02蛋白质的结构与功能.ppt

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1、第二章 蛋白质的结构与功能,第一节 蛋白质的分子组成第二节 蛋白质的分子结构第三节 蛋白质的结构与功能的关系第四节 蛋白质的理化性质及其分离纯化第五节 蛋白质的分类,蛋白质(protein)概念：由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,蛋白质的重要性：蛋白质是构成生物体的基本成分蛋白质是细胞中含量最丰富的生物大分子，约占人体固体成分的45%，可达细胞干重的70%。蛋白质的生物学功能生物催化作用酶或辅酶如淀粉酶、蛋白酶代谢调节作用激素蛋白调节体内新陈代谢如胰岛素运动支持作用肌动蛋白、胶原蛋白、-角蛋白等运输储存作用血红蛋白、血清蛋白

2、免疫防御作用免疫球蛋白、血纤维蛋白原及干扰素接受传递信息作用受体蛋白氧化供能,第一节 蛋白质的分子组成,一、蛋白质的元素组成主要有C、H、O、N和S。有些蛋白质含有少量磷、硒或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。蛋白质元素组成的特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%；体内的含氮物质以蛋白质为主。通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式：蛋白质含量(%)=含氮量(%)6.25,二、组成蛋白质的基本单位氨基酸1、氨基酸的命名：系统命名法 俗称,2、氨基酸的结构特点：氨基酸的通式,特点：存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种。除脯氨酸为亚氨基酸外，其余1

3、9种均符合通式；除甘氨酸的R基为H外，其余19种-碳原子为手性碳原子，有L、D型之分，组成人体蛋白质的氨基酸均为L型；不同氨基酸的侧链基团不同。,3、氨基酸的分类：根据侧链基团的结构和性质不同将20种氨基酸分为4类：非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸,非极性疏水氨基酸：侧链为烃基、杂环等疏水性基团。这类氨基酸在水中的溶解度较小。,极性中性氨基酸：侧链为羟基、巯基、或酰氨基等极性基团，有亲水性，但在中性水溶液中不电离。,酸性氨基酸：侧链上有羧基，在水溶液中能释放出H+而带负电荷。碱性氨基酸：侧链上有氨基、胍基或咪唑基，在水溶液中能结合H+而带正电荷。,几种特殊氨基酸：甘氨

4、酸：结构最简单的氨基酸，无手性C，不是L氨基酸,-氨基乙酸（甘氨酸）,脯氨酸：亚氨基酸,半胱氨酸：可形成二硫键,必需氨基酸（essential amino acid)：机体不能合成，必需从食物中摄取，有八种：甲硫（蛋）、色、缬、赖、异亮、亮、苯丙、苏氨酸“假 设 借 来 一 两 本 书”修饰氨基酸：蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基酸。如：胱氨酸、羟脯氨酸（Hyp）、羟赖氨酸（Hyl）。非生蛋白氨基酸：蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生的。,4、氨基酸的理化性质物理性质 都是白色晶体，熔点较高。能溶于强酸和强碱溶液；在水中的溶解度各不相同。两性解离及等电

5、点,pHpI,pHpI,阳离子,阴离子,pH=pI,氨基酸的兼性离子,等电点(isoelectric point,pI)：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。“使某种氨基酸所带正、负电荷数相等时溶液的pH值。”,紫外吸收色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。大多数蛋白质含有这三种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,茚三酮反应氨基酸与水合茚三酮共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正

6、比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色化合物。,甘氨酰甘氨酸,肽键,三、氨基酸在蛋白质分子中的连接方式肽键(peptide bond)：由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,肽单元(peptide unit)：参与组成肽键的6个原子位于同一平面，又叫肽键平面。它是蛋白质构象的基本结构单位。,肽(peptide)：由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽，由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,肽

7、链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,生物活性肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)抗氧化剂，保护含巯基蛋白质活性,多肽类激素及神经肽,第二节 蛋白质的分子结构,一、蛋白质的一级结构概念：多肽链中氨基酸的排列顺序。主要化学键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,二、蛋白质的二级结构概念：肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要化学键：氢键,蛋白质二级结构的主要形式-螺旋(-helix)多肽链以肽键平面为单位，-碳原子为转折点，有规律的盘绕成右手螺旋结构，侧链伸向螺旋外侧。每3.6个氨基酸残基盘绕一圈，螺距为0.54nm。相邻螺

8、旋的肽键之间形成氢键，方向与长轴基本平行。,-折叠(-pleated sheet)多肽链呈伸展状态，肽键平面沿长轴折叠呈锯齿状，两平面间夹角为110，R基交替地伸向锯齿状结构的上下方。若干肽段互相靠拢，平行排列，通过氢键连接。氢键的方向与长轴垂直。,若两条肽段走向一致（N端、C端方向相同），称为平行式；反之，称之为反平行式，反向更稳定。,-转角(-turn)肽链内形成180回折。含4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与第四个形成氢键。第二个氨基酸残基常为Pro。不规则卷曲(random coil)：多肽链中除了以上几种比较规则的构象外，其余没有确定规律性的构象。,模体(motif)/超二级结构：蛋

9、白质分子中-螺旋、-折叠、-转角等组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的二级结构组合体，作为三级结构的单元，其基本结合形式有：,等。,结构域(structural domain)：分子量大的蛋白质，往往以超二级结构为单元组成两个或两个以上相对独立的区域，行使各自功能，再形成三级结构，这些相对独立的区域称为结构域。,三、蛋白质的三级结构概念：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,主要化学键：疏水作用力、离子键、氢键、van der Waals力等。,四、蛋白质的四级结构概念：蛋白质分子中各亚基的空间排布及相互作用。蛋白质的亚基(subunit)：参与构成

10、蛋白质四级结构的、每条具有三级结构的多肽链。主要化学键：疏水作用力，氢键和离子键,蛋白质结构中应注意的问题：由一条多肽链形成的蛋白质其最高级结构为三级，具有三级结构的蛋白质才具有生物学活性。形成蛋白质的四级结构至少要有两条多肽链。,蛋白质结构的小结：蛋白质一级结构是它的氨基酸序列蛋白质二级结构是多肽链主链的卷曲与折叠蛋白质三级结构是多肽链自然形成的三维结构蛋白质四级结构是亚基的空间排列主要作用力：一级结构：肽键、二硫键二级结构：氢键三级结构：疏水作用力、氢键、范德华力、盐键等四级结构：疏水作用力、氢键、盐键等,第三节 蛋白质的结构与功能的关系,一、蛋白质一级结构与功能的关系：一级结构是空间构象

11、和功能的基础一级结构决定空间结构与功能。一级结构相似、空间结构相似；一级结构不同、空间结构不同保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变,例如：分子病：由于基因结构改变，蛋 白质一级结构中的关键 氨基酸发生改变，从而 导致蛋白质功能障碍，出现相应的疾病。（镰刀形红细胞贫血等）,一级结构并非决定空间结构的唯一因素温度、离子强度，分子伴侣等分子伴侣：在蛋白质加工、折叠形成特定空间构象及穿膜进入细胞器的转位过程中起关键作用的一类蛋白质。与未折叠的肽段（疏水部分）进行可逆的结合，辅助二硫键的正确形成；引导肽链的正确折叠并集合多条肽链成为较大的结构；可以解聚错误聚合的肽段，防止错误发生。,二、蛋

12、白质空间结构与功能的关系：蛋白质构象决定生物学功能，构象改变，功能改变。例1：别构效应（allosteric effect）：蛋白质分子的特定部位（调节部位）与小分子化合物（效应物）结合后，引起空间构象发生改变，从而促使生物学活性变化的现象。包括正协同、负协同效应。肌红蛋白（Mb）：由一条多肽链组成。血红蛋白（Hb）：由22四聚体组成。,例2：蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。在某种

13、未知蛋白质的作用下可转变成-折叠的PrPsc，从而致病。,第四节 蛋白质的理化性质及其分离纯化,一、蛋白质的理化性质1、蛋白质的两性解离与等电点蛋白质的两性解离蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,蛋白质的等电点（pI）：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。体内大多数蛋白质的等电点在pH5.0左右，因而在生理条件下以阴离子形式存在。,2、蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达

14、1100nm，为胶粒范围之内。蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面同种电荷水化膜,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,水化膜,带负电荷的蛋白质,不稳定的蛋白质颗粒,蛋白质聚沉（Protein Precipitation),3、蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质的变性(denaturation)：在某些物理化学因素的作用下，蛋白质特定的空间构象被破坏，从而导致理化性质改变和生物活性丧失的现象。变性的本质：次级键断裂（有时也包括二硫键），空间结构破坏，但蛋白质的一级结构不改变。变性蛋白质的特点：生物学活性丧失 溶解度降低，易于沉淀 粘度增加，结晶能力消失 易被蛋白酶水解,造成变性的因素物理因

15、素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等。化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、尿素、重金属盐等。应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。,牛核糖核酸酶,蛋白质沉淀(protein precipitation)概念：在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出的现象。方法：盐析法、有机溶剂的沉淀、重金属盐沉淀、生物碱试剂沉淀。变性的蛋白质易于沉淀，但不一定都发生沉淀。沉淀的蛋

16、白质易发生变性，但并不都变性，如盐析。蛋白质的凝固(protein coagulation)：加热使蛋白质变性并凝聚成块状。此凝块不溶于强酸或强碱中。凝固实际上是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。,4、蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,5、蛋白质的呈色反应茚三酮反应(ninhydrin reaction)：蛋白质游离的-氨基可发生茚三酮反应。双缩脲反应(biuret reaction)：蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜

17、共热，呈现紫色或红色。双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。Folin-酚试剂反应蛋白质分子中的酪氨酸残基在碱性条件下与酚试剂反应生成紫蓝色化合物。其灵敏度优于双缩脲反应。,二、蛋白质的分离和纯化根据溶解度不同的分离纯化方法 盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀根据分子大小不同的分离纯化方法 透析、超滤、凝胶层析、离心根据电离性质不同的分离纯化方法 电泳、离子交换层析根据配体不同的分离纯化方法 亲和层析,1、透析及超滤法透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,2、丙酮沉淀、

18、盐析及免疫沉淀使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,3、电泳：带电粒子在电场中向相反电极移动的现象。影响电泳速度和方向的因素有：蛋白质颗粒所带电荷的性质、数量及分子的大小、形状。几种重要的蛋白质电

19、泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳：是蛋白质组学研究的重要技术。,4、层析待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。蛋白质分离常用的层析方法离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析：利用各蛋白质分子大小不同分离。,5、超速离心超速离心法(ultracentrifugation)既可以用

20、来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的分子量和形状相关。,三、多肽链中氨基酸序列分析改进的Sanger法,通过核酸推演的方法,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,有关蛋白质的纯度鉴定和含量测定蛋白质纯度：层析纯、电泳纯、免疫纯 纯度标准取决于测定方法的检测极限。蛋白质定量方法 克氏定氮法 Folin-酚法（Lowry法）双缩脲法 考马斯亮兰染色法 紫外分光光度法,四、蛋白质空间结构测定二级结构测定：圆二色光谱法三级结构测定：X射线衍射法(X-ray diffraction)核磁共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR),第五节 蛋白质的分类,根据蛋白质组成成分根据蛋白质形状 根据蛋白质功能,小 结,掌握：-氨基酸通式；20种氨基酸的名称、三字符号及结构；肽键、肽链、氨基酸残基及肽链书写规则；蛋白质一至四级结构的概念及稳定因素；蛋白质结构与功能的关系；模体、结构域、分子伴侣等概念。熟悉：谷胱甘肽的结构与功能；常见的蛋白质分离纯化方法；蛋白质的理化性质。了解：氨基酸的理化性质及蛋白质的分类；多肽链中氨基酸序列分析和蛋白质空间结构测定。,