第三章用于基因克隆的载体.ppt

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1、第三章 用于基因克隆的载体,质粒（plasmid）,噬菌体或病毒DNA,考斯质粒（cosmid）与噬菌粒,人造染色体载体,载体的功能及特征,3.1 载体的功能及特征,3.1.1 载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,3.1.2 载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,具有合适的筛选标记,具有较高的外源DNA的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,3.2 质粒载体,3.2.1 质粒的基本特征,A:质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自

2、主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；B:质粒常见于原核细菌和真菌中；C:绝大多数的质粒是DNA型的；D:绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA；E:质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。,3.2.2 质粒的分子形式,3.2.2.1 共价闭合环状DNA（cccDNA),Covalent close circular DNA,呈超螺旋（SC）（super coil）,3.2.2.3 线形DNA（linear，L-DNA）,一条链上有一至数个缺口。,3.2.2.2 开环DNA（open circular，ocDNA）,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不

3、同：,scDNA最快、L DNA次之、ocDNA最慢。,SC,OC,L,3.2.2.4 质粒空间构型与电泳速率,3.2.3 质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：,严紧型质粒 1-3 拷贝 stringent plasmid,松弛型质粒 10-60 拷贝 stringent plasmid,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1

4、拥有相似的复制子结构，彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,3.2.4 质粒的不相容性,质粒的不相容性：分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒，复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,两种含有不同复制子结构的质粒，复制时受各自拷贝数控制系统的调节，使两种质粒的最终拷贝数恒定，经过若干复制和细胞分裂周期后仍能共处同一细胞内。,3.2.5 质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞

5、转移到另一个细胞，如F、Col、R质粒等,非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员,某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。,大肠杆菌接合（conjunction）,3.2.6 携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,3.2.7 质粒的构建,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷

6、贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr,ColE1 6.5 kb 拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1,RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr,3.2.7.1 天然质粒的缺陷,（1）分子量大，拷贝数低,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。,但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。,（2）筛选标记不理想,ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin

7、 E1）。,可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞,colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。,唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。,3.2.7.2 理想载体条件,A、较小的分子和较高的拷贝数,B、多个单一的限制性内切酶位点,C、两种以上的选择标记,D、易导入宿主细胞并复制和表达,3.2.7.2质粒的选择标记及其工作原理：,氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）,绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：,i）氨苄青霉素（Ampicillin

8、，Amp）,青霉素的衍生物。,a）抑菌原理，通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。,b）细菌抗性原理：Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。,ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）,b）细菌抗性原理：Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。,a）抑菌原理：通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。,a）杀菌原理：通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。,iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）,b）细菌抗性原理：Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，

9、阻断其与核糖体结合作用。,iv）链霉素（Streptomycin，Str）,a）杀菌原理：通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。,b）细菌抗性原理：Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。,v）四环素（Tetracycline，Tet）,b）细菌抗性原理：Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。,a）抑菌原理：通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。,3.2.7 质粒的分类,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因

10、,低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker,整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选,3.2.8 重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,3.2.8.1 pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,pBR322 由F.Bolivar和R.L.Rodrigue

11、z人工构建,复制起点 ori：pMB1系列（来源于 ColE1）的高拷贝型复制起点,Ampr基因：pSP2124质粒的Ampr基因,Tetr基因：pSC101的Tetr 基因。,元件来源,4363bp,氨苄青霉素和四环素抗性。,9个导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind）；3个导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。,24个克隆位点。,（2）长度,（3）选择标记,（4）克隆位点,双抗菌素抗性选择标记：插入失活，分两次先后选择：,没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。,获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。,（5）pBR322的优点,外源基因B

12、amH I,Amp中存活,但在Tet中死亡,外源基因Pst I,Tet中存活,但在Amp中死亡,分子小，克隆能力大：载体越小越好。10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。,高拷贝数：氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy,安全：失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。,pBR3224363,抗药性标志的选择,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,3.2.8.2 pUC18/19：,拷贝数 2000-3000/cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,pBR322的 ori,大肠杆菌,大

13、肠杆菌lacZ的-肽链序列，是LacZ 的氨基端片断。,pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。,（1）元件来源,复制起点,Ampr 基因,lacZ的启动子,lacZ基因,约2.7kb,10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ基因的5端。,（2）长度,（3）克隆位点,pUC18/19,pUC18/19：正选择标记 lacZ 的显色原理,-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,-半乳糖苷酶,1）-肽（lacZ）：,-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。,lacZ只有在4聚体的状态下才

14、有功能.,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,4聚体,2）受体菌lacZ突变（lacZM15）,受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal,受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a,pUC质粒载体上的lacZ 编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。,C端大部分,N端的11-41aa,pUC lacZ,受体菌lacZ

15、,3）载体lacZ与互补,4）互补的插入失活,pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。,lacZ,5,3,肽移码突变,lacZ,5,3,肽,不互补,互补,MCS,外源DNA,IPTG的诱导作用,IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ肽都表达。从而互补。,IPTG,IPTG诱导的结果：,更小的分子量：,如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。,选择方便,Xgal显色、抗菌素双重直接选择。,克隆便利,具有多克隆位点（MCS）。

16、,测序方便,（5）pUC系列载体的优点,3.2.8.3.pGEM-3Z,由pUC派生而来,与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。,T7启动子,SP6启动子,MCS,lacZ,Ampr,ori,可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。,如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA,外源基因正接反接都可以转录。,MCS与pUC18的完全一样。,pGEM-3Z的特点：,3.2.8.4.PMD18-T,3.2.8.5.PMD18-T,3.3 噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或

17、整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：,高效的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,3.3.1 噬菌体的生物学特性：生物结构,噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,噬菌体由外壳包装蛋白和-DNA组成,-DNA全长48502个核苷酸,-DNA上至少有61个基因,l 噬菌体生物学特性：生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成

18、控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l-DNA,l 噬菌体生物学特性：溶菌周期,l 噬菌体生物学特性：溶菌周期,l 噬菌体生物学特性：溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。,噬菌体感染细菌的早期：双链进行型复制。,3.3.2 DNA的复制 模型,（1）型复制,（2）滚环复制,感染的晚期：启动滚环复制机制。,形成多联体DAN分子。,这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。,（1）构建原理：,

19、3.3.3.噬菌体载体的构建,（2）构建过程,在这个非必须区内制造限制酶切点 引进某些突变表型，作为选择标记 突变某些基因，使它成为安全载体 删除DNA必须区段上常用的限制酶切点,删除噬菌体的非必需区，留出插入空间。,（3）人工构建的噬菌体载体有两种类型：,插入型载体（insertion vectors)：,如 gt10、gt11、BV2、NM540、NM1590、NM607,1）免疫功能失活型：,插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。,EcoR I,gt10,插入导致载体不能合成阻遏物，载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA插入的载体感染受体菌

20、形成混浊噬菌斑。,选择标记:,如NM1149载体的两个克隆位点（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因内部。,2）-半乳糖苷酶失活型载体：,在基因组中引入了LacZ序列。（其上含有一个EcoR I 克隆位点）。,感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。,EcoR I,Charon16A,选择标记:,替换型载体（substitution vectors),两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于DNA的非必须区两端。,用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。,可置换区,MCS,MCS,如：EMBL4、Charon40

21、等。,1）EMBL4,EMBL4的可置换片断内部还有Sal I酶切位点。,以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。,左臂,可置换区,右臂,EcoR I BamH I Sal I,Sal I BamH I EcoR I,Sal I Sal I,EMBL4,2）Charon40,Charon40的可置换片断是由DNA短片重复构成，片断之间有Hae I 切点。,在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。,左臂,可置换区,右臂,MCS,MCS,Charon40,Hae I,可取代片断中如果包含LacZ，可用Xgal显色作筛选标记。,（4）载体的筛选标记,插入

22、型载体,根据插入所引起的表型突变。,置换型载体,DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。,3.3.4 载体的体外包装,在试管中与噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。,（1）体外包装：,的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与 DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。,（2）体外包装过程,噬菌体外壳蛋白的合成,E 基因,的E 基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的70%）。,D基因,外源的重组DNA载体被诱发与内源性原DNA发生重组。,（3）体外包装存在的问题：,包装错误：,既能包装用于生产头部蛋白的内源性原DNA，也能包装

23、重组的DNA载体。,重组：,体外包装的容量限制：,必须在正常野生型容量的75%105%（3651kb）之间。,既不能超过正常野生型容量的5%；又不能低于正常野生型容量的75%,野生型DNA的必须区是28kb，所以载体的最大克隆容量是23kb。（实际上为15kb）。,3.3.5 l-DNA作为载体的优点：,l-DNA在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb，远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因,3.4 单链噬菌体载体,M13、f1、fd 噬菌

24、体,单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：,M13 噬菌体,3.4.1 M13噬菌体的生物学特性：生物结构,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上至少有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,3.4.2 M13的生活周期,虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的1/23/4）,M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA,+DNA合成DNA，形成RF dsDNA,DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白,组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞,+DNA

25、,-DNA,mRNA,M13外壳蛋白,组装成子代M13,+DNA,注入大肠杆菌,复制,转录,翻译,+DNA,指导合成,+DNA,200个 RF DNA,3.4.3.M13载体的构建：,M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。,（1）克隆区域的选定,基因间隔区（intergenic region,IG区）,IG区内只有一个 BsuI 切点。,其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位。,酶切位点,M13 DNA载体的构建：,M13,J.Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。,在IG区内插入一个大肠杆菌的Lac

26、Z（-肽序列)。利用-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。,（2）加入酶切位点,在IG区内加入单一内切酶位点,第一个M13载体：M13mp1：,M13 RF,BsuI不完全消化,各种长度的线性片断,E.coli lac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ）,连接,M13mp1,JM101宿主,只有在IG区插入lacZ才能存活并在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑,3.4.4 M13 DNA载体的特点：,使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用,M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓

27、慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大,但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb,3.5 考斯质粒与噬菌粒,l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和1.5 kb。,包装上限固定时，缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。,3.5.1 考斯质粒（cosmid）

28、,考斯质粒载体的构建：,考斯质粒是一类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体,1978年Collins和Hohn发明构建1.8 kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45 kb,考斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,3.5.2 噬菌粒（phagemid or phasmid）,噬菌粒载体的特点：,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基

29、因的特殊类型的载体,能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞,装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA,重要的噬菌粒载体：pUC118/119,pUC118 pUC18+M13间隔区 IG,pUC119 pUC19+M13间隔区 IG,500 个拷贝,3200 bp,MCS,lacZ,lacI,ori,Apr,M13-MG,pUC118/119,表示M13辅助噬菌体DNA,重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体,pBluescript=pUC+f1-o

30、ri+PT3+PT7,2958 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,f1-ori,pBluescript,PT3,噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录,提取出来的单链DNA重组分子,在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录,3.6 人造染色体载体,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人造染色体（BAC）,酵母人造染色体（YAC）,A.W.Murray

31、 1983年形成基础理论,D.T.Burke等1987年变为现实。,3.6.1 酵母人工染色体,1.YAC的特点：,（1）只能在酵母细胞中扩增。,（yeast artificial chromosome,YAC),（2）克隆容量大，为230kb-1700kb。,（3）构建原理，按染色体结构构建。,（1）DNA复制起始点（ori）,2.染色体复制和遗传的三个基本组件：,TEL,TEL,CEN,ORI,（2）着丝粒（centromere，cen）,（3）两个端粒（telomeres，tel）,（1）着丝粒区（CEN）,A A GTCACGTG,T TGTTTCTGNTTTCCGAAA,3.YAC的

32、组成结构,酵母染色体着丝粒区的保守序列:,78-86bp,I,II,III,由三个区组成,酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。,（3）复制起点（ORI）,约100bp的自主复制序列（ARS）。,（2）端粒（TEL）,人是TTAGGG重复序列;四膜虫是 GGGTTG重复序列。,（真核生物中只有酵母菌有ARS）,两个端粒序列Tel。,位于 SUP4 基因内部。,（4）克隆位点,插入失活选择：,SUP4酶失活的酵母菌落呈红色；不失活的菌落是白色。,TRP1、URA3（分别位于两臂）。,细菌的复制起点 ori和抗生素标记Ampr,（5）在酵母中的标记基因,（6）在细菌中操作,URA3:尿嘧啶合

33、成缺陷基因 TRP1：色氨基酸缺陷基因,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列,酵母人造染色体的构建：,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的选择标记,YAC载体的装载量为350-400 kb,酵母人造染色体的使用：,pYAC4,CEN,EcoRI,URA,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP,ARS,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,着丝粒,端粒,自主复制因子,

34、标记基因,标记基因,H.Shizuya等在大肠杆菌F因子基础上构建的。,（2）克隆容量可达300kb。,3.6.2 细菌人工染色体（BAC）,1.F质粒的特点：,每细胞只有一个拷贝，不会重组。,（4）便于提纯,像提取质粒一样直接提纯。,（1）单拷贝复制。,（3）比较稳定。,3.6.2 BAC的组成结构,（1）OriS和repE控制质粒的单向复制。（2）parA和parB维持低水平质粒拷贝数。（3）CosN是噬菌体末端酶专一性切割位点。（4）loxP是P1 Cre蛋白作用位点。（5）HindIII和BamHI是插入位点。（6）两侧的NotI可用于切下外源DNA。（7）氯霉素抗性基因CMR,3.6

35、 表达载体,外源基因在宿主中高效表达的原理,启动子,终止子,核糖体结合位点,密码子,质粒拷贝数,载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。,S-D序列,ATG-外源基因-TAG,优点,1.非融合型表达载体,产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。,缺点：,容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。,pKK223-3：4584bp，使用的启动子：tac 强启动子，杂合启动子 trp-lac；终止子：5SrRNA 区域（rrnB 操纵子区域），rrnBT 和 rrnBT2 终止子（防止通读）。受 lac 阻抑物调控，1-5mM IPTG 诱导。可直接表达任何含 RBS 和 ATG 的基因，若无

36、RBS，其 ATG 需与固有RBS相隔5-13bp,表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。,启动子：tac 操纵基因：lacP 调节基因：lacI S-D序列,2.融合蛋白表达载体系统,（1）优点,（2）组成结构,便于融合蛋白的分离和纯化。,pGEX系列,lacI,tac,lac O,S-D/ATG,GST,插入位点,TGA,lacP,ori：pBR322 ori 融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。,（3）产物提纯,（4）产物分离,用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。,柱（c

37、olumn）,GST,外源蛋白,凝血酶,外源蛋白,柱（column）,GST,GST,洗脱,柱（column）,可再利用,pGEX,插入区：,pGEX-1T,CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGA,Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr Asp,EcoR I,BamH I,凝血酶,PQE系统：His-tag（组氨酸标签）：,在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。,