一项新型技术在结核病和NTM病诊断中的临床应用研究较少，专家组多次召开专家讨论会，经过认真分析，反复论证，归纳总结，一致认为核酸MALDI-TOfMS技术在分枝杆菌菌种鉴定和耐药性快速检测方面具有较好的临床诊断价值和应用前景，最

15、终达成一致意见，形成共识终稿O第三部分核酸MALDI-TOfMS技术鉴定分枝杆菌菌种及其耐药性一、应用核酸MALDI-TOfMS技术鉴定分枝杆菌菌种目前，核酸MALDI-TOfMS技术可鉴定结核分枝杆菌复合群8个亚种和40个NTM菌种及其亚种，合计48个分枝杆菌菌种和亚种（表2）,几乎覆盖了临床上分枝杆菌病的所有常见致病菌，可以满足临床实现快速鉴定分枝杆菌菌种的要求，为临床医务人员提供诊断参考。另外，随着临床实践的逐步积累，核酸MALDi-TOFMS技术可根据临床上未来可能出现的菌种予以增加鉴定。表2应用核酸MALDlTOFMS技术鉴定的分枝杆菌菌种或亚种导出到EXCEL序号中文名称拉丁文名称

16、结核分枝杆菌复合群1结核分枝杆菌M.tuberculosis2牛分枝杆菌M.bovis3牛分枝杆菌BCGM.bovisBCG4田鼠分枝杆菌M.microti5非洲分枝杆菌M.africanum6卡内蒂分枝杆菌M.canetti7山羊分枝杆菌M.caprae8海豹分枝杆菌M.pinnipedii非结核分枝杆菌1鸟分枝杆菌M.avium2胞内分枝杆菌M.Intracellulare3莲建洞分枝杆菌M.yongonense4脓肿分枝杆菌M.abscessus5博莱分枝杆菌M.bolletii6马赛分枝杆菌M.massiliense7偶发分枝杆菌M.fortuitum8堪萨斯分枝杆菌M.kansasi

17、i9戈登分枝杆菌M.gordonae10痕病分枝杆菌M.Scrofulaceum11龟分枝杆菌M.Chelonae12海分枝杆菌M.marinum13蟾蛛分枝杆菌M.xenopi14溃疡分枝杆菌M.Ulcerans15嗜血分枝杆菌M.haemophilum16玛尔摩分枝杆菌M.malmoense17耻垢分枝杆菌M.Smegmatis18苏尔加分枝杆菌M.Szulgai19不产色分枝杆菌M.nonchromogenicum20次要分枝杆菌M.triviale21土分枝杆菌M.terrae22猪分枝杆菌M.porcinum23浅黄分枝杆菌M.gilvum24草分枝杆菌M.phlei25胃分枝杆菌M

18、.gastri26母牛分枝杆菌M.vaccae27迪氏分枝杆菌M.diernhoferi28猿分枝杆菌M.simiae29新金色分枝杆菌M.neoaurum30金色分枝杆菌M.aurum31居间分枝杆菌M.interjectum32奇美拉分枝杆菌M.chimaera33免疫原分枝杆菌M.immunogenum34产黏液分枝杆菌M.mucogenicum35外来分枝杆菌M.peregrinum36三重分枝杆菌M.triplex37布兰德分枝杆菌M.branderi38慢生黄分枝杆菌M.Ientiflavum39副痕病分枝杆菌M.Parascrofulaceum40中间分枝杆菌M.intermed

19、ium二.应用核酸MALDI-TOfMS技术检测分枝杆菌对常用药物的耐药性根据WHO2018年40和2021年41发布的耐药位点证据等级和我国发表的高质量文献42-44,目前核酸MALDI-TOfMS技术可检测结核分枝杆菌4种一线抗结核药物(异烟肿、利福平、毗嗪酰胺和乙胺丁醇)和常用的二线抗结核药物(氟嗟诺酮类、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、对氨基水杨酸钠、环丝氨酸、氯法齐明、贝达瞳琳、利奈嘤胺)的耐药基因型；并可检测NTM大环内酯类和氨基糖苗类药物的耐药基因型，了解其耐药性(表3,4)。表3应用核酸MALDlTOFMS技术检测结核分枝杆菌耐药基因及耐药位点导出

20、到EXCEL药物名称耐药基因a检测位点密码子/碱基编码氨基酸利福平rpoBa511CTG亮氨酸(Leu)513CAA谷氨酰胺(GIn)516GAC天冬氨酸(Asp)522TCG丝氨酸(Ser)526CAC组氨酸(His)531TCG丝氨酸(Ser)533CTG亮氨酸(Leu)572ATC异亮氨酸(He)异烟脱inhA-15C/katG315AGC丝氨酸(Ser)316GGC甘氨酸(GIy)毗嗪酰肢pncA57CAC组氨酸(His)-11A/,乙胺丁醇embB306ATG蛋氨酸(Met)406GGC甘氨酸(GIy)gyrA88GGC甘氨酸(GIy)90GCG丙氨酸(AIa)氟瞟诺酮类91TCG丝

21、氨酸(Ser)94GAC天冬氨酸(Asp)gyrB538AAC天冬酰胺(Asn)链霉素rpsL43AAG赖氨酸(Lys)88AAG赖氨酸(Lys)乙硫异烟胺/丙硫异烟胺inhA-15C/对氨基水杨酸钠folC43ATC异亮氨酸(Ile)thyA202ACC苏氨酸(Thr)75CAC组氨酸(His)阿米卡星rrs1401A/1484G/eis-14C/卡那霉素1401A/rrs1402C/1484G/1401A/卷曲霉素rrs1402C/1484G/环丝氨酸air261AGC丝氨酸(Ser)113CTG亮氨酸(Leu)aid32GAA谷氨酸(GIu)氯法齐明rv0678193G/466C/贝达噗

22、咻rv0678193G/466C/利奈嗖胺rplC460T/注a编码原则按照大肠埃希菌相应序列的编码顺序。rpoB(Rv0667),编码RNA聚合酶亚基;inhA(Rv1484),编码NADH依赖烯醇-ACP还原酶；katG(Rv1908c),编码触酶过氧化物酶;pncA(Rv2043c),编码烟酰胺酶；embB(Rv3795),编码阿拉伯糖基转移酶；gyrA(Rv0006),编码DNA消旋酶A亚基;gyrB(Rv0005),编码DNA消旋酶B亚基；rpsL(Rv0682),编码30S核糖体蛋白S12亚单位;folC(Rv2447c)z编码二氢叶酸合成酶；thyA(Rv2764c),编码叶酸依

23、赖的胸腺D密咤合成酶；rrs(RvnrOI),编码16S核糖体RNA;eis(Rv2416c),编码增强胞内生存蛋白；air(Rv3423c)z编码丙氨酸消旋酶；aid(Rv2780),编码丙氨酸脱氢酶；Rv0678,编码转录抑制蛋白；rplC(Rv0701),编码50S核糖体蛋白L3o碱基：A,腺瞟吟；T,胸腺嘴咤;C,胞嚓陡;G,鸟瞟呛。7指单个碱基突变,不编码氨基酸表4应用核限MALDlTOFMS技术检测非结核分枝杆蕾耐药基因及耐药位点导出到EXCEL药物名称耐药基因a检测位点密码子/碱基编码氨基酸1406T/氨基糖苔类(卡那毒素、阿米卡星、庆大霉素)rrs01408A/1491G/er

24、m(41)28T/大环内酯类(阿奇霉素、克拉霉素)rrla2058A/2059A/注a:编码原则按照大肠埃希菌相应序列的编码顺序。rrs（RvnrOI）,编码16S核糖体RNAerm）,编码23S核糖体RNA甲基转移酶；rrl,编码23S核糖体RNAo碱基：A,腺瞟吟；T,胸腺口密陡；C,胞嚓陡；G,鸟瞟聆。7指单个碱基突变,不编码氨基酸三.应用核酸MALDI-TOfMS技术检测分枝杆菌耐药基因位点同义突变基因突变一般包括错义突变、同义突变和无义突变3种类型，核酸MALDi-TOFMS技术除可检测上述的错义突变外，目前还可检测到的结核分枝杆菌常见同义突变如表5所示。表5应用核酸MALDI-TO

25、f技术可检测的结核分枝杆菌常见同义突变表5应用核酸MALDlTOF技术可检测的结核分枝杆菌常见同义突变导出到EXCEL耐药基因检测位点野生型密码子（氨基酸）突变型密码子（氨基酸）rpoB513CAA（谷氨酰胺）CAG（谷氨酰胺）533CTG（亮氨酸）TTG（亮氨酸）gyA90GCG（丙氨酸）GCA（丙氨酸）94GAC（天冬氨酸）GAT（天冬氨酸）第四部分应用核酸MALDI-TOfMS技术检测分枝杆菌病的临床适应证和送检时机对可疑肺结核、肺外结核和NTM病患者的快速诊断和鉴别诊断，以及确诊结核病、NTM病但治疗效果不理想患者的药敏检测，应尽早送核酸MALDI-TOfMS检测。见图1oe床蚣、外络

26、利L HHBA3t PPD. wilm. MALtX TOFMS.要JwaMlFH喏电 In行时传廊IMiIWmaldi of M$&未/趣分代打fw窿Ifi应Qrt机推荐意见1：近期具有明确的肺结核密切接触史，咳嗽、咳痰超过2周，伴或不伴有咯血、胸痛、胸闷、气短等呼吸道症状和低热、盗汗、乏力、体质量减轻等全身中毒症状，临床常用结核病病原学检查结果为阴性，影像学检查存在肺部病变，需快速确诊的患者，建议送痰和支气管肺泡灌洗液进行培养的同时送核酸MALDI-TOfMS检测，可在12d内快速鉴定病原菌以明确诊断。推荐意见2:胸部影像学表现高度怀疑肺结核，Y-干扰素释放试验(interferon-ga

27、mmareleaseassaysJGRA)阳性，结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest,TST)强阳性或重组结核杆菌融合蛋白(EC;宜卡)阳性，临床常用病原学检测阴性，诊断性抗结核治疗效果差，适合送MALDI-TOfMS检测，可快速明确诊断。推荐意见3:疑似结核性胸膜炎患者，胸腔积液常规结核分枝杆菌细菌学检查阳性率低，建议按要求送胸腔积液进行核酸MALDI-TOfMS检测以提高病原学检出率。推荐意见4:疑似肺外结核，如结核性脑膜炎、结核性淋巴结炎、骨关节结核、肠结核、结核性腹膜炎、泌尿生殖系统结核、结核性心包炎、皮肤结核等肺外结核患者，治疗效果差，分泌物和（或）活检、手术组织临

28、床常用病原学检测阴性时，适合送核酸MALDI-TOfMS检测。推荐意见5:胸部影像学表现高度疑似NTM肺病,尤其是IGRA阴性和EC皮肤试验阴性，TST阳性者，适合及早送痰和（或）支气管肺泡灌洗液进行核酸MALDI-TOfMS检测。推荐意见6:慢性肺部疾病,包括肺囊性纤维化、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病、尘肺、肺间质纤维化、支气管哮喘、过敏性肺炎、变应性支气管肺曲霉菌病等患者，经规范性治疗效果差，尤其合并免疫功能受损，如艾滋病病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）感染/艾滋病（acquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS）和器官移植等

29、长期服用免疫抑制剂的患者，高度怀疑并发肺结核或NTM肺病时，适合送核酸MALDI-TOfMS,以快速鉴定病原菌及其耐药性。推荐意见7:对外伤或手术，包括医疗美容手术后出现局部皮肤反复感染，伤口经久不愈的患者，建议送伤口分泌物进行核酸MALDI-TOfMS,排除NTM感染。推荐意见8:确诊NTM病,包括NTM肺病和肺外NTM病的患者，需要明确感染菌种对药物的敏感性，可进行核酸MALDI-TOfMS检测。推荐意见9:复治肺结核和肺外结核，抗结核药物治疗效果不佳或者病情复发，高度怀疑耐药的患者，进行痰、分泌物、活检及手术组织表型和基因型药敏试验的同时,可送核酸MALDi-TOFMS进行耐药性检测；高

30、度怀疑异质性耐药者，可在治疗过程中进行核酸MALDI-TOfMS耐药性检测跟踪。推荐意见10:肺结核和肺外结核诊断明确，痰、分泌物和（或）活检、手术组织GeneXpertMTB/RIF检测利福平耐药的患者，建议送核酸MALDI-TOfMS检测结核分枝杆菌对其他一线和二线抗结核药物的耐药性。推荐意见11:对于鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和脓肿分枝杆菌等致病性NTM,建议送核酸MALDI-TOfMS进行耐药性检测；对于弱致病性的NTM,可根据送检样本来源、临床症状和影像学表现，决定是否进行核酸MALDi-TOFMS检测其耐药性。第五部分标本的采集、运输.检测及实验室质量控制.出具报告临床上采集的生物标

31、本类型和质量对检测结果及后续的临床诊断具有直接而显著的影响。不同类型的生物标本存在被污染的可能性，采样部位不同，因定植菌的影响也随之不同，因此会影响核酸MALDi-TOFMS检测结果的可信度。对不同类型临床标本的采集需建立标准规范的操作程序，尽量避免污染。一、生物标本的采集分枝杆菌病的主要标本类型为来自肺部的痰液、支气管肺泡灌洗液，同时胸腔积液、腹腔积液、心包积液、脑脊液、脓液、尿液、粪便、骨髓及手术组织、活检组织等均可进行核酸MALDi-TOFMS检测。但检测结果依赖于送检标本中分枝杆菌的含量,如痰液检测下限为30个菌落形成单位colonyformingunitszCF)/ml。对于NTM鉴

32、定结果还需要考虑标本被污染或者是定植菌的可能。(-)生物标本采集过程的注意事项1 .采集标本容器：收集临床标本的容器内需含有分枝杆菌灭活剂成分。2 .采集标本信息：收集标本的容器上应标注患者信息、标本类型、送检科室等信息。送检标本应有送检申请表，填写受检者信息，包括编码、采样日期、个人基本信息、标本类型、采样单位等。采样人员在采样前及采样后均需仔细核对受检者信息。3.采集标本前：采集标本之前须知晓患者是否在近期服用抗菌药物，尽量在抗菌药物使用之前采集标本。4.采集标本时：不同类型的生物标本采集，必须由经过培训且考核合格的专业人员进行规范操作，严格执行无菌操作，避免标本污染；对高度怀疑分枝杆菌病

33、者，建议送检2份以上同类型或不同类型的样本；其他肺外结核样本最好采集自病灶处；呼吸道样本采集必须采取适当的感染控制预防措施，包括个人防护措施等。5.采集标本后：采集后的样本应该在24h内进行灭活保存处理。推荐意见12:生物标本采集必须由专业人员执行，采取适当的感染控制措施；收集标本的专用容器上应注明患者及标本的详细信息；对高度怀疑分枝杆菌病者，建议采集2份以上同类型或不同类型的样本；采集后的样本应该立即送检，否则须放在4。C冰箱暂存且在24h内进行灭活处理。（二）不同类型临床生物标本采集时的注意事项1.痰液：需35ml。最好采集清晨痰或夜间痰。合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌

34、物，包括干酪痰、血痰、黏液痰，唾液或口水为不合格痰标本。对于不合格痰标本，应重新采集。但若患者无法自行咳痰或者无痰、少痰，可通过诱导（浓氯化钠溶液雾化诱导排痰）获得深部痰，也可通过吸痰器从气道采集。采集样本后应立即送检，实验室收到样本后应即刻进行质量检查和处理等，如不能立即检查，应暂放在4。C冰箱且在24h内进行灭活保存处理。2.支气管肺泡灌洗液：需15mlo通过纤维支气管镜接近病灶处，用等渗氯化钠溶液分次注入，立即负压吸引回收，弃去首次灌洗液，以减少污染。收集23次回收的支气管肺泡灌洗液至少15ml送检。如果回收的支气管肺泡灌洗液超过15ml,将支气管肺泡灌洗液放在桌面上静置沉淀片刻后，留取

35、15ml下层液体，在密封状态下摇匀后，转移至采样管中，以封口膜密封管口，装入密封袋中送检。若灌洗液没有及时转移到采样管，须放在4。C冰箱暂存且在24h内进行灭活保存处理。3.积液型样本：比如胸腔积液、腹腔积液、心包积液、关节腔积液等样本的留取量及处理方法同支气管肺泡灌洗液。4.尿液：需50mlo留取尿液样本前一晚尽量少饮水，取清洁容器收集清晨第一次全部尿液或24h尿液沉淀。5.粪便：需取体积至少为黄豆粒大小的新鲜粪便,或者稀便至少为35mlo6.组织类样本：需取体积至少为5mm3的新鲜或石蜡包埋的组织标本。7.其他类型样本：脑脊液样本需留取至少5ml;脓液需留取12ml;咽拭子和分泌物拭子需留

36、取2份拭子。推荐意见13:不同类型的临床生物标本采集量不同。采集液体类标本应静置，取下层沉淀物至采样管中，装入密封袋中送检；对于固体标本和组织类标本，最好采集新鲜病灶处样本立即送检，必要时可采集石蜡包埋的组织标本进行进一步检测。二.生物标本的运输和保存标本的运输和保存需遵循病原微生物实验室生物安全管理条例45和可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定46。1.生物标本的运输：需申请获得可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书。运输生物标本的容器或包装材料应达到国际民航组织危险物品安全航空运输技术细则规定的A类包装标准47,并印有卫生部门规定的生物危险标签、标识、

37、运输登记表、警告用语和提示用语。运输过程应有专人护送，护送人员不得少于2名，且需接受过相关的生物安全知识培训。运输前应仔细检查容器和包装是否符合安全要求，标签及标本登记表是否完整无误，运输采取冷链运输，送达后包装的开启须在符合生物安全规定的场所中（生物安全级别2级及以上）进行标本前处理及核酸提取。2.生物标本的保存：收到的生物标本尽可能当天处理，完成核酸的抽提；无法当天处理的，可暂冻在一20。C冰箱保存，次日及时处理。对于未用完的核酸样本或者临床标本可长期保存于一80。C冰箱。根据生物样本管理方法命名并保存样本，以便于未来追溯。要避免标本的反复冻融，一般不得超过3次。推荐意见14:标本的运输和

38、保存需遵循生物安全管理规定，符合安全要求。妥善保存未用完的核酸样本或者临床标本，建议根据生物样本管理方法命名并保存样本，以便于未来追溯。三.样本的核酸MALDI-TOfMS检测1.样本前处理结核病属于乙类传染病,生物样本具有潜在的传染性，在样本处理前需采取必要的防护措施，即使是装在具有灭活剂的管里也必须在二级生物安全实验室中的生物安全柜中操作。对于痰液等黏性较高的生物标本，需要进行液化处理。分枝杆菌细胞壁厚且含大量脂质，需进行破壁处理，目前，样本前处理采取的是错珠振荡破碎法破碎细菌，后续流程主要有离心和过滤等步骤。实验室应建立标准操作流程(standardoperationprocedure,

39、SOP)o2.核酸提取：实验室必须建立完整的核酸提取流程，严格防控外源核酸的污染，操作人员须进行核酸提取操作的培训，规范化操作。首先对选取的核酸提取试剂盒进行验证，确保核酸提取的纯度和浓度，对每次提取的核酸样本进行定量纯度的检测，确保能满足后续实验要求，一般不得低于5ngo每批次实验都应包括内参照、阳性对照和阴性对照，以评估每批次样本中是否存在操作或环境带来的污染等异常。3.PCR反应和延伸反应：多重聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)后进行虾碱性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase,SAP)反应,产物延伸后进行脱盐处理。4.质谱分析：采

40、用纳米分配器将以上PCR产物点在金属板芯片上，放入飞行时间质谱仪进行检测和分析。实验室应安排专门的医学人员对耐药基因每个变异进行人工审核，后期需定期统计分析检测效率、准确性并进行及时的优化与更新。根据最新的研究信息和我国的耐药基因特点，进行耐药基因和耐药位点的补充和调整。四.质量控制实验室必须建立严格的质量控制，严格评估是否存在操作或环境带来的污染。每一步都需要进行质量检验，尽可能将人为污染降到最低。PCR反应之后的每一步都需要加阴性对照和阳性对照。必须定期进行室内质量控制和室间质量控制管理。推荐意见15:样本前处理、核酸提取、PCR反应和质谱分析，每一步都需要进行质量检验，PCR反应和质谱分

41、析需要设置阴性对照和阳性对照。要定期进行室内质量控制和室间质量控制。五.出具报告1.出具报告要求：病原检测报告需要符合医疗机构临床实验室管理办法48和医学检验实验室基本标准和管理规范（试行）49对检测报告的要求，列出患者信息、临床初步诊断、标本种类及编号、检测方法、检测项目、检测结果、检测机构与报告人信息等内容。检测报告需要有严格的发放和审核流程，以确保报告的及时、有效、正确和完整。2.出具报告需要列出的参数：生物标本中提取核酸的浓度、利用定量聚合酶链反应（quantitativepolymerasechainreaction,qPCR）法初步评估分枝杆菌在生物标本总核酸中的丰度。涉及到分枝杆

42、菌耐药检测，需列出项目覆盖的所有检测耐药基因的位点信息，以及相应的检测核苗酸的结果，同义突变类型需标明，存在异质性耐药的需标注；根据WHO的耐药基因目录文件，评估检测到的突变位点可能导致的耐药水平等级。在出具耐药检测结果时，应指出相应耐药水平，以更好地指导临床医生用药。3.出具报告的内容:应用核酸MALDI-TOfMS技术检测分枝杆菌菌种及其耐药性完整的项目包含分枝杆菌菌种鉴定，以及分枝杆菌对一线药物和二线药物的耐药基因位点的检测。包括结核分枝杆菌复合群中的具体亚种；针对治疗结核病的一线药物（利福平、异烟脱、乙胺丁醇和叱嗪酰胺）及二线药物（链霉素、对氨基水杨酸钠、环丝氨酸、利奈嘤胺、氟瞳诺酮类

43、、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、氯法齐明和贝达喋琳）耐药基因突变检测结果；针对治疗NTM病的核心药物（大环内酯类和氨基糖苗类）耐药基因检测结果；针对上述药物的耐药基因突变情况；附件里包含具体的检测基因名称、检测位点、野生型位点核苗酸、检测到的位点核苗酸。核酸MALDI-TOfMS技术检测分枝杆菌的耐药相关基因位点会根据最新研究结果并根据我国的实际情况进行不断更新扩充，出具的报告中也会呈现相应扩充。推荐意见16:病原检测报告信息必须完整准确，尤其要对患者信息、检测标本、检测参数进行严格审核才能出具报告；在出具耐药检测结果时，应指出相应耐药水平程度，以更好地指导临床医生用药

44、。第六部分临床结果判读一、结核病的诊断应用核酸MALDI-TOfMS技术检测结核分枝杆菌复合群是实现临床快速诊断结核病强有力的辅助工具，可提供临床医生早期精准诊断和治疗参考。临床医生在诊断肺内外结核病时，须根据核酸MALDI-TOfMS检测结果，结合患者的流行病学史、临床表现、影像学特征、实验室检查等进行综合分析做出判断。对于阴性结果，尤其是一次呼吸道样本结果，不能排除结核病的诊断时，可根据临床情况和患者意愿，提供多次样本送检进行核酸MALDI-TOfMS检测以提高检出率。对于阳性结果，可进一步进行耐药性检测。推荐意见17:对于呼吸道样本，核酸MALDI-TOfMS检测结果为结核分枝杆菌阳性者

45、，可进一步参考WS2882017肺结核诊断50做出综合判断。对于经核酸MALDI-TOfMS检测为阴性而临床高度怀疑结核病者，可根据患者意愿，再次送样本进行核酸MALDI-TOfMS检测，以提高检出率。推荐意见18:对于非呼吸道标本，如脑脊液、胸腔积液、心包积液等各种体液样本核酸MALDI-TOfMS检测结果为结核分枝杆菌阳性，则具有较好的临床诊断价值，优先考虑肺外结核的可能。推荐意见19:对于鉴定为结核分枝杆菌复合群感染的患者，进一步进行一线和二线抗结核药物的耐药性检测，可实现快速诊断的目的，尽早提供精准的个体化治疗方案，有利于控制结核分枝杆菌尤其是耐药结核分枝杆菌的进一步传播。二、NTM病的诊断核酸MALDi-TOFMS检测结果为NTM阳性，还需要关注样本类型和具体的NTM菌种。NTM在自然界中普遍存在，大部分来源于土壤和水源等环境，对容易引起污染而非致病性的NTM菌种，如嗜血分枝杆菌、产黏液分枝杆菌、不产色分枝杆菌及土分枝杆菌等，要根据临床信息综合评定检测结果。虽然目前已有报道的NTM菌种及亚种近250种，临床上与致病相关的并不是很多。我国常见的致病NTM包括胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和蟾蛛分枝杆菌等。建议对致病NTM的检测结果,在排除操作污染或环境污染可能性的前提下，出具具体菌种报告，可进一步参考2007年美国胸科学会（ATS）/美国传