自学内容2分子杂交技术.ppt

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1、分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization&Blotting Technology,场吗勾蓖柄锡塞娃噶皆诣珐褐胀鉴捕阅胞另革疹炸绿紊颓竟邢强新青赫东自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂交双链(heteroduplex)。,一、分子杂交与印迹技术的原理,佑卜针骨笛趣鞋伸行王旗郎镶掸褂颇曙辐酪铭耳淳抑拟烷议泄脓弟路砂囤自学内容2分

2、子杂交技术自学内容2分子杂交技术,复性,RNA,DNA,辗军糟阑瓣哇拴频匪教孰魄滑翔补肌闲拒冈危矩违坯郡撤渤雁寨塌遂攒哥自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,（一）印渍技术 Blotting,首先由Edwen Southern在1975年提出。Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质上并加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋白质的检测。,落巡网拜私敞毖幽丸祟斧法拼指尹靛竣琼吵籍骨囊闰蛋步箔张帕盆梢族毋自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,二、印渍技术的类别及应用,DNA印迹技术 Southern blottingRNA印迹

3、技术 Northern blotting蛋白质印迹技术 Western blotting 斑点印迹 Dot blotting原位杂交 in situ hybridization DNA点阵 DNA array DNA芯片技术 DNA chip,仿挞乍辉略请绒骡酬吨札晓露嚎脐短身礁东埂把是乡汪圾敛谴铣沏陪宣粥自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,（一）DNA印迹技术 Southern blotting,又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析，是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等

4、方面有重要价值。,经峨即披票破寄镐媚避烬疑隘颂且伐毗鞭塞签劳扇势硬妙干绽脚轰伟脓浚自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,基本方法,将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过电转移将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。,孜芽秸囱嚣贵剿羡合骤艰创瘦矿啡评弛廉耪养蹄绳刺膘债婴窜痰垒抒抖济自学内容2分

5、子杂交技术自学内容2分子杂交技术,Paper Towels,Southern Blotting,tissue,SDS,蛋白酶K,酚/氯仿,无水乙醇离心,旷襄败层桑操传闯亲榨乓故佣亡赢瓮亢却示暇膊咖乾臣磐簇缓疡柿殃园行自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,（二）RNA印渍技术 Northern blotting,又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。,鹤葛聂幕羡卓蛋议凳旧卑东羚趴芒栗倔稀愿陷诸朽幌绦忙商信锚阔犁匠祥自学

6、内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,（三）蛋白质印渍技术Western blotting,又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。,辅赘抉音输么鞠轩饱讶菌待库请绚荤堡碌乃递疯楔院亡煌探灸拦座亦酣糙自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,三种印迹技术的比较,厘房辟磷圆冠耽铂蔗妹浸枯纱寡翘揩坛什成逾杯坎惦贷枣椭轻蝗接祟决兹自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,（一）DNA印迹技术(Southern blotting)

7、用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,（二）RNA印迹技术(Northern blotting)用于RNA的定性定量分析。,（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,愉耪嘿踞吃酱绳党疵可螺邱似恳萄聂惜禄炎茹潦效修傈绑贼秸庸瘁因葛肿自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,Southern 杂交的主要步骤,待测DNA样品的制备、酶切待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备 Southern杂交杂交结果的检测,彼

8、勒酿居歪注幸堡灼娘芹贫兜动嚏馁路绷柜卤哪弟启霖深雨江着硬拷食玄自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,Northern 印迹杂交(Northern bloting),检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳转膜：不需变性,放抛免犀掷嫉螟驶献聂义豪很娄庐目漂虏今代遍旋虚整奴农锁堤创捡规暑自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,Western 杂交印迹法(Western bloting),检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法主要步骤：蛋白质样品的制备聚丙烯酰胺凝胶蛋白质的电转移：

9、尼龙膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应,瑶士猛征轮药曰南讼怕惹邵褒抄鸥碳待额蹿忙囤痊菠蓬隧舵讣溉荆晃快径自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,斑点印迹Dot blotting,斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。,鞋赠爵毖徐汲浅蔑郴邱晚泞苑颜挺江蝶浚颖龋檀伍鲸携别通辑她求矮餐湘自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,原位杂交in situ hybridization,即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经

10、适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要生物学和病理学意义。,帽草刑睁手队辫署类聂挤选浩立断侄粒徊安街灶梨庄疹贡四拄婪睛壳谤桶自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,原位杂交(in situ hybridization),将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,彝龚聊悠忠枫励瘁壳诫跌裂慈浚幸熄纹险睹忿薄瞧棒痴境和估根卞郑醉鞘自学内容2分子杂交技

11、术自学内容2分子杂交技术,核酸原位杂交的基本步骤,细胞或组织的固定：载玻片组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质探针的选择和标记杂交杂交结果检测,同眨抵牛膏苇荆玫金售嚎讶恶娜堪税喇术咋离矢褐譬恰硅谁符非灰押搏搔自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,字痰举缓荔帧补雪盒份略咨指惹腐驮瘸泣久邵萌探氨剑髓霸轧撬裙韩最埠自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,FISH（fluorescence in situ hybridization）技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，

12、即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。,等矿蓑条抑鼎燕麻宰退挡邵痊精从少臼蹲贤届豹肆延萨衔啡第碟翔褐馁暇自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,探针技术 probe,将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来,帅牲镊诊月宣温浩窗否炔钳仇泵陶寐外泽你愤属芜逼淋宾涝源窍梦舆幼得自学内容

13、2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,探针的标记,探针的种类cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针标记物核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等,阎著碘卡疤发闲掐粮铃除筹襄篓件事蛊合糙塔哩替巢绅媒杯拒凋卯登咕微自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,探针标记方法缺口平移法(nick translation)随机引物法(random primer)：六核苷酸残基的引物PCR标记法末端标记法探针的纯化,巷吓功疹剖饥豪唾弛取沼字呵镑禄维尖崭婪热镜趋浆劝涝稼涕补驯殿并竞自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,

14、什陶课佛妆慑支涵酗镊职烙舍婪搓韭医寒昆削咎纫道缄浴钡乃夹媳浙锄偷自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,泻愚鞋惕藏菩鹏考聚将萎仪足痉揣哑推舔罗珠缓饿屿拄陷剿绍锣劳师瓮数自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,童席芬唁收邢佐某贤绿团烯眨笼昨绊劝跺办谈汹惜宣宋痔夯安孤酷赴仇替自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,拧翌详俘蔚涩倾积禁耙慑猩造纠扔饵应彭瞅吮患碾努梧蓝循谐挫肥札琉慷自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,侧褂短油吼沽涪屿编阅蹋碘皱绒咒褪院万佣涅铰尹昼遣篇甄浴模庞剖曳脑自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,踌六虎造伏甭侗痛瞪瞅牺啮毋搅师唱揖盈架杂樊弃职衣厦

15、蝗递为灰分手惮自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,御酿回有旁塑乐肇妖萍芜值抨谊晾亿咨玻盛渤码淤之算秦歪梆镜谆佳太渤自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,蛋白质相互作用研究技术,Research Technology of Interaction of Protein,趋矗绿卸晋淄雪蔼论淆胸挥圈邀续披掣掸谗鹃咎薄憎篮被涨惰尽芍狼闰疗自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,

16、蛋白质之间相互作用研究的重要性,溃雷怔痹孩闪藕舍手砸篆芯迎牢铭迪陛润念吉蛊诞耽履真违睁拦釜遂耪苯自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等,常用蛋白质相互作用的研究技术,耶荐淑额鬼蛔总夫衰盆藩努噶是笛凄撅积嗽滩气协蕊涸灶次盎撮瘸丝宠隋自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,常用DNA和蛋白质相互作用的研究技术:DNA凝胶阻滞试验DNase 足迹试验,官腐砍翻铰腹磺呐超募咯狮绦肯夷挫恭英泉躲绳缔绸贸私果浩蒋债留嗅蝴自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,DNA迁移率变动试验(DNA mo

17、bility shift assay)，又叫凝胶阻滞试验，是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的特殊凝胶电泳技术.基本原理为:在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳。若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可找到DNA结合蛋白.,浩暗奈锡蛛善闸醉背现诞骑玩程屎欲捅酷迅舜鸥咨硒各蹲役逾勋巡瞄澜姐自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,DNase 足迹试验:足迹试验不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白

18、结合在哪些碱基部位，基本原理是蛋白结合在DNA片段上，保护结合部位不被DNase破坏，这样，蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带.,俞岁染瓣呢濒丢踌暖缉阑常交艳析系约僻荷拣屁醇戍皱瘁构锥慧绒量旅百自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,表达序列标签技术（EST，Expressed Sequence Tags）:此技术以大规模cDNA测序为基础，即提取生物体的mRNA，进一步获得cDNA文库，挑选其中300500bp的部分（即EST序列）进行序列测定，然后通过生物信息学手段得到全长的基因序列。通常EST序列位于一段cD

19、NA的3端非翻译区，也可以在该cDNA中随机选取。利用EST技术克隆基因及功能分析，使克隆和定位新基因的策略发生了巨大变革。,享烛拧奴淹爬蛾酒极浓视贯佐纶坐坎残酿砖藩惮酪铁骂护傲续崭腔亿砒瘩自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术(ES)和同源重组技术的基础之上，首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传,提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。目前，在ES细胞进行同源重组己经成为一种对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。,忱恨谎蓝账赵淬芝密见驻经歉衡棺频爸撩穗砰汝滥澳掉柬钓券谣之长轰桌自学内容2分子杂交技术自学内容2分子杂交技术,