ATP荧光检测系统使用说明书解析.docx
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1、ATP荧光法微生物(细菌总数)快速检测系统运用说明书第一部分ATP荧光法微生物(细菌总数)快速检测系统简介1、系统原理32、组成部件及相关功能33、应用领域、特点、效益44、检测留意事项及操作步骤45、ATP快检系统运用留意事项及故障解除76、对应关系曲线87、有关食品平安和卫生检测的问答9其次部分ATP荧光法微生物(细菌总数)快速检测系统运用说明1、技术参数及性能122、仪器操作说明132.1开机、初始化132.2参数设置132.2.1选择RLU方式142.2.2选择其它样品名方式142.2.3设置文件类型152.2.4设置日期时间162.2.5设置检测时间162.2.6U盘格式化162.3
2、测试162.4查询172.4.1查询测试结果172.4.L1删除测试结果182.4.I.2删除文件182. 4.2查询文件信息193. 4.3查询仪器信息194. 4.4查询电池电量195. 4.5快速查询192.5通讯213、上位机软件226. 1软件安装226.2 驱动程序的安装256.3 软件启动276.4 软件运行286.5 样品及回来方程设定293.6“文件名”说明303.7文件、记录操作和数据库314、电池充电325、保修32第一部分ATP荧光法微生物(细菌总数)快速检测系统简介1X系统原理萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光能的生物催化剂萤火虫荧光素酶(简称虫光素
3、酶,luciferase)虫荧光素(D-Iuciferin)以及全部细胞生物都产生的生物能量物质一三磷酸腺甘(ATP)0在有氧的条件下,虫光素酶催化虫荧光素和ATP之间发生氧化反应,形成氧化荧光素并发出荧光,其生化反应式如下:ATP+D-LUCiferin+02史AAMP+Oxyluciferin+PPi+CO2+Light1.uciferase上式表明,只要具备适当条件,不仅萤火虫,即使在试管中也能发出荧光。当反应系统中,虫光素酶和虫荧光素处于过量的状况下,荧光的强弱取决于ATP的数量。以检测含细菌的样品为例,细菌细胞越多,ATP量越高,发出的荧光也就越强。由于虫光素酶对ATP的反应特殊灵敏
4、,荧光强弱可通过荧光仪1015秒内计量。所以,在解除样品中非细菌ATP干扰的状况下,通过荧光值就能确定样品中细菌ATP的含量,从而确定细胞数量,因此,此系统为半定量快速检测系统。2、组成部件及相关功能2.1 试剂组,按检测操作依次分为:(1)体细胞裂解试剂(TRA),能专一而有效地裂解样品中的非细菌细胞(体细胞)并释出ATP,然后,通过过滤比色杯底部的滤膜将其解除。(2)细菌细胞裂解试剂(XRA),能专一而有效地裂解样品中细菌细胞并释出ATPo(3)荧光反应试剂组(LLR),能与样品中的细菌ATP相互作用并有效地发出荧光。2.2 微量荧光检测仪(也称微量光度计),精确计量检样的荧光值。2.3
5、可供100次测定的样品预处理耗材。(1)放置过滤比色杯的杯架一个。(2)加压器一个,用于加压、排出体细胞ArP和试剂组。(3)带滤膜荧光反应比色杯100个,为荧光反应容器。(4)专用无菌吸水纸,置于过滤比色杯架,吸取加压后流出的液体。(5)带密封圈专用无菌浓缩器,用于浓缩样品。(6)自备微生物学无菌操作所需常规用具、器皿,样品采集无菌、无ATP的容器、塑料袋、手套、镣子等。3、应用领域、特点、效益运用ATP荧光法细菌快检仪实施食品、饮料、乳品加工等全程卫生学监测生产程序监测内容加工生产前生产设施清洁、消毒效果检测,原、辅料细菌总数检测,以保障原料质量或明确原料品质级别。加工生产过程中生产设备关
6、键限制点(例如供水、通风阀门)卫生学监测,影响乳品发酵饮料、酒类特殊微生物总数检测。加工生产后制成品污染细菌总数检测。废弃物排放、环境、人员卫生学及细菌总数检测。4、检测留意事项及操作步骤4.1 试剂的准备和留意事项:4.1.1 本公司供应的“ATP荧光法细菌总数快检系统”所含试剂组和微量荧光检测仪需匹配运用,不行用其它试剂替代。4.1.2 1.LR试剂(含萤火虫荧光素酶和D-荧光素)应在冰箱冷冻室-20C中贮存,有效期6个月。LLR试剂组易变质,室温下不得超过8小时,在0-4C有效期为3天。4.1.3 试剂(LLR)在用于检测前按规定低温存放,检测前20分钟取出平衡到室温方可应用。假如超过有
7、效期,应弃用,重新购置。体细胞裂解试剂(TRA)及细菌细胞裂解试剂(XRA)4保存。4.1.4 检测应按微生物学常规无菌操作程序进行,并切实留意萤火虫荧光素酶对ATP极其敏感,生物材料简洁引起ATP交叉污染的特性,才能取得精确、真实的检测数据。4.2 检测样品的预处理:(操作过程中需配戴一次性无菌手套)4.2.1 固体样品处理:无菌操作称取25g被检固体样品溶于225mlPBS溶液(磷酸盐缓冲液,GB/T4789.28-2023中3.22规定)中,混匀后抽取液体部分进行测试。(注:溶于PBS后所测结果为每克样品稀释10倍后所得光值)422物表及操作台面处理:取无菌棉签,在棉签头部滴加4滴体细胞
8、裂解试剂(TRA),用此棉签在被测处横竖来回匀整涂擦,并随之转动棉签,采样总面积IooCm2。将棉签置于ImIPBS溶液中摇匀,备用。4.2.3 液体样品处理:过分粘稠或颜色深重的样品必需用PBS溶液做适当稀释后进行检测。液体样品或以上样品前处理后光值太小,可视须要适当浓缩。液体被检样品含细菌细胞数若高于I(X)OCfU/ml时可干脆抽取50l被检样品进行测试。假如液体被检样品含细菌细胞数低于IO(X)CfU/ml时应进行浓缩处理,浓缩方法如下:打开专用浓缩器,用无菌镒子取无菌过滤比色杯放入专用浓缩器内,留意上下胶圈放好,以免浓缩样品时发生泄露,拧紧浓缩器。用一次性无菌医用针管抽取IOml或其
9、整倍数的被检样品,接到专用浓缩器上进行浓缩,用适当的压力缓缓地往下推注射器的柱塞(此时被检液体样品中的细菌被过滤比色杯的微孔滤膜截留,液体部分通过滤膜被排出)直到注射器与浓缩器中的液体部分完全被推出,拧开浓缩器,用消毒过的镣子从浓缩器中取出过滤比色杯备用。4.3 样品检测步骤:4.3.1 开机4.3.1.1 打开仪器电源前,拉开仪器抽屉,确保抽屉小槽内清洁无异物,关闭抽屉。4.3.1.2 打开电源,进行初始化及参数设置。(详见其次部分之2“仪器操作说明”)4.3.1.3 准备测试时,返回到主菜单界面(如下图),光标移动到“测试”选项。测试查询参数设置4.3.2试剂组本底的测定通讯4.321 取
10、出比色杯架,中间垫放”一用吸水纸,将未放置样品的过滤比色杯放入架孔内。432.2 拿起带白盖的TRA体细胞裂解试剂,向杯中滴加4滴,再用加压器置杯顶加压,排出杯中全部液体,由吸水纸吸净。再次重复滴加4滴TRA体细胞裂解试剂,加压排出杯中全部液体,由吸水纸吸净。432.3 .3拉开抽屉后,屏幕显示准备测试状态(如下图)。从杯架上取下过滤比色杯置于仪器可拉动抽屉小孔内准备测试432.4 .4拿起带绿色盖的XRA细菌细胞裂解试剂,垂直滴加2滴于杯中。432.5 .5用移液器从LLR试剂瓶吸取荧光反应试剂50l加入杯底,缓和地吸挤三次混匀。关闭抽屉,起先测试。(留意:加入LLR试剂后,反应已经起先,所
11、以操作应当快速,务求操作时间一样,对样品测试达到平行数据特殊关键。测量完毕前不行再拉动抽屉。)432.6 本底空白RLU读数应低于200,如读数过高,则提示过滤比色杯或试剂有污染。432.7 样品测定433.1 取出比色杯架,中间垫放5张专用吸水纸,将含浓缩后样品的过滤比色杯放入架孔内(不需浓缩的液体样品用移液器干脆吸取被检样50l注入过滤比色杯内进行测试)。433.2 拿起带白盖的TRA体细胞裂解试剂,向杯中滴加4滴,再用加压器置杯顶加压,排出杯中全部液体,由吸水纸吸净。再次重复滴加4滴TRA体细胞裂解试剂,加压排出杯中全部液体,由吸水纸吸净。433.3 拉开抽屉后,屏幕显示准备测试状态(如
12、下图)。从杯架上取下过滤比色杯置于仪器可拉动抽屉小孔内。准备测试433.4 拿起带绿色盖的XRAII垂直滴加2滴于杯中。433.5 .5用移液器从LLR试剂瓶中吸.八八兀反应试剂50l加入杯底,缓和地吸挤三次混匀。关闭抽旭,起先测试。(留意:加入LLR试剂后,反应已经起先,所以操作应当快速,务求操作时间一样,对样品测试达到平行数据特殊关键)433.6 依据“参数设置”所选测定模式,屏幕显示相应的测试结果。5、ATP快检系统运用留意事项、故障解除5.1 ATP快检系统运用留意事项:5.1.1 检测完毕后,须将微量荧光检测仪做适当清洁以免下次运用时交叉污染。仪表外部可用干净的微湿布巾擦拭,可拉动抽
13、屉可用沾有少许异丙醇或酒精的棉签擦拭。5.1.2 为保持检测工作台不受污染,可用75%医用酒精擦拭桌面,或在超净台内操作。5.1.3 操作时要戴一次性无菌手套,或用75%医用酒精擦拭双手以免试剂、台面污染。5.1.4 临用前套上无菌移液管尖,运用移液器吸取或转移试剂、样品时务求精确,避开移液器与样品或试剂交叉污染。5.1.5 完成检测后,立刻取下过滤比色杯。未取出前,避开晃动或倒置微量荧光检测仪以免杯内试剂溅出污染光学部件。5.1.6 冷藏或冷冻样品将导致其中微生物(细菌)细胞ATP量明显变更,应于避开,或待完全解冻平衡至室温后再做检测并设置比照。5.1.7高盐、高离子、高糖或高油脂组份将干扰
14、ArP检测,重复加入体细胞裂解试剂(TRA)可改善。5.2故障解除:故障可能缘由解除方法在无过滤比色杯或样品状况下,可拉动抽屉推入后,仍显示高背景读数1、抽屉被样品污染2、光敏部件有误1、用酒精擦抽屉去除污染2、更换或检修测光仪有样品的可拉动抽屉推入后无读数1、电池电量不足2、断电3、可拉动抽屉关闭不严1、如显示电池电量不足,需充电2、查对供电状况3、重新关闭抽屉给出的读数显著低于应有读数1、试剂过期,失效2、加入LLR试剂后没1、刚好更换试剂2、更换样品,重新试验读数有立刻关闭抽屉读数3、样品经冷冻或冷藏后使其中的细菌细胞内ATP量显著降低3、待样品及试剂复原到室温后再测定6、对应关系曲线6
15、.1 ATP浓度和相应荧光值(RLU)关系曲线(nu)也亲赵我哭ATP浓度(attoIlIoI)与分别表示接受本公司供应的微量荧光检测仪及美国NewHorizons公司PRoFlLE-I-3560微量荧光检测仪所得结果。分别以IOg相对荧光值(RLU)、IogATP浓度(attomol)值为纵坐标和横坐标作图(y=0.8362x+1.175,R2=0.9866)上图表明,在ATP浓度为Ipmol-Inmol范围内,ATP浓度与RLU呈线性关系。6.2 不同浓度多种细菌混合物荧光值和相应细胞数关系曲线图羯圉总数(cFun)、分别表示三批次不同浓度大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌培育物的混合物,
16、进行平皿计数和相对荧光值检测(本公司微量荧光检测仪),并分别以log相对荧光值(RLU)和IOg平皿计数值(cfuml)为纵坐标和横坐标作图。由上述关系图推演的RLU-CFU(相对荧光值对应细菌菌落总数)可供参考。7、有关食品平安和卫生检测的问答一问:哪些因素可能影响食品平安和卫生?生物(如细菌总数超标、致病菌污染等)、化学(农药残留、有毒添加剂等)、物理(放射污染等)及转基因产品(有害遗传效应等)四大因素。其中,以细菌污染食物、饮用水引发食源性中毒最为常见,其危害的范围最广。二问:国内外通常接受什么方法进行食品细菌总数和卫生、防疫检测?“常规法”和“ATP荧光快检法”。常规法是我国卫生部规定
17、至今照旧沿用的方法,因此,又称“国标法”,即(细菌)活细胞平皿计数法。三问:“常规法”和“ATP荧光快检法”的共同点和主要差别是什么?两种方法都能用于检测样品中的细菌总数,供应有关卫生防疫数据。主要差别在“时效性”,常规法至少要1-2天才能得到结果,快检法能在1-5分钟内得到实时检测数据。四问:为什么两种方法在“时效性”上有这样大的差异呢?因为它们所依据的基本原理各不相同。“常规法”是让检样中原先看不见的细菌细胞,在稀释涂布后通过在养分琼脂培育基上37,48小时的保温培育,这样,一个活的细菌细胞经多次分裂繁殖形成数以亿计,肉眼可见的细菌集群(菌落),然后通过计数得到结果,即菌落形成单位/毫升(
18、克)CFUml(g)“ATP荧光快检法”则基于虫光素酶能催化细菌细胞的ATP发出荧光,荧光检测仪能快速、精确计量荧光值的原理。因此,检样中细菌细胞越多,ATP量就越大,发出的荧光就越强。这样,在解除检样中非细菌ATP干扰的状况下,检测荧光值(RLU)就能确定细菌的细胞数CFUml(g)五问:两种检测方法哪一种更精确?两种检测方法得到的数据一样吗?在回答这一问题前,让我们重温微生物学的两个基本概念:细菌或微生物对人类生活,生产造成的有利(如用于抗菌素生产)或有害影响(如污染食品、引发疾病)都非单一或少数细菌细胞的作用,而是单位体积内数以十万、百万细胞群体的效应。其次在适宜条件下,细菌每20-30
19、分钟就能分裂繁殖一代。以大肠杆菌为例,10万个细胞/毫升二小时后就成了640万细胞/毫升。因此,正确的回答是,两种方法都能满足特定时期细菌总数检测和卫生监测的需求,但时效性有重大差异。快检方法更有利于保障食品平安水平的全面提高。通过常规法和ATP荧光快检法实际检测建立一个两者之间可以相互参照,符合食品平安卫生标准的有效范围(如合格、警告、不合格)是发达国家的通用做法。六问:在食品平安方面国外有哪些值得借鉴的阅历和措施?上世纪90年头后,美、英、日等国就已依据萤火虫发光原理,研制并推广运用ATP荧光法快检设备用于检测食品细菌总数或卫生防疫监测。这些设备既能供应实时的检测数据,又有精确、便携、运用
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