益气散聚方对肥胖相关肾小球病模型小鼠AMPK信号通路影响及机制研究.docx

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1、益气散聚方对肥胖相关肾小球病模型小鼠AMPK信号通路影响及机制研究*方明珠2徐艳秋I顾耀东II上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肾内科（上海200437）2上海市第六人民医院金山分院中医内科（上海201599）方明珠1987.12女籍贯：河南主治医师研究生硕士研究方向：中西医结合防治肾脏病及心血管疾病徐艳秋1971男籍贯：上海主任医师博士研究方向：中西医结合治疗肾脏病，尤其是代谢性疾病引起的肾脏损害基金项目：上海市卫生和计划生育委员会中医药科研项目编号2012JAO（H（摘要）目的：探讨益气散聚方对肥胖相关性肾小球病触发因素AMPK及其诱发的炎症状态、肾损害的影响，阐明益气散聚方防治肥胖相关

2、性肾小球的作用机制。方法：随机将6周龄的60只雄性C57BL/6试验小鼠进行分组，可分为正常组、西药组、中药组、中西医结合组、模型组，给正常组小鼠用生理盐水与普通饲料进行灌胃、给西药组小鼠用二甲双脏与高脂饲料进行灌胃、给中药组小鼠用益气散聚方与高脂饲料进行灌胃、给中西医结合组小鼠用二甲双服、益气散聚方与高脂饲料进行灌胃、给模型组小鼠用生理盐水与高脂饲料进行灌胃。经过1个月的治疗后对小鼠的肥胖体质进行观察,检查并观测24h尿蛋白定量、尿RBP、尿NAG的变化情况，利用HE染色、免疫组化于镜下对肾脏组织的病理变化情况进行观察，同时对肾脏组织内TGF-01、MCP-1P-AMPKamRNA含量进行检

3、测。结果：治疗1个月后对比正常组与中药组、模型组、西药组的小鼠体重，发现后3组的体重均增大（P0.05）；中西医结合组小鼠与其他各组相比体重下降明显（P0.05）；治疗1个月后对比模型组与中药组、中西医结合组、西药组的24h尿蛋白定量、尿RBP、尿NAG含量，后3组含量均降低（P0.05)；治疗1月后对5组小鼠免疫组化的结果进行对比，发现中西医结合组、西药组、中药组比模型组的PAMPK-含量升高明显(P0.01)；实时定量PCR：中药组、中西医结合组治疗4周后MCP-ImRNA、TGF-PlmRNA表达下降，两组较模型组均降低(P0.01)；中药组、西药组、中西医结合治疗4周后PAMPKamR

4、NA表达升高，三组较模型组均升高(P0.05);miceintheintegratedtraditionalChineseandwesternmedicinegroupdecreasedsignificantlycomparedwithothergroups(P0.05);After4weeksoftreatment,theurineNAG,urineRBP,urineMA,24hurineproteinquantitativeofmiceinthetraditionalChinesemedicinegroup,westernmedicinegroup,andintegratedtraditi

5、onalChineseandwesternmedicinegroupwerelowerthanthoseinthemodelgroup(P0.05);theimmunohistochemicalresultsshowed:thetraditionalChinesemedicinegroup,thewesternmedicinegroup,andtheintegratedtraditionalChineseandwesternmedicinegroupweretreatedAfter4weeks,theexpressionofPAMPK-wassignificantlyhigherthantha

6、tofthemodelgroup(P0.01);real-timequantitativePCR:theexpressionofMCP-1mRNAandTGF-lmRNAdecreasedafter4weeksoftreatmentinthetraditionalChinesemedicinegroupandtheintegratedtraditionalChineseandWesternmedicinegroup.TheexpressionofPAMPK-(XmRNAincreasedafter4weeksoftreatmentinthetraditionalChinesemedicineg

7、roup,thewesternmedicinegroup,andthecombinedtraditionalChineseandwesternmedicine,andtheexpressionofPAMPK-mRNAincreasedinthethreegroupscomparedwiththemodelgroup(P0.05).Conclusion:YiqiSanjuRecipecanimprovetheexpressionofAMPKinobesity-relatedglomerulopathymodelmice,andinhibittheexpressionofinflammatoryf

8、actorssuchasMCP-IandTGF-l,therebyimprovingthekidneydamagecausedbyobesity.KeywordsObesity-relatednephropathyYiqiSanjuRecipeAMPKsignalingpathwayInflammatoryfactors肥胖相关性肾病为代谢紊乱所导致的肾病，该病的诱因多为肥胖。其特点为起病隐匿、临床特征不明显、大多病人就诊时已有显性蛋白尿现象。AMPK是调节细胞能量代谢的中心环节，AMPK在肾脏内广泛表达UZ,其活性受抑在导致代谢失衡的同时会激发氧化应激反应,释放一系列炎症因子，引起足细胞肥大

9、、系膜扩张和系膜基质积聚等ORG的肾脏特征性病理改变3支因此AMPK信号转导通路的异常对于肥胖相关性肾病来说，既是原发病的直接致病因素，又是其肾脏并发症的重要病理基础。改善AMPK信号转导通路的异常，对于阻断原发疾病的进展和防治肾脏并发症的发生，都具有重要而积极的意义，遗憾的是目前无相关的化学药品面市。益气散聚方作为治疗肥胖相关性肾病的基本方，是王文健教授依据“聚证理论创立的，该法用于临床收到了良好的疗效，不仅改善了肥胖程度，而且减轻了炎症反应状态L本研究通过观察益气散聚方对肥胖相关性肾病模型小鼠AMPK信号通路影响，探讨AMPK诱发炎症反应的相关机制。材料与方法1 .实验动物：6周龄的60只

10、雄性C57BL/6试验小鼠，每只小鼠体重相差不大，平均体重约18g,提供自北京实验动物中心，现饲养于中国医药工业研究总院动物实验中心。2 .主要药品及试剂：益气散聚方：黄黄、黄连、泽泻、茵陈、蒲黄，由江苏江阴天江药业有限公司制成独立包装的浓缩颗粒剂（每包相当于中药饮片黄黄12g、黄连3g、泽泻5g、茵陈7.5g、蒲黄7.5g的剂量）。石蜡切片糖原染色试剂盒（上海生物歌凡生物科技有限公司）；Trizol（上海邦景实业有限公司）；CDNA合成试剂盒（汉恒生物公司）；荧光定量PCR试剂盒（江苏科景生物科技有限公司）。3 .实验方法3.1 模型制作将所有C57BL/6雄性小鼠进行为期1周的适应性饲养后

11、，将其进行随机分组，分为模型组与正常组2组。造模的参考文献为通过喂养高脂饲料而诱导肥胖的模型（Anne-EmiIieD,AnnaVM,RobynCunnard,etal.AMPKMediatestheInitiationofKidneyDiseaseInducedbyaHigh-FatDiet.JAmSocNephrol,2011,22:1846-1855.）o所有小鼠进食、饮水均不受限制，所处室温在15-25C,湿度65%5%,交替照明周期为12小时。饲料的配方如下：猪油20%、胆固醇2%、食用盐5%、胆盐0.5%、脱脂奶粉10%、白砂糖10%、普通饲料53.5%,委托北京实验动物中心进行加

12、工制作。3.2 实验分组根据随机原则对成功造模的小鼠进行分组，可分为以下4组，即模型组、西药组、中西医结合组、中药组，中药组为18只，其余3组每组12只。3.3 药物干预造模4周后开始用药，根据人鼠剂量换算约为成人剂量的20倍灌服药物，每天一次，每次0.5ml。正常组：生理盐水。模型组：生理盐水。中药组:益气散聚方（益气散聚方免煎颗粒剂，浓度为1.5gml）o西药组：盐酸二甲双胭,0.5g片，中美上海施贵宝制药有限公司，批号：，配制成浓度为0.25gml的混悬液。中西医结合组：益气散聚方+盐酸二甲双胭。4 .标本采集与检测4.1 标本获取：实验期间，动物自由摄食和饮水，每隔2周称取动物体质量，

13、尾静脉测血糖，并将各组小鼠置代谢笼24h,不予喂食，但饮水自由，对其尿液进行留取，Id后将小鼠尿液收集起来进行离心处理，离心设置离心时间5min,转速为3000rmin,分离上清后将其进行冷冻保存。实验第4周末将各组标记1-6号小鼠腹腔内注射4%水合氯醛0.2ml20g,成功麻醉小鼠进行手术准备，沿腹白线使用手术剪将其腹腔逐层打开，取其两侧肾脏并称重，取左肾下极的1/3肾组织，将其置与10%的福尔马林固定液内，用于制作石蜡切片并行HE染色，分析肾脏病理改变，右肾及左肾上级2/3置1.5ml生理盐水离心管中，-70C低温保存，用于基因蛋白检测。实验8周末，将剩余小鼠麻醉、打开腹腔取肾脏，具体步骤

14、和检测方法同上。4.2 检测一般项目：血糖：禁食Id后，剪取小鼠尾血，应用血糖仪对小鼠血糖进行测定。体质量:每14d通过电子计重器对小鼠的体质量进行称取并进行记录。尿NAG、尿RBP、尿MA、24h尿蛋白定量：全制动生化仪化学发光法检测。4.3 肾脏组织HE染色。使用MotiClmageSAdVanCed3.2医学图像分析系统对其进行统计。每片测量20个肾小球的肾小球直径，计算均值后记为最终结果。利用免疫组化的半定量法对P-AMPKa蛋白含量进行检测。通过MotiCMed6.0软件对免疫组化结果进行分析，具体分析方法为“点计数法”，每个样本为完整且不重复的20个肾小球，计数测试系统用点密度代表

15、结果，即阳性面积H7总肾小球襟面积比，计算均值后记为最终结果。通过实时定量PCR对TGF-pl、MCP-1、PAMPK-mRNA的表达进行测定。5 .统计学方法所有数据均用统计软件SPSSl8.0处理，计量资料数据以（3s）表示，采用t检验；等级资料和非服从正态分布的计量资料用非参数Wilcoxon秩和检验，以中位数（M（P25,P75）表示；计数资料采用2检验；多组间比较采用多元方差分析检验。以P0.05）,中西医结合组小鼠治疗4周后体质量较中药组、西药组、模型组下降（PVO.05）。详见表1。表1各组小鼠用药后体质量动态变化（x,g）组别例数_体质量第4周末第8周末正常组627.80+0.

16、5330.57+2.11模型组628.931.3732.622.45西药组629.02+1.5731.932.81中药组929.831.2832.26+2.20中西医结合组629.381.7727.835.55*&注：*PV0.05,VS同时间点模型组；IlPVo.05,VS同时间点中药组；V0.05）；治疗1个月后，对比模型组与中西医结合组、中药组小鼠血糖，发现后者较前者降低明显（尸0.05）,详见表2。表2各组小鼠接受干预后的血糖动态变化情况（N,mmol/L）血糖组别例数第4周末第8周末正常组63.672.042.970.47模型组3.320.603.580.82西药组63.580.44

17、3.820.55中药组93.231.203.14+0.80中西医结合组63.731.783.030.903 .治疗4周后小鼠尿MA比较模型组小鼠第4周末、第8周末尿MA较正常组升高（P.05）；中药组、西药组、中西医结合组第8周末尿MA下降（PvO.05）；三组小鼠尿MA较模型组降低，且中西医结合组下降最明显（PVO.05）。见表3。表3各组小鼠干预后尿MA动态变化（xsfgmL）分组例数尿MA第4周末第8周末正常组616.710.76*16.590.6模型组641.603.3547.653.12tt西药组644.422.7041.042.02*w中药组945.393.2139.703.04*

18、中西医结合组646.232.6723.442.40*注：*PV0.01,*P0.05,VS同时间点模型组；nP0.05）；对比模型组与中药组、中西医结合组、西药组小鼠在第2个月末的尿RBP值，发现后3组尿RBP值均降低，且比模型组下降明显，详见表5o表5各组小鼠干预后尿RBP动态变化（M（P25,P75）,mgL）尿RBP组别例数第4周末第8周末正常组61.78(1.58,1.90)1.93(1.86,2.45)模型组61.86(1.79,1.93)2.81(2.69,3.36)西药组62.03(1.72,2.52)1.27(0.09,1.35)*中药组92.06(2.31,2.40)0.52

19、(0.50,0.86)“中西医结合组62.33(2.32,2.50)0.65(0.50,0.88)*注：*PV0.0LVS同时间点模型组；*PV0.05,组内比较。6治疗4周后小鼠24h尿蛋白定量比较模型组小鼠第4周末、第8周末24h尿蛋白较正常组升高（PVO.05）；中药组、中西医结合组第8周末24h尿蛋白定量下降（PVO.05）。中西医结合组、中药组比模型组、西药组降低明显（PVO.05）。详见表6。表6各组小鼠接受Id干预后尿蛋白的动态变化（xs,mgL）24h尿蛋白定量组别例数第4周末第8周末正常组60.670.33*0.960.52*模型组61.940.392.511.22西药组62

20、.070.572.30+1.07中药组92.180.71L350.81&中西医结合组2.21 1.071.560.82注：*PV0.05,*PV0.01,VS同时间点模型组；nP0.01,VS同时间点西药组。&PV0.05,组内比较。7治疗4周后肾脏病理改变1）基本肾脏病理改变：模型组、中药组、西药组、中西医结合组治疗4周后肾小球体积增大，肾小球囊腔变小，固有细胞无增生，系膜区未见明显增生,肾小管间质正常，未见细胞浸润，肾血管未见异常。详见图1。E图1各组小鼠肾脏H&E染色（X200倍）A:模型组；B:西药组；C:中药组；D:中西医结合组；E:正常组2）肾小球直径变化：模型组小鼠第4周末、第8

21、周末肾小球直径较正常组升高,（P0.05）o中药组治疗前后肾小球直径下降（PVO.05）o见表7表7各组小鼠肾小球直径变化（xv,m）组别例数肾小球直径第4周末第8周末正常组649.972.84*48.643.06*模型组660.053.0764.44+1.65西药组656.571.8161.50+1.01中药组969.063.4460.274.64*中西医结合组661.831.5456.973.47注:*PVOo5,组内比较；#PV0.05,VS同时间点模型组。3）各组小鼠肾脏组织PAMPK-a免疫组化光镜下可见显色后的PAMPK-呈棕褐色，主要在肾脏组织毛细血管内皮细胞和肾小管上皮细胞表达

22、。模型组第4周末、第8周末肾脏组织PAMPK-表达较正常组比较明显下降（P0.01）;中药组、西药组、中西医结合组第8周末PAMPK-（I表达较模型组比较有明显升高（P0.01）。见表8,图2。表8PAMPK-a阳性面积（xs）分组例数PAMPK-阳性面积第4周末第8周末正常组6779.89100.31ww785.8963.90#模型组6338.2225.22281.3324.29西药组6303.0078.01452.89+47.15#中药组9379.44123.61482.2239.45*中西医结合组6369.33119.50497.5646.58*注：,VOPLVS模型组。C图2各组小鼠肾

23、脏免疫组化A:模型组；B:西药组；C:中药组；D:中西医结合组；E:正常组8治疗1约后各组小鼠的TGF-PImRNA、MCP-ImRNA、PAMPK-mRNA的表达模型组小鼠第4周末、第8周末MCP-ImRNA、TGFfimRNA表达较正常组升高，PAMPK-CimRNA较正常组下降（PD.05）；第2月末中西医结合组、中药组的TGF-m、MCP-ImRNA均下降，且两组对比模型组发现前者均降低（P0.05）；第2月末西药组的TGFFmRNA含量升高，与模型组进行对比，发现前者升高（PD.05）；中药组、西药组、中西医结合组第8周末PAMPKmRNA升高，三组较模型组均升高（PVO.05）,详

24、见表9、表10。MCP-1、TGF-rPAMPK-a基因PCR扩增动力学曲线见图3、图4、图5、图6。表9各组小鼠接受干预后TGF-PI、MCP-ImRNA的动态变化（Ns）组别nMCP-ITGF-1第4周末第8周末第4周末第8周末正常组60.400.13tt0.41+0.05#0.29+0.080.390.1模型组61.741.041.991.01O.53O.350.710.66西药组61.80+0.931.64+0.180.96+0.361.560.89*中药组91.030.230.87+0.48*40.44+0.300.220.13*h中西医结合组60.630.100.370.45*w0

25、.620.100.590.14u注：*P0.05,组内比较；“PV0.05,VS同时间点模型组。表10各组小鼠干预后PAMPK-mRNA动态变化（x+v）PAMPK-a基因表达组别n第4周末第8周末正常组64.060.10w4.090.72w模型组63.44+0.123.420.05西药组63.550.264.840.24*中药组93.630.194.780.36*w注：*PIL-6的过程受到抑制U*AMPK还可以通过抑制肾小球内皮细胞NF-KB的表达，进一步抑制MCP-I的表达UL结合实验研究结果提示益气散聚方可通过提高AMPK的活性，抑制炎症因子TGFMCP-1、IL-6、TNF-a等的表

26、达，从而改善肥胖引起的肾小球肥大和肾间质纤维化。AMPK通过抑制JNK激酶发挥其抗炎作用oJNK激酶通过调控下游转录因子核因子B(nuclearfactor-B,NF-B),导致促炎性细胞因子释放。NF-B信号发挥主要作用的过程为激活先天免疫与适应性免疫系统肥胖时游离脂肪酸FFA(freefattyacid)通过脂肪细胞表面的TLR4(toll样受体4)介导，启动NF-KB炎症信号通路，诱导免疫炎症反应。研究发现活化AMPK通过对NF-KB信号进行抑制从而减少炎症因子表达。但肾脏内AMPK以及对炎症因子表达进行调控的具体机制尚未明确。参考文献：1 StapletonDzMitchelhillK

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