聚合酶链反应及其应用.ppt

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1、,5,2,3,4,1,6,7,8,PCR的原理与反应条件,PCR的DNA聚合酶与扩增的精确性,PCR的模板及制备,PCR的引物设计及合成,PCR反应的其它控制参数,PCR技术的衍生与发展,PCR技术在生命科学研究中的应用,PCR技术在临床医学方面的应用,聚合酶链反应及其应用,吕涝扯续妇燕刷颧冕芒丝眠控嘶伯先忠访擞条故卿焦韶唆溅韶桩诣断乓姚聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR技术的诞生与发展,1 PCR的原理与反应条件,PCR技术的反应条件,PCR技术的基本原理,PCR反应的质量指标,纳贪压窥仲瞎丸棘蜘缺绣文牛镊康俱茄各仆紊门偿墟廓粒潘蔗弘世身屯歧聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其

2、应用,PCR技术的诞生与发展,聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）又称为PCR,扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。,1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的,Kary mullis发明了具有划时代意义的PCR技术；,1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台,PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化；,1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝,尔化学奖；,1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。,恭说婆窍奖松射脐惹寐缩硝呵旱样耍新墟膊纽楼寸邦而务防状擦魂之得逝聚合酶链反应及其

3、应用聚合酶链反应及其应用,PCR技术的基本原理,待扩增DNA区域,5,变性,加热,引物,退火,底物,聚合,5,5,加热,变性,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,退火 引物,底物,聚合,加热,变性,引物,退火,底物,聚合,5,5,5,棉然燥躺胰暂希邮嚎咙瘟必惶禄蛊诈垮毫阁傍电轮既聘友屿葬僧桑咨渴竿聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR技术的反应条件,DNA或RNA模板,5,5,待扩增DNA区域,5,94 5 min,5,5,55,退火,5,5,聚合,5,5,5,5,5,循环25-30次,目标DNA片段达106-107,变性,70,DNA引物,DNA

4、聚合酶,dNTPs,Mg2+（缓冲液）,庙害卧姑佳选铀候源夸沫封倡滩又漆毗逞缎昧灰闷衍罕潍疟毕置稍洲靴面聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR反应的质量指标,PCR反应的质量标准有：,特异性（序列选择）,有效性（序列产量）,上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在PCR反应中必须,准确性（序列对错）,对多种参数进行联合控制和改进，但由于PCR反应中的各参数往往,是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效,性、准确性。,亢恳呐嗣元咱杰首流瓷祈迪我断娱摸汹谆兹就旷猛淖恳鲍翅蛔亲钓吸赋茂聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR扩增反应的精确性,2 PCR的DNA聚合

5、酶与扩增的精确性,用于PCR的DNA聚合酶简介,DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响,DNA聚合酶的使用,职迈胯糖胎笼砷彝矣狸迸搔般于蓬姆辩锣睹小拉漫昌婉宋谢肉讨钠疫萤阴聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR扩增反应的精确性,利用PCR技术扩增DNA靶序列的一个重要问题是这种DNA体外聚,合反应的序列忠实程度，即DNA扩增产物序列的准确率。PCR反应的,准确率远远低于细胞内的DNA聚合反应，除了缺少完善的DNA聚合校,正系统外，影响PCR反应准确率的因素还包括：,DNA聚合酶的保真性能（主要因素）,DNA链的物理损伤,PCR反应体系的洁净度,懦蒸汲晃腿觉蛰挨注咋岸攘濒蛾铆纯赫埋别畔肪

6、懦巾审匡笋鹅蛹秦焉毖字聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响,DNA聚合酶的保真性主要取决于其35的核酸外切酶活性，它,负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，DNA聚合酶的,出错率在每轮延伸每核苷酸1.6 X 106-2.1 X 104范围内。DNA聚合,酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：,与dNTP的结合特异性,磷酸二酯键的形成速率,焦磷酸的释放速率,碱基错误掺入之后的持续延伸性,35的核酸外切活性的强弱,激赡懂篆蒙毅饲岸汉窟凉短吮核转锣靳蛹犯谈言垮毡缺勤堕悼顶野烃矣的聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,用于PCR的DNA

7、聚合酶简介,Taq DNA酶的聚合出错率较高（2.1X10-4），因为它没有35的,的核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使Taq酶的,聚合出错率降低到原来的1/3。Taq DNA聚合酶催化的聚合反应的普遍,则Taq DNA酶还常常导致扩增产物的缺失突变。,Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）,错误类型是由AT转换为GC；如果模板DNA具有形成二级结构的可能性,避免稀释保存Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性,Taq DNA酶在使用时应注意：,妆剧匿雹骗絮邮男譬幽蔗拧像立配拷馈顽向蜀瓢浮墓渡沙灵疏良赡洲唬吗聚合酶链反应及其应

8、用聚合酶链反应及其应用,用于PCR的DNA聚合酶简介,KlenTaq DNA聚合酶是一种N端缺失了的Taq DNA聚合酶，因而,没有5的核酸外切酶活性；,KlenTaq DNA聚合酶的Mg2+最佳浓度范围很宽，因此很容易优化,KlenTaq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）,在最佳反应条件下，KlenTaq DNA聚合酶出错率为 5.1 X 105，,性能略优于Taq DNA聚合酶。,反应条件；,鸵抿碎题立虚掠靡塔苛慧奢扑瓷寓圃四糊渭腕面捷者血由旨虱片羽挤驶锨聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,用于PCR的DNA聚合酶简介,Tth DNA聚合酶在Mn2+的存在下，能有效

9、地反转录长度在1000碱,基以下的RNA；,Tth DNA聚合酶在Mg2+的存在下，能由DNA模板合成DNA；,Tth DNA聚合酶（Thermus thermophilus）,好地克服RNA链中普遍存在二级结构的难题。,Tth DNA聚合酶在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此能很,梁畅谎纹盒延箕缩取仆不诱挟厨淄傅狰粪擎崖手隘唬阳登绒途景恳画里篱聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,用于PCR的DNA聚合酶简介,Pfu是一种高保真的DNA聚合酶，出错率极低；,Pfu DNA聚合酶扩增出的产物带有平头末端；,Pfu DNA聚合酶扩增速度极快，达1.5-2 min/kb；,Pfu DNA聚合

10、酶（Pyrococcus furiosus）,Pfu DNA聚合酶的热稳定性很高。,7.0 X 107-1.6 X 106,卉橇孝剪烦衔烘浑即献又密皮姬骡震陡逸料超村掠捏攒刮汛憋愉碟翔谭廖聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,用于PCR的DNA聚合酶简介,Vent DNA聚合酶具有35的核酸外切酶活性和校正功能，因此,与其它DNA聚合酶（如Taq酶）相比，具有相对较好的高保真性，其,出错率为2.4 X 105-5.7 X 105；,Vent DNA聚合酶（Thermococcus litoralis）,度小于2 kb时，扩增产物的长度与Mg2+的浓度并无关联；,如果扩增长度大于2 kb，则

11、需要高于2 mM的Mg2+，而在扩增长,如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，Vent DNA,聚合酶不能延伸引物。,胡健臆卷缔茂锄瘁颠悬义峡警奈叹礼箭褐捧乌耽撑炬炔雪丧浪扔丁射刁挫聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,用于PCR的DNA聚合酶简介,DeepVent DNA聚合酶是一种在低温和高温条件下均极其稳定的,聚合酶，且能使用广范围的辅助溶剂如甲酰胺和DMSO等；,DeepVent DNA聚合酶能产生长达14 kb的扩增产物，其外切酶,DeepVent DNA聚合酶（Pyrococcus species GB-D）,活性比Vent DNA聚合酶高 4 倍，聚合活性比Taq D

12、NA酶高5-15倍，,度小于2 kb时，扩增产物的长度与Mg2+的浓度并无关联；,如果扩增长度大于2 kb，则需要高于2 mM的Mg2+，而在扩增长,如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，Vent DNA,聚合酶不能延伸引物。,出错率比Vent DNA聚合酶低 2 倍；,痕勋嗽捣缘佯善舟啪哨寺榴炬烙工霉院垫有募峙荡乳予保讽刮歹服矽蒂最聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,用于PCR的DNA聚合酶简介,UlTma是一种高保真的DNA聚合酶，可以较高的产量扩增小于,3 kb的DNA靶序列，产物呈平头末端。,UITma DNA聚合酶（Thermotoga maritima）,妥彰憾蹋欣式

13、阜关演枚堰吧斗砌握堵亢拢岩庙及遵杨所伟承磋哀菩福薯焊聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,DNA聚合酶的使用,DNA聚合酶的标准使用范围：1-5 Units/mL,特异性的改进：在建议使用的范围内尽可能地降低酶浓度。,聚合酶的浓度是决定PCR反应成本的的重要参数，浓度,过高不仅能降特异性，同时也导致不必要的消耗。,准确性的改进：建议使用高保真的DNA聚合酶,攀削卡漓纶丰碱削阿潦专械直罗察小限悠磐鳖逻圈末狗妈句滓烫戎值如洼聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR模板制备与纯化,3 PCR的模板与制备,PCR模板的使用,粗样品中的PCR抑制剂,方御未途夺葬诗抢欺敦罗管浩吕继滴隅桃早对狸

14、饺牙克泽楼枢嫌补嗣颓邹聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR模板制备与纯化,DNA和RNA均可作为PCR扩增反应的模板，但一般情况下，mRNA,先逆转录成cDNA再进行扩增。,PCR模板的来源主要有两大类：,纯净物 如重组质粒、制备的染色体DNA、回收的DNA片段,粗样品 如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、土壤、,尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、喷,嚏液、痰液等,上述粗样品含有大量的PCR反应抑制物质，因此如何去除这些种类,繁多的抑制剂或者添加必要的PCR反应增强剂显得十分重要。,斜赞张居仲捉描舔值方哩暗秩宵念搞怔嚎纷花款闻颇醉舀浩粕稿夺艘绕爱聚合酶链反应及其应用聚

15、合酶链反应及其应用,PCR模板制备与纯化,从各种粗样品中去除PCR反应抑制剂的程序不尽相同，但常用的,手段包括：,样品稀释,溶剂萃取（氯仿异戊基乙醇 491）,乙醇沉淀,高速离心,超滤,洒秀陕叁戚鞭竭直递麻穗潭比锭誓撼揽屹吾俞末摧坯刮召炎弯蔑缸舜芬疾聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,粗样品中的PCR抑制剂,粪便 胆盐、胆红素（抑制浓度50mg/mL）,血液 亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、heparin（抗凝剂）,土壤 腐殖物质、含铁化合物,植物 硫酸右旋糖苷,食品 未鉴定的抑制剂,痰液 未鉴定的抑制剂,匡耿心朗烷贺失双粪胆培裸眩坎搬谬硒衡硕苏菲腰卖董又把扛抒坑蛾椎隶聚合酶链反应及其应用聚合

16、酶链反应及其应用,PCR模板的使用,PCR模板的标准使用范围：102-105 拷贝,特异性的改进：增加模板DNA的量、降低引物与模板的分子比,有效性的改进：增加引物与模板的分子比,模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一般,而言，模板DNA长度小，PCR扩增产物的量就大，因此对于大分子,量的模板DNA（尤其是真核生物基因组DNA），在扩增之前最好先,用超声波处理或限制性酶消化。,缓墟玄聋白赢盐果腋簧庶且挥籍蝉汽株顺踩剪掸撵狙阴淮藻铡拷始禄始营聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR引物的设计原则,4 PCR的引物设计及合成,PCR引物的使用,引物的在线设计工具及免费软件简介

17、,傍伐膝邮涨毁码惰噬佯纂柄颗抨证葛肚先筋锤酵涎屉殷瘁雀隶当远逝莫迈聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR引物的设计原则,选择合适的引物是PCR实验设计的重要步骤，合适引物最基本的,引物的长度,标准就是与靶序列的高特异性杂交。为达到此目的，引物设计应注意,下列几点：,理想的引物长度应该在18-30个碱基之间，常见的是20-27个碱基,肥隶租琉钾男毖官呸屎利垃慧莫朵潭磅焦眷遗洪振嫩蹬抓殷脸枚本文咐速聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR引物的设计原则,引物的GC含量,引物序列中的GC含量应在35%-65%之间，最好在45%-55%范,围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有过高

18、的GC碱基，那么就,在其5端设计一串A或T；同样，如果引物中的AT含量过高，就在其 5,端设计一串G或C，以便将整条引物的GC含量控制在合适的范围内。,医卯俘规虾稗痹寝铆船茵响廓弗毕恩晨椎谍浮蝎嘲奉废酞萤刚停拟桐纬嘶聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR引物的设计原则,退火温度（Ta）,引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低5左右，在很多,情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到4-6，尚,不至于影响RCR扩增反应的产量，但它们的退火温度应在55-75范围,引物碱基20，Ta=4 X（G+C）+2 X（A+T）-5（）,内。如果两条引物的退火温度差别过大，可以适当延长

19、较低Ta值的引,物的3端（这样可以保持扩增产物的长度不变）或5端。,引物的Ta值估算有多种公式，最好根据RCR试剂盒建议的计算方,法，例如Alkami Quick Guide试剂盒建议的计算方法如下：,引物碱基20，Ta=62.5+0.41 X（GC%）-500/长度-5（）,穿沏泼畔元肩乌蓉凿靳权逃躯躺含冠理博何樟婆东哈忽箔伐溢摔浚蒂湿轨聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR引物的设计原则,杜绝互补区域的存在,引物序列和靶序列各自内部应杜绝互补区域的存在。,为扩增后操作提供便利条件,在不影响扩增反应特异性的前提下，可在引物的5端引入诸如限,限制性内切酶识别位点、启动子序列等有用的非

20、模板序列，以便于扩,增后操作。,毅靳朴缴淆敬载回遂经粘梧担朔纠送堵河士居乡候咎挫鸵择瞳肄州弦血菜聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR引物的设计原则,引物与模板的互补程度,在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到100%互补，但,检查靶序列上其它可能存在的引物同源区域,为了减少PCR扩增产物的污染本底，在设计引物序列时应检查模,板DNA上是否存在潜在的引物同源区域。,尽可能高的互补程度是必要的。,剪苍界彰令讲阵监怎妙李庭觅洽蓬算遂莆乐漫仍栗厢抬浆声歉蔽怠插饿眼聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR引物的设计原则,选择内含子序列作为引物序列,在真核生物中，即便是在重复基因的

21、不同家族成员之间，其内含,引物的末端序列,在引物的两端设置1-2个嘌呤碱基，最好在引物的3端避免G或C,这样可以在聚合反应开始时增加引物后面碱基掺入的机会。引物3端,子序列也是随机多样性的。,至少应有1-2个碱基必须是特异性的。,弟沫碱豪列阁鲤喉友饲风瓷唯狡逆砚屉萎纷窝鸭末悲步透演谷滥魔径皿嗅聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,引物的在线设计工具及免费软件简介,The Primer Generator（TPG）,http:/www.med.jhu.edu/medcenter/primer/primer.cgi,TPG是一种基于CGI数据库便利的用于定点突变的引物设计工具。,只要在网页上相

22、应的位置中键入不超过15个碱基的短核苷酸序列、所,期望的氨基酸序列、以及允许替换的最大碱基数，设计工具便会提供,满足初始要求的所有可能的引物序列，还能显示酶切位点的消失或增,加。但TPG的一个明显缺陷是不能计算引物的Tm值并判断其稳定性。,艘钝铂山伟契耿累埃屎硬录九瑟敢秉妙老咨官扔缨乙敌淑柑冈衔搀横囊扯聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,引物的在线设计工具及免费软件简介,Primers!,http:/javascript/,Primers!是一种基于Java的引物设计程序，可以选择所期望的引物,长度、最大Tm值、最小Tm值、误配碱基对数等四种参数输入引物序列,其特殊的优点是能限定所输入的

23、序列中适合引物设计的区域，这对检索,若干kb长的DNA片段中各种可能的引物是很有利的。而且能根据三种计,算方法显示正反向引物的Tm值，可以随意更换碱基以提高或降低Tm值,同时还能提供引物稳定性的参数，包括发夹结构、引物二聚体、引物相,似性等。缺点是不能计算发夹结构、引物二聚体的响应Tm值。,地狼撒芍夕柿寂琉宫撂颊硒兵阔吩川吝蘸虫隅崔十铀丰燎聊驰灾邢苦醚靖聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,引物的在线设计工具及免费软件简介,其它的在线设计网站,WWW GeneFisher,http:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/,Web Pri

24、mers,http:/alces.med.umn.edu/webprimers.html,Project DOPE2,http:/dope.interactiva.de/,NetPrimer,http:/,Oligos-U-Like Primers3,http:/www.path.cam.ac.uk/cgi-bin/primer3.cgi,肿虞炉托羔具盂弊玩赎冲钻蚊邻镜嘿磺肪朴辜戍镀悍蚀领甄邑抖迁莹汰丁聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR引物的使用,PCR引物的标准使用范围：0.1-1.0 mM，最好0.2-0.5 mM,特异性的改进：降低引物和dNTP的浓度可以在很大程度上改,有

25、效性的改进：增加引物与模板的分子比；如果引物中有不配,善PCR扩增反应的特异性，高浓度的引物往往会导致非特异性,的退火及副产物形成，同时也会促进引物二聚体的产生。在模,板量一定的情况下，降低引物浓度实际上也是降低引物与模板,的分子之比。,对的碱基，则适当降低引物的浓度。,羚课铃贝哪窗曝叛朔墩谎歪蝴掏十怯席盅也香襄刮摸漱琶客仲眺扳固霸琶聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,5 PCR反应的其它控制参数,脱氧三磷酸核苷酸（dNTPs）,预热变性温度和时间,Mg+2离子,退火杂交温度和时间,延伸聚合温度和时间,循环次数,反应体积,现厩龋市滤险汉饭诲占潍撇力寞志潭敷索裙肯挑把携涉柠痘雀柔安终男女聚

26、合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,脱氧三磷酸核苷酸（dNTPs）,dNTPs的标准使用范围：20-200 mM,特异性的改进：降低dNTPs的浓度，但要注意Mg+2的摩尔浓度,有效性的改进：对于较大分子量的模板，应适当提高dNTPs的量,如果一种dNTP的浓度过高，它就会优先掺入到延长链中，造成,扩增产物的不准确，因此要保持四种dNTPs的一致。此外，保,持四种dNTPs的浓度略高于DNA聚合酶对各种dNTPs的Km值也,很重要（10-15 mM）。,也应同步降低。,准确性的改进：降低dNTPs的浓度，但要注意Mg+2的摩尔浓度,也应同步降低。,驼科腔嗓剿球偿炯篱漱等萨湖允碱壮津喂胃兜江

27、寨叔躯羞剁言袄账簇砍鸵聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,Mg+2离子,Mg+2的标准使用范围：0.5-10 mM,特异性的改进：降低Mg+2浓度，但要注意过低的Mg+2浓度又会影,有效性的改进：提高Mg+2浓度，但过量Mg+2将导致非特异性扩增,游离的Mg+2离子浓度应高于dNTPs总浓度0.5-3.0mM。由于Mg+2,能与dNTPs形成可溶性的复合物，过低浓度的Mg+2离子将会影响,dNTPs的有效浓度。Mg+2的浓度影响扩增产物的特异性、引物退,火、引物二聚体的形成、熔点温度、酶的活性和准确性。因此，,PCR反应系统的主要优化参数是Mg+2的浓度，尤其当扩增产物大,大于1kb时，

28、这个因素显得更为重要。,响扩增产物的产量。,履欧韩陌仁省绿河砾绍史眷沂娇抵熏廊思嘎蒜叠登隐彝纷飞篇曳卞撅铣堡聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,预热变性温度和时间,预热温度和时间的标准使用范围：92-96 30 secs-10 mins,在酶不存在时，预热能灭活样品中有害的蛋白酶和核酸酶，同时,又能保证模板的完全变性，尤其是基因组DNA直接作为模板使用,时，更显得重要。,变性温度和时间的标准使用范围：92-96 30-120 secs,窃去宵渐壶绵躇镇邱翟壳平扑何醉赠蜘欣宽说涵份潜胆行锅参什谆美甜才聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,退火杂交温度和时间,退火温度和时间的标准使用范围

29、：37-65 10-120 secs,退火时，引物迅速杂交。不同DNA聚合酶所拥有的Tm值的差异,会改变有效的引物退火温度。,特异性的改进：提高退火温度（比建议退火温度提高2-5）；,减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，,只会增加非特异性引物杂交的可能性。,罢獭地麻恩桓滚唐急送三油鳞姜铰钠碴趣卢执蓖萎非吱签耙顿悉朔菩耗另聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,延伸聚合温度和时间,延伸聚合温度和时间的标准使用范围：72 60-120 secs,PCR扩增反应中普遍使用的DNA聚合酶的聚合速度每秒至少50,个碱基，所以如果PCR扩增产物长度小于400 bp，聚合时间可以少,于

30、15秒，特别是当退火温度选得较高的时候，在退火阶段就有一些,单体掺入。较长PCR产物的扩增需要相应延长反应时间，但最好要,比理论计算时间更长些，以弥补由于反应系统粘度增大所产生的反,应滞后作用。,吏匪秽詹竿廉稿虎使姆近雇柏镜剖洲冰徒剐霄额尖盾喧终瑶掖蒙抒菱戒砷聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,循环次数,在一定的循环次数下，PCR反应的最终产量可由下式估算：,由上式可以看出，PCR产物呈指数扩增，但当然产物拷贝数达到1012（阈值）时,产物的扩增速度一般急剧下降。达到这个阶段所需要的循环次数可由下式计算：,影响上述扩增阈值的主要因素包括：,扩增底物（引物和dNTPs）有效浓度的下降,Nf

31、=N0 X 2 N 其中N为循环次数，N0为起始拷贝数，N0为最终拷贝数,Nf=N0（1+Y）N,非特异性产物或引物二聚体对反应试剂的竞争作用,反应试剂的稳定性,扩增产物抑制作用,高浓度产物的退活作用以及不完全变性,特异性的改进：降低循环次数，减小扩增片段长度。,有效性的改进：对于1kb以上片段的扩增，增加循环中各步骤的滞留时间。,年椿作习沦承视济纹湖塞项陆室博巧酚杜庞筑梧殴袋潍咖狰螺墩缀锈脊衬聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,反应体积,反应体积的标准范围：20-100 ml（0.5 ml的小离心管）,有效性的改进：增加反应体积以及保温时间，以充分保证热平衡；,5 ml的反应体积也有成

32、功的例子。反应体积过大会影响加热和冷,却，而过小的反应体积又容易导致温度变化不稳定，进而降低产,量，甚至反应管的几何尺寸、管壁厚薄、扩增仪的加热冷却装置,也能影响各循环步骤所需的时间。,对于100ml以下的反应体积还应该用油封顶，以减少反应体系的,蒸发浓缩效应。,斑辑诀逊凉锅劣滔庞叠掇衷沮婪坦恃钳顾邵屯贯么婪邓强蛾但该涕舞馁牟聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,6 PCR技术的衍生与发展,LA PCR（Long and Accurate PCR）,RT PCR（Reverse Transcriptase）,原位PCR（In Situ PCR）,定量PCR（Quantitative PCR

33、）,锚定PCR（Anchored PCR）,多重PCR（Multi PCR）,反向PCR（Inverted PCR）,不对称PCR（Asymmetric PCR）,卿交桓仰限挝剁惮铭逝呆客镇误引周督柔羽独梅姿藉耕奢褐窄斥襟缴名岔聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,LA PCR（Long and Accurate PCR）,LA PCR是一种专门用于精确扩增较长DNA片段的特种PCR程,序，其关键的技术是结合使用两种热稳定的DNA聚合酶，可以扩增,出5-40 kb的DNA大片段。两种酶的配比如下：,其中，Pfu和DeepVent起着二次校对的作用。,KlenTaqPfu=161,KlenT

34、aqDeepVent=501,谁简此馆峡域增档孰勾膛耍各劲匿岩钒系览驯儡污沟仙瞳吴恬尘良沙车胆聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,RT PCR（Reverse Transcriptase）,RT-PCR是一种以mRNA为模板，经cDNA扩增出DNA的技术，,能极其灵敏地检测到任何基因的转录物，而与mRNA的相对量无关。,标准的RT-PCR程序包括：,mRNA的分离,cDNA反应的引物退火,mRNA反转录为cDNA,cDNA的PCR扩增,引物选择有三种战略：,基因特异性引物化（GSP），最精确最灵敏,寡聚dT引物化,随机六聚体引物化,媚绥钓锌支烯圈稀跌浩窄锌蔡维塑吵冕凋扭火妓洼病伺妮舶斟盗

35、坡蔬滇煽聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,反向PCR（Inverted PCR）,通常，PCR反应是对两条引物之间,的序列进行扩增，但如果将模板DNA稍,酶切,环化,酶切,扩增,做处理，即可实现对已知序列两侧的片,段进行扩增，这种战略称为反向PCR技,术。,渍区憎陋缮诚堪骇夏趣趋鸿齐槐聚疼腥释黎伦氟叛绍掌蹿隅藏艇筋楷山廷聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,不对称PCR（Asymmetric PCR）,在PCR扩增循环中引入不同,的引物浓度，使得由两条引物介,导扩增反应呈不对称状态，这种,战略称为不对称PCR技术。,不对称PCR中的两条引物浓,度一般采用50-1001的配比，,在最

36、初的10-15个循环中，主要,产物还是双链DNA，但当低浓度,的引物耗尽后，高浓度引物引导,的PCR反应便会产生大量的单链,掏它碾盛豫臆垮戴阳茶旺贫素地苛阵秆习贮跃煮选瞳粟趟绘过婚运祸失烧聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,原位PCR（In Situ PCR）,原位PCR是PCR技术与原位杂交技术结合的产物。原位杂交技术,可以检测到10个拷贝的DNA或细胞，而原位PCR技术能使杂交的灵敏,度提高10倍，也就是说人们可以在1mg的细胞DNA样品中检测到1个拷,贝的特定DNA序列。,一个典型的原位PCR程序包括下列四个步骤：,待检测的组织或细胞用甲醛溶液固定,用蛋白酶对细胞进行通透性处理，确

37、保PCR试剂能进入细胞,对DNA或RNA靶序列进行胞内原位扩增,PCR扩增产物通常用地高辛系统标记，色谱检测仪检测,待莉整烛卒像丛弥匝峪泊识耿剐塔婶够早隧随们屯飞拭咒篆枫悯讲肾趟服聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,定量PCR（Quantitative PCR）,理论上讲，PCR产物以指数规律增殖，但在所有的扩增循环（尤,其是后十轮）中，众多引物-模板分子上的反应由于抑制剂的作用并非,100%的有效，因此精确定量PCR产物必须使用内标（扩增对照）。,贝的特定DNA序列。,内标使用相同的引物，与待测样品具有相似的长度、碱基组成以,及对抑制剂的敏感性，但又必须与待测样品有所区别，以便在扩增产

38、,物检测分析时能够辨认（如引物的检测方式不同）。,C0/X0=Cn/Xn X0=C0（Cn/Xn）,其中，C0和X0分别为内标和待测样品的初始拷贝数，在110到,101的范围内最佳；Cn/Xn分别为内标和待测样品的扩增产物分子比,傣阮社要循吝虏膘襟汽靶逃稀姥疯饱歌竞叙痛音讥活廉殿骑佣字辅避铰鸳聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,多重PCR（Multi PCR）,加入多对引物，对同一,P1,P2,P3,P4,P1,P2,P3,P4,正常人扩增物,病人扩增物,模板的若干区域进行同,时扩增。适用于绘制真,核生物庞大基因或基因,组中的缺失图谱，如分,子病的临床辅助诊断。,茨菱虚淄盗船忿蝴坪韭凡洱

39、午叉些酉址挣挎济学嗽打涝学播子吟固乍烁衰聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,锚定PCR（Anchored PCR）,反转录,AAAAA 3,5,3 GGGGGGGG,TdT,锚定引物,锚定PCR又称为 cDNA末端快速扩增PCR，主要用于5端序列未知的cDNA的扩增和克隆。,5,5,5,dGTP,5,5 CCCCCCCC,PCR,3 GGGGGGGG,5,5 CCCCCCCC,3,PCR,5 CCCCCCCC,5,特异性引物,论尔搪秋帧沫觅姻揭早鳖钠劲树懈守寇承趟型枚除叉儡洽贪进拜寸氢肃般聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,7 PCR技术在生命科学研究中的应用,特定DNA序列的克隆

40、与重组子的鉴定,PCR-SSCP检测基因序列,DNA洗牌术（Shuffling）,染色体DNA的引物原位杂交,DNA的体外定点突变与分析,同源重组子的检测,谨万拿孵淌红鸵桔扦诫判核仁葵椰响概森滓炊杨迈实载傈摧蕉奉式供址弊聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,特定DNA序列的克隆与重组子的鉴定,GAATTC,GGATCC,GAATTC,CTTAAG,GGATCC,CCTAGG,PCR扩增,PCR产物克隆,EcoRI,BamHI,PCR鉴定,商抢拥嗓摘肘泵掀撵朋爱慢疙骡饥贺象钩勺坛睛谈和辖酿瓢吮葡百处硒亡聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,DNA的体外定点突变与分析,PCR扩增,突变位点

41、,变性复性 除去引物,延伸 加外侧引物,元奢酗啡追匡敝咒似郸锐狮竭婪雾趴促涝秩抓纲认亿条经塔壬薛猎划砾拾聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,同源重组子的检测,同源整合,目的基因,同源交换,目的基因,整合位点,PCR扩增,PCR扩增,台躺度凸扩尧贡稿找榆翟题温慈瘩珊账详踊网咳茄祁泄街肤玻卑荆孰季嫡聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR-SSCP检测基因序列,将PCR技术与单链构型多态性（SSCP）分析技术联合使用，可以,有效地检测和分析基因序列的突变性质。在非变性的聚丙烯酰凝胶电泳,条件下，单链DNA由于分子内的作用力而形成卷曲构型，即便是单一碱,基的突变也会导致整条单链DNA的

42、构型发生变化，并被检测。,采用不对称性PCR程序扩增待分析的靶基因序列，获得特异性单链,DNA，然后在非变性条件下走聚丙烯酰凝胶电泳，与对照样品进行比较,即可检测出可能存在的碱基突变类型。,仑搽可堰销广殖殆篷痴淑个累荔腮骚护昌停阴鸵唱暇赴凿核缸鱼堪捐苞别聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,染色体DNA的引物原位杂交,通过荧光探针使染色体发光是细胞遗传学的一种绘图技术，涉及到,荧光原位杂交（FISH，Fluorescent In Situ Hybridization）和引物原位,杂交（PRINS，Primed In Situ hybridization）程序，用于基因图谱绘,制、染色体畸形

43、展示、基因表达、基因组构成、感染病定性、病毒整合,位点调查等方面。,PRINS是FISH和PCR的结合：首先使寡聚核苷酸引物与处于M期的,染色体DNA退火，然后在荧光标记的核苷酸和Taq DNA聚合酶的存在下,进行延伸反应，合成一系列长度在200-1000 bp之间的荧光探针，进而,绘制细胞染色体的彩色图谱。,桨流淡沸撞协诗椽栏嘱瞬砚德茸诗雨霉污蛹遍溺拢舞补焙借赚懂煎详炮殷聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,DNA洗牌术（Shuffling）,随机切割成20-50bp的小片段,DNA同源序列,混合退火,PCR扩增,克隆,高通量筛选,激善较脯复盔填漳涣排维厦驰集母辊宰替崔哉驳抨投佬掀貌程闯

44、够讳乏赛聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,8 PCR技术在临床医学方面的应用,PCR检测病原体,PCR临床诊断术,涯园醋矽绰柠链替卑吠漏在肩罚螺寥诫吏期辐槽怖少搽优必凸络戮颐跨盟聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR检测病原体,临床上检测病原体通常有三类方法：,病原菌和病毒的生物培养富集,病原菌和病毒的抗原免疫检测,病原菌和病毒核酸特征序列的PCR检测,相比较而言，PCR检测法在很多情况下不需要培养富集待检测样品,这不仅省时，更重要的是很多病原微生物难以培养，如某些病毒、真菌,厌氧菌、支原体等；,PCR检测法比免疫分析法更廉价；,PCR检测法可以使用多重引物同时检测若干种病原

45、微生物。为数不,少的PCR检测程序已自动化，包括样品预处理、扩增反应、产物检测。,窒杯闯狠笼接洽沈胳惊违惺卵灭境峻日蟹芳抠叼为醋榷缮哪搜各守守饲欢聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,PCR临床诊断术,PCR临床疾病诊断术的主要原理有下列几个方面：,检测病变基因的缺失或缺损（扩增产物变小或无扩增产物）,检测病变基因的点突变（扩增产物电泳迁移率改变）,检测病变基因的重排（扩增产物大小改变）,上述方法可以诊断包括各类遗传病、恶性肿瘤、免疫紊乱在内的多,种疾病，但始终没有获得美国FDA的批准，其主要原因是PCR诊断术的,检测染色体易位（扩增产物大小改变）,骨髓移植的PCR指纹图谱快速配型（随机引物扩增）,检测病变mRNA的结构（扩增产物大小改变）,可靠性还受到置疑，有时使用不同的程序会产生两种截然不同的结果。,攘眨放述黎主诲俭院辐塔哗锦瀑入枣埔藐守惫钨柱萍声浑松嘎期憋式效慧聚合酶链反应及其应用聚合酶链反应及其应用,