第三章基因克隆的酶学基础.ppt

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1、第三章 基因克隆的酶学基础,常用的工具酶：,第一节 限制性核酸内切酶第二节 DNA连接酶第三节 DNA聚合酶第四节 DNA及RNA的修饰酶第五节 核酸外切酶第六节 单链核酸内切酶,一、寄主控制的限制与修饰二、型限制酶的特点三、影响内切酶活力的因素四、核酸内切酶对DNA的消化作用五、限制酶的用途,第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割,一、寄主控制的限制与修饰人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。,限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细

2、菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。,修饰的甲基转移酶,作 用：,保护自身DNA不受限制；破坏外源DNA使之降解,E.coli B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coli B的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定

3、碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。,数字表示在不同寄主中生长的噬菌体的成斑率，表示限制程度。,二限制和修饰作用的分子机制1大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株，有各自的限制和修饰系统。1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）hsdR编码限制性核酸内切酶-识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点）3）hsdM编码产物是DNA甲基化酶-催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）hsdS表达产物的功能是-协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。,限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源

4、DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶、型酶、型酶,2、限制性内切酶的类型,（1）型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coli B和E.coli K中分离出的核酸内切酶。分子量较大，反应需Mg2+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。,（2）型酶 1970年，H.O.Smith和K.W.Wi

5、lcox在流感嗜血菌Rd株中分离出来的限制酶。分子量较小（105 Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。,反应只需Mg2+的存在，并且具有以下两个特点，识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。,（3）型酶这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3端2426bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。,二、限制性内切酶的特点1、定义、命名,（1）定义广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。（2）命名限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：Hind前三个字母

6、来自于菌种名称H.influenzae，“d”表示菌系为d型血清型（菌株号）；“”表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coli RI,2、限制酶的特点,（1）基本特点在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。,（2）识别顺序和酶切位点 识别-8个相连的核苷酸 Mbo I NGATCN Ava II GG(A/T)CC BamH I GGATCC PpuM I PuGG(A/T)CCPy,估算RE识别序列在DNA上出现的频率:识

7、别序列的频率=1/4n Sau3A(4bp)=1/44 256bp EcoR I、Pst I(6bp)=1/46 4096 Not I(8bp)=1/48 65536(rare cutters)仅是理论推测,对称性 限制酶切后产生两个末端，末端结构是5-P和3-OH,（3）末端种类 3-端突起，个数为2或4个核苷酸Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5 5-端突起，个数为2或4个核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5,平齐末端SmaI 5-CCCGGG-3 5

8、-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 非互补的粘性末端切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG、CTCGGG、CCCGA、CTCGAG,（4）异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）,定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶 特点：识别相同顺序切割形成相同的末端 KpnI GGTACC SstI CCGCGG Asp718 GGTACC SacI CCGCGG,例

9、：限制酶HpaII和MspI共同的靶序列CCGG,（5）同尾酶（isocaudamer）,来源各异，识别的靶序列不同，但产生相同的粘性末端,（6）限制片段末端的连接作用,分子间连接,分子间连接：不同的DNA片段通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。,分子内连接：同一片段的2个互补末端之间的碱基配对而形成的环行分子。,返回,三、影响内切酶活力的因素,（1）DNA的纯度污染的蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制核酸内切酶活力。提高效率的方法：增加核酸内切酶的用量 扩大反应体积，使潜在因素被稀释 延长酶催化时间,（2）DNA的甲基化程度,基因克隆中采用失

10、去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。,应用：利用核酸内切酶对甲基化序列的敏感性检测序列中的甲基化位点,（3）酶切消化的反应温度,大多数核酸内切酶的反应温度在37，有些酶例外。（表 3-7）酶活力单位：一个活性单位（U），是指在50l反应体系中，37oC的条件下，经过1小时的反应时间，将1g DNA 完全酶解所需要的酶量。,（4）DNA的分子结构,DNA分子的不同结构对核酸内切酶的活性有很大影响：例如:切割超螺旋的或病毒DNA比线性的酶用量高出很多倍；切割不同位点的序列效率会有差异；可能是由于侧翼序列的影响对于局部消化时要考虑到不同位点的切割效率,（5）核酸内切酶的缓冲液（-20保存）,主要

11、成分：氯化镁、氯化钠、氯化钾，Tris-HCl，-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）Mg2：酶发挥活性必需，不正确的Mg2和NaCl会影响对特异序列的识别。Tris-HCl：保证酶反应的pH，一般在pH 7.4条件下功能最佳巯基乙醇：保持某些酶的稳定性,非最适条件下酶的识别序列会发生变化：高浓度的酶，高浓度的甘油、低离子强度、高pH，用Mn2代替Mg2等甘油的影响（星号活性）例：EcoR在正常情况下识别GAATTC，但是如果甘油浓度超过5（V/V），识别序列发生变化，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割。,返回,四、核酸内切酶对DNA的消化作用,完全酶切消化：例如识别6个碱基的酶，可以

12、每隔464096切割一次。切割达到了这样的片段化水平，为限制酶对DNA分子切割完全。局部酶切消化 使酶切反应不进行完全，可以通过缩短反应时间，减少酶的用量，降低反应温度等方法约束酶活性。,五、限制酶的用途,DNA重组限制酶（物理）图谱绘制 突变分析（RFLP分析）限制酶的部分酶切与完全酶切,酶切图谱的构建,例1：限制性消化反应体系。总体积是30L。5L质粒DNA 1L EcoRI 1L XbaI 3L 10RE缓冲液 20L水,例2：画一张与这些结果一致的示意图，确切地标明所有限制性酶的酶切位点及它们之间的距离，包含下列所有的信息：（1）限制性酶位点之间要有合适的距离（例如：EcoRI-Bam

13、HI=3.3 kb）（2）在你的图中央标明质粒的总大小。（3）限制性酶的位点应在与它彼此相对应的正确位置上标明。,BamH：得到3.3和3.7kbEcoR：得到5和2kb BamH和EcoR：得到3.3，1.7，1.5，0.5kb,酶切反应注意事项,价格昂贵决不能用水稀释，以免变性失活。预先加入除酶以外的所有其他试剂。取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。使用无菌的新吸头。少加水，使体积最小，但保证酶液体积不超过总体积的10，否则酶液中的甘油会抑制酶活性。,返回,一、DNA连接酶的种类及反应条件二、反应机理三、粘性末端DAN片断的连接四、平末端的连接（1）衔接物连接法（2）DNA接头连接法（

14、3）同聚物加尾连接法五、热稳定的连接,第二节 DNA连接酶和DNA分子的体外连接,能够将DNA链上彼此相邻的3-羟基（OH）和5-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接切口（nick），不能连接缺口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。,ds DNA结构:切口，缺口，断口,一、连接酶的来源1、DNA连接酶大肠杆菌染色体编码的 2、T4 DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的 DNA连接酶 NAD+T4 DNA连接酶 ATP,从T4噬菌体的受感染细胞中提取，是由T4噬菌体基因组所编码。特点：只连接ds DNA分子，要求3-羟基和5

15、-磷酸基 用途：1)相同或相容粘性末端的连接 2)平整末端的相连 DNA平端来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多。,返回,二、反应机理,返回,三、粘性末端DAN片断的连接 由于具粘性末端的载体易发生自连。对载体的5末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5-P能与载体的3-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5-P的链不能进行连接，形成3-OH 和5-OH 的缺口。,返回,四、平末端DNA片断的连接T4 DNA连接酶用末端

16、核苷酸转移酶给平末端修饰之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法,1、同聚物加尾法,2、衔接物连接法 平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约1020个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。,将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。,衔接物连接法,衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片

17、段。双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。,双衔接物连接法的基本程序,cDNA链的合成,通过DNA聚合酶合成第二链,加入Sal I衔接物,S I核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物EcoR I,在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。,3、DNA接头（adapter）连接法1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。

18、,粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5-P，暴露出5-OH，不能产生稳定的二聚体分子。,DNA接头连接法,返回,五、热稳定的连接 从嗜热高温放线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。使用这种连接酶进行体外连接，可以明显降低形成非特异性连接产物的机率（1）寡核苷酸连接测定（oligonucletide ligation assay,OLA）用两个寡核苷酸探针（2025bp），同已知序列靶DNA杂交，探针在靶DNA分子的位置是相邻的。,洗涤后加入碱性磷酸酶底物,（2）连接酶链式反应（lig

19、ase chain reaction,LCR）也叫连接扩增反应（ligase amplication reaction），用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法。需要4种引物。,裂口连接酶链式反应（G-LCR）连接酶链式反应中存在独立于靶DNA的连接作用G-LCR可以避免独立于靶DNA的连接作用，从而使敏感性大大提高寡核苷酸探针已经被修饰过，具有交错末端退火后两个探针间用热稳定的DNA聚合酶补齐后连接。,不对称裂口连接酶链式反应（AG-LCR）,可用于检测RNA分子,返回,五、影响连接酶作用的因素1、反应温度连接缺口的温度：37，但是粘性末端的氢键不稳定连接粘性末端的

20、最佳温度：4162、T4 DNA连接酶的用量平末端DNA分子的连接反应中，最适12个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10mol1mmol/L之间3、提高外源片断与载体的浓度的比值，（310倍）,返回,常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段 T4 DNA聚合酶 反转录酶 T7 DNA聚合酶,第三节 DNA聚合酶,一、E.coli 的DNA聚合酶系统pol I 参与DNA修复，具35和53外切酶活性pol II 参与DNA修复，具35外切酶活性pol III参与DNA复制，具35和53外切酶活性,1957年，美国的生物

21、学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶。由pol基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为109103dal。,（一）DNA聚合酶 I（Pol I）,1、E.coli Pol I的特点（1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性和聚合酶活性（大片段亦称为Klenow片段）。（2）聚合酶活性 53,要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响,（3）DNA聚合酶发挥作用的条件：底物：四种脱氧核苷5-三磷酸（dNTP）；Mg2离子；带有3-

22、OH游离基团的引物链；DNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。,53外切酶活性,DNA聚合酶的35核酸外切酶活性 能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3-OH末端开始向5方向水解DNA，并释放出单核苷酸分子。对酶活的影响：反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶的35核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNA，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被53的聚合酶活性所抑制。,2、DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途,除去3-端突起的单链DNA（在无dNTP时）补齐5-突起端（常用Klenow大片段）合成第二条cDNA（常用Klenow大片段）切口移位制备探针,

23、（1）通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。DNA切口平移（nick translation）,在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶的53核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5一侧移去一个5核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3一侧补上一个新的核苷酸，但Pol不能在3-OH和5-P之间形成磷酸二酯键，随着5一侧的核苷酸不断移去，3一侧的核苷酸又按序列增补，缺口沿着DNA分子合成的方向移动。,DNA杂交探针的制备 典型的反应体系：纯化的特定DNA片断，适量DNase、Pol、-32p-dNTPs和未标记的dNTPs。DNase：造成DNA分子的

24、断裂或缺口；Pol：进行切口转移，使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。,dNTP 对Pol酶活性的影响在低浓度dNTPs的条件下，Pol具有良好的活性，提高dNTPs浓度时，Pol则能够更有效的合成DNA。低浓度的 32p-dNTPs（2mol/L）和高浓度的dNTPs（20mol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs参入DNA链（Dnase数量）。,（二）Klenow片段与DNA末端标记Klenow片段 由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为76103dal的大片断分子。仍具有53的聚合酶活性和35 的外切酶

25、活性，失去了全酶的53外切酶活性。,Klenow片段的主要用途 1、修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端；2、标记DNA片断的末端；3、cDNA克隆的第二链cDNA的合成；4、DNA序列的测定。,DNA片段末端标记 具有 3隐蔽末端的带标记得的DNA片断 5GATCT3 3 A5 在反应物中加入Klenow聚合酶-32p-dGTP，一道温育后生成：5GATCT3 3*GA5 或是同时加入-32p-dATP dGTP 5GATCT3 3*AGA5,DNA片断末端标记可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品。因为被标记的DNA片断是同它们的摩尔浓度成比例，而与他们的分子大小无关。所以在限制

26、酶消化过程产生的大小DNA片断都得到了同等程度的标记。不能有效的标记带有5突出末端DNA分子。,返回,二、T4 DNA聚合酶,1、从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶，具有53的聚合酶活性和35外切酶活性。53聚合酶活性，1500 nt/min,为Pol I的两倍35外切酶活性，可作用于ss DNA和ds DNA，其切除速度分别为40和 4000nt/min,2、在没有脱氧核苷三磷酸存在的情况下，3外切酶活性便是T4 DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按35的方向从3-OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反

27、应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。,3、取代合成法标记DNA片断,在反应过程中，通过T4 DNA聚合作用，反应物中的-32p-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。3外切酶活力可以切割ds DNA和ss DNA，ds DNAss DNA，要控制降解时间。,对DNA分子3端有控制的降解,返回,三、反转录酶,1、来源许多RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，最常用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶（AMV）2、特点AMV具有链和链链具有聚合酶活性和RNase H活性链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的53脱氧核酸外切酶活性,聚合酶活性,RNas

28、e H活性：从53或者35方向特异的降解RNA-DNA中的RNA链,3、主要作用以mRNA为模板合成cDNA；用来对5突出末端的DNA片断作末端标记。,返回,四、T7 DNA聚合酶,1978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。加工形式的T7 DNA聚合酶系：T7噬菌体编码的基因5蛋白质，另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白。基因5蛋白质：具有聚合酶活性和35外切酶活性；硫氧还蛋白：增强基因5蛋白质与模板引物的结合力具有53的聚合酶活性和很高的单链及双链的3 5核酸外切酶活性。,T7 DNA聚合酶的用途 1、用于对大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二级结构

29、的影响，聚合能力较强可延伸合成数千个核苷酸）2、通过延伸或取代合成法标记DNA3末端；3、将双链DNA的5或3突出末端转变成平末端的结构。,修饰的T7 DNA聚合酶 对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去35的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。用途：1、作为一种DNA序列分析的工具酶：加工性能高；无35外切酶活性；具有催化脱氧核糖类似物聚合的能力。2、制备探针；可催化较低水平的dNTP（0.1 mol/L）参入。3、有效的填补和标记具有5突出末端的DNA片断的3-末端。聚合作用高；失去了35的外切酶活性。,返回,一、末端脱氧核苷酸转移酶二、T4多核苷酸激酶三、碱性磷酸酶,第四节 D

30、NA及RNA的修饰酶,一、末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾1、特点末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化脱氧核苷三磷酸进行53方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3-OH末端。,不需要模板，可以用含有的3-OH DNA片段为引物，在3-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3-OH末端的单链DNA，也可以是具有3-OH突出末端的双链DNA，平末端不是有效底物，如果用Co代替Mg做为辅助因子，可以成为有效底物。,利用末端脱氧核苷酰

31、转移酶(TDT)给载体和外源基因加上互补的同聚物尾巴,2、用途,催化-32P-3-脱氧核苷酸标记DNA片断的3末端。可用于测序的终止，因为不含游离的3-OH末端。催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3-末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。用于在平头DNA上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。,返回,二、T4多核苷酸激酶与DNA分子5末端标记,1、T4多核苷酸激酶：由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初从T4噬菌体感染的E.coli中分离出来。作用：催化-磷酸从ATP分子转移给DNA或者RNA的末端，不受底物分子链的长短限制。,2、正向反应（forw

32、ard reaction）,碱性磷酸酶处理DNA的5端使其脱磷酸暴露出5-OH，多核苷酸激酶将-32P-ATP的-32P转移到5-OH，实现末端标记。,返回,三、碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用,来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸基团，使5-P成为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。,BAP和CIP的区别：CIP优点：在SDS中加热到

33、68可以完全失活，比活性比BAP高1020倍BAP：热抗性酶，终止作用需要酚/氯仿反复抽提,返回,核酸外切酶：一类可以从多核苷酸的一端开始按序催化降解核苷酸的酶，可分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。,第五节 核酸外切酶,1、一般特点：来自于E.coli，分子量28,000 kD 2、催化反应类型（1）外切酶活性：35，产生5-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5,（一）外切酶III（Exo III）ds DNA,外切酶活性特点 反应底物：互补ds-DNA 碱基释放速度：CATG 反应产物：5-单磷酸核苷和具缺口或5-端突起的ds-DNA，过渡反应将导致DNA降解

34、,（2）核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5（3）3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4（4）内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH 7.6-8.5,3、用途（1）核酸（DNA）标记配合使用klenow酶,（2）基因突变-缺失（3）DNA序列测定时作顺序缺失,S,4、使用注意事项正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区（来自于cDNA加尾）,（二）噬菌体核酸外切酶（exo）T7噬菌体基因6核酸外切酶ds DNA,1、exo（1）来源：从感染了噬菌

35、体的大肠杆菌中纯化而来（2）特点：催化双链DNA自5-P末端进行逐步的加工水解，释放出5单核苷酸，但不降解5-OH,（3）用途将双链变为单链，供双脱氧测序分析从DNA中移去5突出端，以便用末端转移酶进行加尾,2、T7噬菌体基因6核酸外切酶（1）来源大肠杆菌T7噬菌体基因6编码的产物（2）特点自5-OH和5-P末端移去核苷酸，其活性比 exo低，主要用于从5端开始的有控制的匀速降解。,三、大肠杆菌外切酶（exo）ss DNA,（1）特点：单链核酸外切酶，从5末端和3末端降解DNA，产生寡核苷酸片段，反应不要Mg2,第六节 单链核酸内切酶,1、来源真菌Aspergillus oryzae（稻谷曲霉

36、）2、特点pH4.0-4.3，低水平Zn2+（1）可以降解单链DNA和RNA,一、S1核酸酶,（2）作用于双链分子的单链区，并从此切割核酸分子,3、RNA分子定位,二、Bal-31核酸酶,1、来源埃氏交替单胞菌中分离而来2、特点单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性需要Ca2和Mg2，EGTA可终止反应（1）双链环型DNA：单链特异的核酸内切酶活性通过单链切口或瞬时单链区的降解作用将超螺旋结构降解为线性DNA,（2）线性双链DNA：双链特异的核酸外切酶会从两端去除核苷酸，能够有效的控制降解速度。,（3）单链DNA或者RNA（单链特异的核酸内切酶活性）,（4）内切酶活性，即从内部切割DNA的单链区，3外切酶活性大约为它的单链特异性内切酶活性的20倍,3、用途,用于不同长度的删除突变克隆实验及基因结构、机能分析控制消化法,绘制DNA限性内切图谱Bal 31降解DNA绝对依赖于钙离子的存在。因此可以在反应的不同阶段加入螯合剂EGTA而使反应终止。限制性酶切，考察酶切谱带的消失顺序，判断酶切位点的位置由于Bal 31从末端降解DNA的作用相对比较均匀，因此Bal 31可用于确定DNA小片段的限制酶切图。,练习：已知一个原核生物基因的两端序列，请设计实验在大肠杆菌中大量扩增这个基因。,5端为 GCTCCATGACCCAGGCA3端为 CGATCTTTTGAGTCCATG,