变质米饭中霉菌的分离提纯.docx

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1、变质米饭中霉菌的分别提纯【摘要】粮食是最易被霉菌污染的一种食品原料，霉菌污染会造成粮食的霉烂变质，其产生的毒素会造成人畜中毒，而发霉变质的米饭中就有很多细菌，我们要从众多的细菌中提取我们试验所需要的一种霉菌，所以我们就要进行霉菌的分别与提纯。培育基是人工配制的适合微生物繁殖或积累代谢产物的养分物质，用以培育、分别、鉴定、保存各种微生物或积累代谢物。本试验用的培育基是查氏培育基，它是培育霉菌用的，用以供应氮源、碳源及能源等。把从变质的霉菌中提取的较纯的霉菌接种到培育基中培育，进而再分别，最终提纯得到纯洁单一的霉菌。然后将得到的霉菌做一些相对应的染色试验，再次验证霉菌的性质。【关键字】米饭分别提纯

2、鉴定霉菌(mold)是能引起物质霉腐的丝状真菌(MyCeIiaIfungus)的统称，它不是分类学上的名词，而是真菌(FUngUS)的一部分。凡是生长在培育基上成绒毛状或棉絮状菌丝体的菌，都称之为真菌。霉菌分别属于植物分类学的菌类植物的子囊菌纲(一、COmyCeteS),藻状菌纲(PhyComCeteS)和半知菌纲(FUngiimperfecti)0霉菌在自然界中分布极为广泛，土壤、空气、水和生物体内外处处都有，与人们日常生活关系亲密。霉菌除应用于传统的酿酒、制酱和制作其它发酵食品外,在农业、纺织、食品、医药和皮革等方面都起着极为重要的作用。但是，不少霉菌(黄曲霉、灰绿曲霉、绿青霉等)能在食品

3、、谷物上生长并产生真菌毒素。粮食中经常生长的主要是寄生性和腐生性霉菌，其种类约有200多种。发霉变质的米饭中有很多细菌，要想混杂的细菌群体中获得只含有某一或某一株细菌，就得进行微生物的分别与纯化。常用方法有：简洁单细胞挑取法及平板分别法。本试验运用平板分别法。它是依据所分别的微生物的生长条件加入某种物质或选择某一温度、酸碱度等，进行培育，淘汰一些不需要的微生物，从而得到所需的微生物。1.试验材料和方法1.1.1变质的米饭1.1.2培育基：查氏培育基水500mlNaNO32gK2HPO4IgKCl0.5gMgSC)40.5gFeSO40.01gPH6.8蔗糖30g琼脂20g1.1.3试验器材培育

4、皿三角瓶试管酒精灯接种环试管架天平灭菌锅培育箱100ml量筒IOml量筒400ml烧杯震荡器等1.2方法：1.2.1试验前预备米饭处理：取一些米饭，滴上数滴葡萄糖液，再放到潮湿阴凉避风的地方，使其发霉变质，备用。器皿清洗：用洗衣粉把培育皿洗洁净，灭菌备用器皿消毒灭菌：需要灭菌物品用牛皮纸包好后高压蒸汽灭菌试剂配制：乳酸石炭酸棉蓝染色液1.2.2培育基配制依据所示配方将培育基配置完成后，用棉塞赛好，包上牛皮纸，放在高压放在高压灭菌锅中，于121C125C下灭菌30分钟后取出。灭完菌后趁热倒平板：将其匀称倒入12个培育皿和3支试管中。其方法是右手持盛培育基的锥形瓶，置火焰旁边，左手拿培育皿并松动锥

5、形瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。锥形瓶口在火焰上灭菌，然后在左手将培育皿盖在火焰四周打开一缝，快速倒入培育皿约20ml,加盖后轻轻摇动培育皿，使培育皿匀称分布，平置于桌面上。（3支试管则是倒斜面）待冷凝后，置37C培育箱中培育24h,若无杂菌生长，即可使用。1.2.3无菌水的制备：瓶中放入90ml.水，另取5支试管各放入9ml.水，绑好后经高压蒸汽灭菌制备成无菌水。124霉菌稀释液的制备：精确称取编制的米饭10g,放入装有90ml.无菌水并放有小玻璃珠的250ml.锥形瓶中，置于摇床上振荡20min,使微生物细胞分散，静置2030s,即成10稀释液。再用Iml无菌吸管，吸取10稀释液

6、1ml,移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合匀称，即成ICT?稀释液；再换一支无菌吸管吸取IO稀释液1ml,移入另一支装有9ml无菌水的试管中，也吹吸3次,即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成的3、osIO稀释液。1.2.5霉菌的接种：将1.21中制备好的培育基的三个平板分别用记号笔写上10410、10-5三个稀释度。然后用三支Iml无菌吸管分别从IOAI。-%10-5三支霉菌稀释液中吸取0.1ml稀释液对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌铁推棒在培育基表面轻轻地涂布匀称。（每种稀释度培育基编号设3个重复。）将涂抹好的平板平在桌上静置2030min,使菌液渗透入培育基内。

7、126霉菌的培育：将接种好的霉菌平板倒置（即皿盖朝下放置），放在27C恒温箱中培育48h。若消失圆形稍扁平的黄色菌落，其四周培育基亦为黄色者初步鉴定为霉菌。1.2.7霉菌的平板菌落计数：选择平均菌落数在30-300之间的稀释度作为菌落总数测定标准，乘以稀释倍数。划线分别：从上述接种培育好的培育基中选择出菌落生长最好的某浓度下的霉菌，将其单个菌落分别挑取接种到此外3个平板培育基中（用划线法接种）。划线完毕后，盖上皿盖，倒置，放入27恒温箱中连续培育。霉菌的纯化：挑取生长得较好的霉菌，用划线法将菌接种到3支已备好的试管斜面培育基中，放入27恒温箱中连续培育。2 .试验结果2.1 分部进行，并对结果

8、进行观看在培育好的培育基中选择出菌落生长最好的某浓度下的霉菌后，将其单个菌落分别挑取用划线法接种到此外3个平板培育基中，放入27C恒温箱中连续培育，观察了颜色较纯的黑色菌落，再从从3个培育基中再次挑取生长得较好的霉菌，用类似方法将菌接种到3支已备好的试管斜面培育基中，放入27恒温箱中连续培育，得到了我们本次试验的试验成果。稀释度10-3IO410-5123平均123平均123平均菌落数（cfu平板）202530253840574524162020生长状况菌落数较多，杂菌也比较多，菌落成丝状，颜色简单，环境干燥。菌落数最多，环境较为干爽，丝状物相对削减，颜色为黄、白、绿的占大多数较为明显，有杂菌

9、。菌落数较少，仍有丝状体存在，且菌落较为单一，黄色居多，也伴有少数白、绿色。稀释浓度为10-5的菌落生长示图分别提纯后的平板纯种黑曲霉2.12 镜检观看用水浸片观看法对菌体进行观看。在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从平板培育基里提取少量带有抱子的霉菌菌丝，放入载玻片的液滴中，盖上盖玻片，用低倍镜观看后转入高倍镜即可观察黑色的袍子囊以及透亮的分生抱子梗。镜检观看后确定为黑曲霉且无杂菌。2.13 便方法的对比将长势良好的菌落直接挑取菌种接入平板培育基中放入27恒温箱中培育，一段时间后拿出来对其进行镜检，显微镜下看到的同样为纯种的黑曲霉，无其他杂菌，镜检后将其接种于斜面试管中放回27

10、恒温箱中培育，数天后将经过划线步骤处理的试管与未经划线处理的试管一同对比，外观上大致相同，并未发觉其余特别状况。此方法省略了常规试验中的划线步骤对菌种进行提纯，这种做法不仅可以提高试验效率缩短试验的完成时间，还由于不用经过划线步骤才对菌种进行分别在原料的用量上也可以达到肯定的节省效果。试验结束后，选取长势良好，品质优秀无杂菌的一只试管上交为本次试验的成果。通过本次试验以及对试验结果的对比分析，由此结果可看出稀释度为10-4时的菌落平均数为40,介于3O3OO之间，依据试验原理，应选择稀释度为10-4时的菌落平均数作为菌落总数的测定标准。因此所用饭团样品中每g样品的菌数（个/克）=同一稀释度几次

11、重复的菌落平均数XIOX稀释倍数=40X1010-4=4.0IO33 .试验分析与小结3.1 试验证明，饭团变质后会生长很多的微生物，其大多数为霉菌，而霉菌的种类繁多，在不同的环境条件下所生长的主要菌种又会有各有差异，但不论生长的是何种霉菌，绝大多数霉菌都会长出菌丝体，由于霉菌不同于细菌及酵母菌，绝大多数是多细胞的微生物，由菌丝构成的，菌丝可无限伸长和产生分枝，分枝的菌丝相互交织在一起，形成了菌丝体。3.2 不同种类的霉菌对环境的要求也会有不同，如温度、PH值、湿度等都会造成培育出来的霉菌种类有所差异，因此本次试验在PH值为6.8,温度为27C的状况下培育得到的菌种为黑曲霉，并且通过镜检观看得

12、到了证明。3.3 试验开头时在菌种的稀释与第一次接种有些仪器使用以及操作上的不娴熟造成了小失误，导致有的不同浓度培育基生长状况消失类似，以及第一次接种时灭菌操作的疏忽导致杂菌的侵入，所以第一次的培育基上生长着较多杂菌给下一步菌种的分别提纯工作带来了很多不便。3.4 培育基内的养分物质对所培育的菌体起着关键性的作用，某些物质甚至直接影响某种菌体的生长，由于称量与溶解时铺张了一些材料，在倒好平板后发觉某些培育基的颜色比较深某些培育基的颜色比较浅，初步断定为培育基所含的某种物质在每个培育基中的含量不一，试验中发觉培育基颜色较浅的培育基菌种生长较为旺盛并且菌落较纯。总的来说，我们本次试验是比较胜利的，

13、我们胜利从变质的饭团内分别出了黑曲霉，并且将其将其进行了纯化培育，胜利上交了我们的试验成果。在为时长达两个半星期的试验中，整个试验过程都让我们受益匪浅。并且本人发觉在菌落较为稀疏的培育基中进行下一步分别培育会比较便利快捷，且经过其次次培育以后的培育基各菌落生长良好并且已经达到了肯定的分别纯化目的，通过对比试验证明，不用经过划线步骤同样也可以提取到纯种的菌体，可直接在菌落生长茂密且菌种特征明显的地方直接挑取纯种进行纯化培育，同样能得到纯种的菌体，并且与依据课本步骤试验出来的上交的成果不相上下。4 .参考文献1无锡轻工业学院，天津轻工业学院合编，食品徽生物学，轻工业出版社，19872周与良，邢来君编，真菌学商等教育出版社，19863项琦主编，粮油食品徽生物学检脸，中国轻工业出版社，19924马振流，李象洪，陈枪雄编著，防霉学云南科技出版社.19905殷淆申主编，食品微生物学，中国封政经济出版社，19916李昆太,黎循航,涂国全,等.生物防腐剂对细菌、霉菌和酵母菌类抑菌效果的初步测定7.江西农业高校学报,2002,24(5):599-601.