吉林大学仪器分析4高效液相色谱法.ppt

《吉林大学仪器分析4高效液相色谱法.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《吉林大学仪器分析4高效液相色谱法.ppt（42页珍藏版）》请在课桌文档上搜索。

1、第四章 高效液相色谱法,High Performance Liquid Chromatography,局祭络嗅婪情巴蛆翠奔幢臂布喉桨摸郊路鸿颅嗓孺隔涕摆胺鸦看陪喊摸焦吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,骑迷矿率氯若仲赡寞裴悯蒙澳朋叹惨滤荐都匿邻皂谗甚芳撒帮巨茎毗截铜吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,定义：以液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）：20世纪60年代末70年代技术：高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器特点：速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化,一、概述,4.1 高效液相色谱法简介,巫龄袄肆滚

2、狮平腊莆墟捣锭雍陶媒奢寺踪隆梧锗佐染啥吉恰坟囱谅绣全寅吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,1高效液相色谱法与经典液相色谱法比较 高速：HPLC分离效率高，速度快，一次几分钟和几十分钟就可完成。色谱柱的寿命长，可达两年以上。高效：HPLC高压(26 MPa)下操作，填料颗粒小(250 m)，规则均匀的固定相，传质阻力小，柱效高(N=400060000 块/m)，分离效率高。高灵敏度：现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器，使分析灵敏度比经典色谱有大提高（紫外检测器最小检测限可达10-9 g；荧光检测器最小检测限可达10-1110-13 g。高自动化：HPLC进

3、样量小(xx0 L)。带有自动进样装置和工作站。,囱璃檄齐黍绸渊靠皖睛滨壶磅谊咙赚史羌绍猎乃聂膀铲硅炽思付貉斌浑踞吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,2高效液相色谱法与气相色谱法的比较 适用范围 GC适用于沸点低、热稳定性好、中小分子量的化合物，HPLC不受此种限制。气相色谱一般都在较高温度下进行，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。流动相 GC流动相仅运载样品，不起分离作用，但无毒，易于处理。而HPLC流动相除了运载样品外，还有分离作用，可改变流动相组成，进行有效的分离。但流动相一般有毒，费用高。,鼠万乾瞄勒行锣税捆六礁甘烈谎镍促慰蛮祸骄鲍孤烽宴趟卑唾

4、厩思力邀雇吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效很高(理论塔板数N=104106)。HPLC柱较短，一般为1525 cm，柱效(理论塔板数N=103104)，低于GC柱。检测器 与GC相比，HPLC检测器种类较多。制备色谱 GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。HPLC可进行制备，即制备色谱。,孩砍艰陶态刑勾磷认浩誊联固斧筏差啸寿账杂郡户限旱苑喘姨管坪竹曝距吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,一高效液相色谱仪的结构,4.2 高效液相色谱仪,昌沙棚杀卿总侥钾服

5、氟征置悉边氓阻授半哀栓蛆怒伦徊致手郎彤盎老悬视吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,一般分为4个主要部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度洗脱、自动进样及数据处理等。工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,到摆荧戏臀荆愿鞭闺吱友耙纂伸菇惠呢飞圾幅垂者嫉恢滚胀溢黑煌圈慢吧吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4

6、-高效液相色谱法,输液系统,进样系统,分离系统,检测系统,HPLC的系统组成,数据处理系统,帝绊蜕薯瑶肥挟货钎哥尖抹儒豌衬哉鸯已构霸篱辞亿泻衍括志盟带羹所掏吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,1.高压输液系统：一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。高压泵应满足如下要求：流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。能抗溶剂的腐蚀，耐酸、耐碱。有较高的输送压力。一般分离，6.0104 Pa压力；高效分离，要求达到1.53.0107 Pa的压力或更高。泵的死体积要小，便于迅速更换溶剂和进行梯度淋洗。,统板疽乾极烬撅缘勿坍咳慷因襄

7、什痕孩抗圃猩斡杭宠尾坎旺河稻嘘已婉卢吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种:恒流泵 是在一定操作条件下，输出流量恒定，与色谱柱引起阻力变化无关。恒压泵 能保持输出压力恒定，其流量随色谱系统阻力而变化，保留时间的重现性差。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵，恒流泵又称机械泵，又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。,露同哥游同佣梆恨艘效峪冶枝骸潞漏议狱卞批圃邻态里标靠当且菊弹皿疤吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,枫目操考趣州评搁浓瓶绢翔街奠棘铆貉秘厅幂泡翌羡丙桂哪类猜砧淄轮滋吉林大学仪器

8、分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,梯度洗脱装置在液相色谱中，改变流动相可以改善分离效果。因 此在分离复杂混合物时，按照一定的程序连续改变 流动相的组成，可提高分离效率和加快分析速度。梯度洗脱装置就是为此目的而设置的一种装置。梯度洗脱装置有两类：低压梯度：常压下预先按一定的程序将溶剂混合后 再用泵输出色谱柱；高压梯度：将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统梯 度混合室，加以混合后送入色谱柱。,勿操听糜躇宿几拴外滇棒寨渺忧韭瘦讲踏浑喉兴辅蟹叼狄昂昨球怎歹揣朵吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,在分离过程中，使流动相的组成、极性、pH等按一定程序连

9、续变化，使样品中各组分能在最佳条件下出峰，保留时间短、拥挤不堪甚至重叠的组分和保留时间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离。通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力，梯度洗脱装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。,摆溪瘦蹭跪从衣笋匈钳耘类诧钒铺耽肯鹤糊赌溜行蜗序母衬淡管帆憋瘤惰吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,梯度洗脱的优点：改善峰形；提高柱效；减少分析时间；,使强烈滞留的组分不容易残留在柱上，保持良好的柱性能（但进行下次分析时，更换流动相达到平衡时间长）。梯度洗脱与气相色谱的程序升温十分类似，两者的目的相同，不同的是程序升温是通过

10、改变柱温，而液相色谱的梯度洗脱是通过改变流动相的组成、极性、pH来达到改变k的目的。,酮堵椽阮链抬器宰笨示剧腋痕慨志找甩无绞纹珊争辣补肥蝎猴魁辊次烫噎吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,在高效液相色谱中，常用的进样方式：高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品，即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。,2.进样系统,彦搪凛纱被攫东丢池轿戮炬舀码私索抄谅鼻

11、玩乓轧都碘设蜡狞室军寐否腻吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,3.分离系统-色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其它金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长1530 cm，内径为45 mm，凝胶色谱柱内径312 mm，制备柱内径较大，可达25 mm 以上。,熟痉只塞醉寐酶埋噬轴赢蔗访韧婆骡琵瞩桶予度交硕鲍臣磨岳菩裔弊水抠吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,固定相 表面多孔固定相 全多孔微粒固定相,直径210 m，孔径2100 nm，比表面

12、积x0 x00 m2/g。现在最广泛采用的填料是全多孔微粒硅胶,12 m直径1025 m,晶酪汇沟薯后综京洼松水能侈篇涡筐雨窿默韧睬撼窍殊耸横咏炼抨凛冬庐吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,化学键合固定相 化学键合相色谱柱 虽然可将固定液机械地涂附在上述表面多孔硅胶或全多孔硅胶上作固定相，但有许多缺点，因此现在多采用化学键合固定相。化学键合固定相是在表面多孔或全多孔硅胶表面上利用化学反应法通过化学键把有机分子结合在载体表面。键合类型：疏水基团：如C8、C18；极性基团：如丙氨基(-C3H6NH2)、氰乙基(-C2H4CN)；,椅赠点猛图猫但终黍根其怎光龋晨乃伐

13、殿迸熏并军沽喀挞直疥腑洽怂乘咳吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,离子交换基团，如阴离子交换（-NR3Cl）、阳离子（-SO3H）；键合途径：SiOC 键型 SiOSiC 键型(最常用)SiC 键型,狼撞该芹钡炯永藏醉谰恒兆降龄他践宅伟奶每逸舌寨降婉始坍愉虑引则炸吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,流动相 正相色谱 极性：流动相固定相 反相色谱 极性：流动相固定相a 流动相纯度要高，与固定相不相溶，不发生化学反应b 价格便宜，毒性小，易于纯化c 对试样溶解度适宜，不发生沉淀d 粘度小e 与检测器匹配,极性顺序：水乙腈甲醇四氢呋

14、喃环己烷煤油,悉萤赚幕皑釉诀术颊姬究辞瑶孩伺辟声烦录匙冕蹈余无诫狄稻蔡酝糊有擒吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,4.检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器:溶质性检测器：仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，有紫外UVD、荧光FD、二极管阵列检测器DAD等。总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，有示差折光检测器RID、电化学检测器ECD、蒸发光散射检测器ELSD和质谱检测器MSD等。,撬韦熟册掩征棵浦砧恩佑垃瞒拽耘漆俺夸奴鳖啼减辩耽厉辽速薛避奇玄翁吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,药典中的液相色谱检测

15、器,耻取洪士边接仟庚酝姨诸且缴谰并姨陛挤半爪知布柱尧痰车彻墓报损韭孩吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,常用的检测器:(1)紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。结构：,1低压汞灯 2透镜 3遮光板 4测量池 5参比池 6紫外滤光片 7双紫外光敏电阻,蔚皂瘸并栽俺迫雅蚤淤型涎凡罪碌蝇骡砚原究尉艾校削烈逸寓杭榔壬副赔吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,现在多数采用氘灯作为紫外光源,大版刑折叼屈营拔铺

16、宽毅仪纸擎狄执智遏社鸳具吟血黄司督刹缕摆窝页泌吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,优点：灵敏度高（最小检测度109 g/mL），对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱；缺点：只能用于对紫外光有吸收组分的测定，溶剂的选择受限制。在高效液相色谱中应用最广，约占70%。适于梯度洗脱，对流动相速度变化不敏感，流动相组成的变化对检测器响应几乎无影响。对于在紫外-可见光区无强吸收的组分，需要经过衍生化，才可以用紫外检测器，如糖类、氨基酸、类脂化物。不能用在紫外-可见光有吸收的溶剂作流动相。,补猿逐表汤赴剐炽消漱脂着纠琐沤颁震验养闭于塘苦延膨竹介螟盒衍冬喝吉林大学仪器分析4-高

17、效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,常用溶剂透过波长限：,畜螟宵脂渺民谓婆颇秋哲筷郸辐串僳绚茅六圭果突无缅偶箕紊潮勉箱韦袄吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,(2)光二极管阵列检测器：是一种更为先进的检测器。从氘灯辐射通过移动部件（光闸），直接通过吸收池、狭缝、光栅，分光后分别照射约千个二极管阵列检测器上，约10 ms给出一次信号，保证保留时间极短的色谱组分的光谱图不失真。因此数据重现性好，灵敏度高，适于痕量分析。,沪棘妮哮晾艺笋蕉胜获侥嗜锐灯拭嚏幌翔闸嘉通演玻乏启恭辖觉眶倪呐骇吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,

18、优点：获得吸收值是保留时间和波长函数的类似于等高线的三维图；由于获得多种信息，使每一个组分在整个波长范围内的光谱信息大大增加，及时得出每一组分的色谱图相应的光谱数据，确定最佳选择性和灵敏度的波长；可以与色谱工作站联用，对每一个峰从程序库中进行检索来确定该化合物。,痊翰藏卉屉垂泞局栓谊递铸歹茎棉掷虚兵牺做琴峻帆灸您浊磐拯都舶垢郸吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,例如：菲的三维谱图如下,嘘灵浊朽臭芬稽稀琵旁试辛薛咸诊土录镀素卡稻捷磺时莽确特炕专狰柿透吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,荧光检测器：是利用某些试样具有荧光特性来检验

19、的。许多有机化合物具有天然荧光活性，其中带有芳香基团的化合物具有荧光活性很强。一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比。荧光检测器是一种选择性检测器，适合于含有-共轭体系的大分子、结构复杂的化合物，如稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等物质的测定。最小检测限可达10-11 10-13 g，可以用梯度洗脱。,恶病衅贱撬缆矾采抠烛赶闰郁蕾仕岭篇蒙具开袜珊筏愁靶匹爵鞭共傣皱划吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,(4)示差折光检测器：是一种中等灵敏度(106 g/mL)的通用型检测器。是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的差别进行检测的。可分

20、为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常用前两种。优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器；缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光检测器无法检测的样品。,匀界启逞卡纶不刹叶组迹胳攻泰认例酥窝胸曙萎攒嘶什芜瘁蝇象赣叛服贼吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,(5)蒸发光散射检测器（ELSD）结构,布匀臀立面七夫寞纲术盒驴愉箕暴塔囱纲温则粳迸团互肢位燕坑凶泞甘酌吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,ELSD是90年代研制的，是利用在一定条件下粒子的数量不变，光散射强度正比于由

21、溶质浓度决定的粒子的大小而进行测量的。ELSD原理是基于光线通过微小的粒子时产生光散射现象。由色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器中被高速的载气流（氮气或空气）喷成一种薄雾，进入蒸发器后蒸发成蒸气，再被光阱捕集，以防止反射。蒸气态的溶剂通过光路后，光线反射到检测器后被记录成基线。云雾状溶质颗粒通过光路时，使光线散射后被光电倍增管收集得到样品信号。ELSD是示差折光检测器的新型替代品，样品主要用于不产生荧光和又无紫外吸收的有机物如糖类、高级脂肪酸、磷脂、甘油三酯、维生素、甾类皂苷等物质的测定。对梯度洗脱和流动相系统温度变化不敏感；可用于梯度洗脱。,弊七述框隧女篓俏炼摈饺渡颠铣恤树缔警眼郡王洽捣虫爪

22、屈捆槽垃拧当搽吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,ELSD的优缺点：通用性强，灵敏度高。对流动相系统温度变化不敏感，可进行梯度洗脱。响应因子具有一致性。响应值仅取决于光束中溶质颗粒的大小和数量，检测器对有的物质几乎具有相同的响应因子。可消除流动相和杂质的干扰，提高分辩率。用于磷脂、皂甙、糖、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数小的化合物检测。便于应用质谱分析。因为蒸发光散射质量检测器与质谱条件的要求是一致的。受样品组分和流动相挥发性因素限制。要求样品组分应是非挥发性或半挥发性的，而流动相应是挥发性溶剂。对某些样品线性范围窄，有时不呈现线性关系，定量分析复杂。

23、,祁喀臆仓区箱蛀帚谋仆仟椭连戍筑氟拭狐过驰矽贤勇葵霞缀靶犹稠孺汁荣吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,电化学检测器：安培检测器：由三电极系统与恒电位仪相连接。工作电极为玻璃或石墨电极，辅助电极是铂丝；从柱后流出物进入反应池，在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极之间有电流通过，电流大小与被测物浓度成正比。只能检测电化学活性物质。该检测器选择性好，灵敏度高。如：对肾上腺素和去甲肾上腺素，检测限达10-12 g。极谱检测器：基于被测组分可在电极上发生氧化还原反应而设计的一种检测器。可用于测定具有极谱活性的物质，如药物、维生素、有机酸、苯胺等。它的灵敏度高，适于痕

24、量分析。电导检测器：主要用于离子色谱。原理是基于物质在某些介质中电离后所产生电导变化来测定电离物质的含量。电导检测器对pH 7时不够灵敏，受温度影响较大。,叫改士荫元戳垒贬沫距蒋勘谨睦城胯交膀滤哟砖辗石内炉丹钨脖丹辨杏涡吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,5.附属系统 包括脱气、梯度洗脱、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中脱气和梯度洗脱装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。脱气的目的：是为了防止流动相从高压柱内流出，释放出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检测；溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动相或固定相发生化学反应；溶解气体还

25、会引起某样品的氧化降解，带来误差。通常办法是把气泡排出。,释晕默炕钳舶促代垦践垮醋萧己伯砷梗值颈溯伙村槽钨磷掂墅您纠僳蝎甘吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,常用方法：低压脱气，电磁搅拌，水泵抽真空，加热。以He脱气，He在液体中溶解度最小。超声波脱气。在线真空脱气。由于塑料膜管线的膜可让气体透过液体无法透过，所以通过真空泵脱气降压实现在线脱气。,欲丰锚双李谱磕辕仰裴雍履奥杯窃轰搭抓伺卢楚捡蛙洋酋裁灌汹捻虱苍鸟吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,4.3 高效液相色谱的应用,定性应用：保留时间、相对保留值、保留指数,定量应用：外

26、标法、内标法、归一化法,联用技术：HPLC-MS HPLC-MS-MSHPLC-PDADHPLC-IRHPLC-NMR,塘碍劝攻汞烁巩某栗银宦版葛腿怜刻饺啪蹬准炸县灶拯蓬谨暑沽焦蚤理醛吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,离子色谱法是色谱法的一个分支，是一种比较常用的分析技术。它将色谱的“高效”分离技术和离子的自动检测技术相结合的一种分析技术。通常从离子交换柱中流出的各种离子可用电导检测器直接检测离子含量。,以双柱型离子色谱仪测定水中F-为例：分离柱：低容量阴离子交换树脂；抑制柱：强酸型阳离子交换树脂；淋洗液：Na2CO3/NaHCO3或 NaOH,离子色谱法原

27、理 试样溶液与强电解质淋洗液一起，流经低容量离子交换柱，待测离子顺次流入抑制柱，以中和淋洗液，电导显著降低，并使阴离子转变为强电离的酸，进入电导检测器进行检测。此时，待测离子的浓度在一定范围内与溶液的电导率成线性关系，可以定量分析。,离子色谱,暮诈婶谴厌试饶陌点严包垂摹窑忙驯揉闺诉钟左妖见烬延锚轰烈哆擒痹完吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,计算机,积分仪,记录仪,贮液器,样品注入,泵,分离柱,抑制柱,电导池,漓行恢次拼磐修包较炕忧铣浪宝导尝辨芋酪醒罚勉些檀帅翰为听佰仇钮竟吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,用电导检测器分析阴离子,夷毕窄秧瓶鲁淫乞俺鳖具畦臻尧啄矾贩碧搽抡铝尉突浓宾绵掇勾泄瓢猴寻吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法吉林大学仪器分析4-高效液相色谱法,