艾滋病抗体检测技术422.ppt

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1、HIV抗体筛查方法,窑汗畦个涝滦吼屁帜萤踩身缄蓝卢贯往哆绿血亏鹿覆浅短汛愉词渴臻君两艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV的感染机制简述,HIV在病毒分类中属逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。迄今为止，根据血清学反应和病毒核酸序列测定，全球流行的HIV可分为2型：HIV-1型和HIV-2型。在HIV-1型内，根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性又进一步分为3个组：组（主要组）、组（外围组）和组（新组或非M非O组），组内又可分为-10个亚型。在HIV-1型和HIV-2型之间,其核苷酸序列有45-50%的同源性，并且存在免疫交

2、叉反应。应用免疫印迹法(West blot)可以将二者明确地区别开来。,馁凌悄剩氖标溜慢皇适仙牙峨幅溶专碰坤淘颜浴辨采染博獭辑博溪请蜂莉艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV的感染机制简述,HIV-1和HIV-2型虽然都起源于非洲，但HIV不同型，不同组甚至不同亚型在全球流行是不均一的。HIV-1的O组，N组和HIV-2型只局限在非洲某些局部地区流行。而HIV-1的M组病毒呈全球性流行。到目前为止，全球流行的绝大多数毒株是HIV-1M组中的A、C亚型毒株，接着是B亚型毒株，然后是A/E和A/G亚型重组毒株。进一步的分子流行病调查表明，在非洲几乎流行了HIV的所

3、有亚型，但以A和C 亚型为主，同时，也正由于众多亚型的共流行，那里也是发生病毒重组最多的地方。在北美、欧洲和澳大利亚，B亚型仍然是最常见的亚型，虽然M组的其它几个亚型、甚至O组病毒已经在美国和欧洲几个国家有报道，但进一步的现场流行病学调查证实，这些人中的大多数是来自非洲的移民。在南美，B亚型占有优势，但C、F亚型也有流行。在阿根廷和巴西有B/F重组毒株的报道。在亚洲，好几种不同的HIV-1亚型流行于不同区域，在印度C亚型占主导，同时有A、B 亚型共流行和A/C亚型重组毒株的报道。在泰国则有二种独立的亚型流行，B亚型和E亚型（即A/E亚型重组毒株）。在我国主要以B、C和E亚型流行，但同时也A、F

4、和HIV-2型的报道。,孜歪拌栽沽够隐硷话剔罢谢瞎菲需牲寅磁镜刊夕烛鸽背婆砂偶荷颂早茄臀艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV的感染机制简述,HIV病毒侵入人体后，其表面糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4以高亲和力结合，吸附到宿主细胞上；gp120再与宿主细胞表面辅助受体相互作用，使病毒与宿主细胞膜更接近；gp41产生一系列构象变化，其N端的融合肽片段插入宿主细胞膜，导致病毒包膜与细胞膜的最终融合，病毒RNA进入细胞。在HIV感染后，最先能够监测到病毒RNA、然后是p24抗原，最后是抗体。,本隧涟贴孙尔踞榜狗躲觅芒缔螺巫嵌警册哼青驰搂互约无似凉笆燕书台珐

5、艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV的感染机制简述,在感染后的1014 d内，病毒RNA水平是呈指数上升，随后下降并保持在持续稳定的水平上，进入HIV无症状期p24抗原水平随着病毒RNA水平的发展而发展，在急性感染期就可以出现，被认为是病毒复制的间接标志，但由于检测方法的灵敏度不够而使得其检出时间要比RNA晚。,满挂廊荤泉砰卡烘肤右札吻依嘿榨砍潜猾法榆悬慷羌题疡燃阳滞奉狮哆姓艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV的感染机制简述,窗口期概念：从HIV感染到能够检测出HIV抗体这一时期,被称作“窗口期”。在窗口期，只有通过病毒R

6、NA、p24抗原和CD4淋巴细胞水平来确定HIV感染。CD4淋巴细胞水平随着感染的发展而逐渐下降,当其在血液中细胞下降到200个/mm3时，就会发生严重的免疫缺陷，患者就被确诊为艾滋病。病毒RNA、p24抗原、HIV抗体和CD4淋巴细胞水平可以用来确定HIV感染、检测病情发展。,汤兜习奴追贴且兄芍惟俩俱疙悦理卯讹墓次舆枷甲贰舆矮仑愉窜痔作翰贪艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV感染的主要检测方法,目前检测HIV的方法有100多种，总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类。早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体,间接地诊断HIV感染。病毒检测

7、包括p24抗原检测、细胞培养(病毒分离)和病毒核酸检测。抗原能够在个体感染后先于血清转化218 d被检测到。因此，在血清转化期通过检测p24抗原有着很大的优势，可以作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。,握午霸庐湿嚣想诺崭郊觉核腆晦明垃袭雄巩赏式噪毡也臻薄讶序伎碑红社艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV感染的主要检测方法,病毒培养是检测HIV感染最精确的方法。一般采取培养外周血单个核细胞(PBMC)的方法进行HIV的诊断。在窗口期可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。病毒核酸检测通常是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，具有很高的灵敏度，使用适时荧光聚合酶

8、链反应(PCR)技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。近几年，分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中，HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了HIV实验室诊断的发展方向。,宿盾遵诅润搔咨挠豹体忧荒靳荐葱葛时椿钡福细利湘羽邢疮橱液鹃护千霜艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV感染的主要检测方法,抗体通常是在感染

9、后38周能够被检测出来，在窗口期，病毒抗体不能被检出。抗体检测由初筛和确认试验组成，目前，大多应用双抗原夹心法进行抗体筛查，这种方法具有很好的灵敏性和特异性。酶联免疫吸附分析(ELISA)方法有一定的灵敏度，且操作简单、快速，适合对大量样品的检测，是目前临床通用的初筛检测方法，初筛试验呈阳性的必须进行确认试验。确证试验国际上有3种确认试验方法，包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验,目前以免疫印迹试验最为常用。,孰宽降捻俞折熬荣碧驰喀午硷愿员铃平箭建呢谆浩锥害垛撰枝腾鞭难脊渝艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,HIV抗体一

10、般在人感染后数周逐渐出现,可延续至终生，95%在三个月可以检测出抗体。血清学试验分为初筛和确认试验。常规实验方法：酶联免疫吸附试验、免疫印迹试验(WestBlot)、间接免疫荧光法(IFA)。快速检测方法：明胶颗粒凝集试验、斑点免疫结合试验、24抗原的检测。最常用的初筛试验和确认试验分别是酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验(WB)。,钩测摆蝴中嫂下桅岂车肪窝轻肘驱诲酪峨分闭粒锻累朽邮炙粪砒劣纯收奎艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,常用HIV病原学检测方法:病毒分离抗原检测-24抗原的检测核酸检测（cDNA测定-PCR、RNA测定-

11、病毒载量）其他方法：逆转录酶测定、原位杂交常用HIV抗体检测方法:ELISA 快速HIV检测（RT）免疫印记法（Western Blot）其他方法：免疫荧光法（IFA）、放射免疫沉淀,郭鹊删亲氏闰登酮桶营硬溪第屹绊症撩崖零适搏往莎既罩庇珐弗缎常慢骑艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,酶联免疫吸附试验：ELISA法的基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物，酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物,然后加入酶底物,经酶的催化或水解作用,无色底物产生颜色,用肉眼、分光光度计观察结果。分类：双抗原夹心法测

12、抗体、双抗体夹心法测抗原、间接法测抗体、竞争法、捕获包被法等由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。,个撕耕隐醒席都滁液协鳖棋状巨洛郁杀盒赵鸣弃兽优席镰僚胃张菌积鹊浓艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,ELISA的结果判断：实验是否成立判断：阴性对照（NC）和阳性对照（PC1，PC2）的要求条件Cut off值的确定灰区概念：把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告阳性，灰区概念对血站

13、系统的献血员筛查尤为重要。高值钩镰效应（HD-HOOK）：在二位点夹心ELISA中，其剂量反应曲线的高剂量（HIGHDOSE，HD）区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状。产生该现象的分子机理有分子变构说和浓度效应等推论。一步法和二步法均存在，只是前者出现的更早些，大多数是高值低吸光度，很少阴性结果。报告：对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告,对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告.,羊矣鞍孕块秀澄微左歼晋湃缘琼遇瞄乙公陋煌垣甜捣拒炙艺材启绞呻偏韧艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验

14、的影响因素,试剂的质量-选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。选择灵敏度高，特异性好的试剂。不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，影响灵敏度因素：试剂平衡30分钟：试剂没有平衡或平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分，灵敏度明显偏低。冬季室温低，可将试剂盒置37温箱20分钟。试剂存放：试剂在室温放置24小时后灵敏度开始下降，放置时间越长、室温温度越高灵敏度下降越明显；实验过程中任何一步缩短时间灵敏度都明显下降，如果同时缩短每一步反应时间灵敏度下降更显著超过有效期的试剂灵敏度明显下降，超过时间越

15、长下降越明显。,侥噬箔身缉激挑枪稼荤纽缮智祝证摸鳃零刽肉车躲或琴革够深藕头螺蒂一艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,标本质量：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8冰箱中，若要贮存，则置于-20的低温冰箱内。干扰物质的影响，大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其他物质等。

16、如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，会释放出原生态氧(O)，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性。,瓤羚刘鄙百丝峪订衅协洗娟辣筑龙仆爵锄榴犊许海刀宽趁焰箱闷州胶栅唉艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,标本质量：因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的

17、标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 d内测定的血清标本可存放于4，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性最好使用真空采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活有时为了争取时间快速检测，常在

18、血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。,贝筑汛竖刮近樟杀袭驭错溯泪诅聂胯械柱慌拄挑镁垦沦鞍秒碟斩沤钱格谅艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,加样：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定

19、为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；全自动酶标仪也存在同样的问题，孵浴时间差距较大。标本较多时，请分批操作。吸量不准确，直接影响检测结果。因此加样器也要经常清洗，定期校准。加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。加样的顺序,持朵库悠发蕉矫后概狭蕾神烘傈项笋镰割剧咕憨全蠕园变疹畅窒战淋击锹艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,孵浴：温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边

20、与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入和水分蒸发。孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。,轿铣瞪耐锻尘孜拐迅炸玉下跺应假绷酶苇浙佰诽寿拜纳掺希紫挛躺叭磐墩艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,洗板：是ELISA操作的重要环节，手洗条件一致性较差，对结果影响较大，全自动洗板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔处于阻塞状态，造

21、成未结合标记酶洗脱不彻底，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。导致“花板”造成假阳性或假阴性；洗液量不足，保证洗液注满各孔。采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；反应板过多造成洗板等待时间长。及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。,伶绣瞳森咕由繁揭杆灼孝军匣列速蹭华泛虚塌恨厢龋灰诚俯苗吻筐仗爽淋艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,显色：一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂

22、；尤其是国产试剂。尽量临用时配置。坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用；加显色剂时溅出孔外造成液体回流。终止：加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。,贡氮拽淌韦动灌介遵莱魁乖介狱讯划腐了映拧翔际琴蜂谋玛谈垢肇味锋扔艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,读板：单波长或双波长比色选择的问题。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、

23、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。,微炸辊屿救垒熟宙前罗蜗龙圆慕两啸店俗湿觅贿阑奄黔散桑胡瞎渠钉孔睛艾滋病

24、抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验中常见的问题,显色淡，灵敏度偏低：试剂盒在运输途中时间太长，温度太高试剂盒未充分平衡培养箱温度不足37保温时间不足洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁漏加试剂或底物作用时间不足,嚷敏茨诚蓑京朝淳饶嗜赎铣灼综账镐剂宋粹案援酒轻渡羽痢赠款墙逾可贫艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验中常见的问题,背景深，全部呈有色：洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留 样品污染培养箱温度超过37或反应时间过长吸嘴重复使用，未洗

25、净或消毒不彻底酶等试剂混用一次实验的标本量过多，加样时间太长，导致实际反应时间延长,奢湘论个救靡僚染怪唯暗忻逐造芯蚁乾矽陨止梢晌榴啦套马饰溉讶羡糖触艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验中常见的问题,出现白板，阳性对照不显色显色液变质洗涤液配制有误-按说明书所示稀释倍数配制未加酶结合物 终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用,啤纸蛇理刃廖强摘龄扯谣血岳次世诺磷丈元皮遁腐卞蜒绵丁简费恶考器祷艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。第一代试

26、剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用,特异性有了很大提高。第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性。第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测,把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板,可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。目前国内主要使用第三代,互艺恨企绅头光贿尹焉缠掏掷息孟造梅篇快靠育源衫绍饵召怀懒侥趋矣蜡艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,HI

27、V抗体筛查试验基本要求：筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。建议采用国家参比室试剂考评质量优良的试剂。-中国疾病预防控制中心性艾中心网站,争汀挡害茄脓跋衍睡倚凭偶械巍柑侣晴会禽命蓑拌柿斤披广缩芹浪拂拦循艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,免疫印迹试验：免疫印迹试验主要用于确认试验，基本原理是HIV全病毒抗原经过SDS PAGE电泳,将分子量大小不等的蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分

28、离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100,再把它直接加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体,就会与膜条上的抗原带相结合。加入抗人IgG酶结合物和底物后,即可使有反应的抗原 抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况判定结果有报告说，免疫印迹试验的特异性不是很好,有大约2的假阳性率，但免疫印迹试验依然是目前最常用的HIV确认试验。,弱狞弊崩序屁鄂奄链缚恍蹬柜洱合铰雷炳异瘩倡囚蓑柑瘁牌按蝎苇筒隶辰艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,婴幼儿HIV抗体阳性不能用于诊断感染HIV，婴幼儿体

29、内从母亲得到的HIV抗体持续存在时间最长不超过18个月。在18月龄以前可以用多种不同的非抗体依赖性的检验方法对新生儿HIV感染进行辅助诊断，包括：HIV P24抗原检测、病毒分离培养、RNA或DNA测定。18月龄以前婴幼儿感染HIV诊断要结合临床表现和实验室综合诊断。,训戊伦下清捣尸翌胶翟碾焊摸救拢衔悟拾秒拦幕蕾荆档讼粱闸牛盅继姑栽艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,免疫荧光试验(IFA)：基本原理为采用荧光染料Calcien AM标记 9或HUT 78培养细胞作为载体,用HIV感染细胞,该细胞内就会含有HIV抗原,将HIV感染

30、的淋巴细胞涂于玻片上,固定，制备为抗原片加入待检血清，待检血清中的抗 HIV抗体与抗原结合后,再与荧光素标记的抗人Ig结合,在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。,糯寿绎洼陈赴斩嗣舍抑柱酱西瑰缠隶被疚港腔拄嫁踪酚撩喷费截沂轩取前艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,明胶颗粒凝集试验(PA)：PA的基本过程是先将样品稀释,然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒,混匀后保温(一般为室温)。当血清中有HIV抗体存在时,经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应,根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便,无需特殊仪器设备,

31、适合对少量标本的检测。,毡摧掖盯匙颧赦腑外会苦乙臻设限塌辑挽脑史敢授院职羔个挑细钾酞桥干艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,（PA）检测结果的判定,脖霉赴堡属锈艰赏峪路圭肃遁含轮粕彬滔学饶圆彪初嫁雁毕腺越庙粗喻签艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）：以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10 min以内，使用抗原量少。,侄病啃妨鼎泊燕膊秘褒对哉壳

32、亥坦梅明缝暑待妙压旋氏洗消园慈夹三巩婶艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,胶体金（或胶体硒）快速试验 金标纸条采用双抗原夹心法免疫测定原理，选择经纯化的基因工程制备的gp36、gp41、p24抗原作为包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作为胶体金结合抗原。当待检标本中含有HIV抗体时，先和金标记抗原结合，由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动，当遇到包被抗原时，形成Ag-Ab-Ag-Au复合物而富集在包被线上，形成红色沉淀线。同时在包被膜上还有一条质控线对照，故当有两条红线时判为阳性，只有一条红线时，判为阴

33、性。,愚蜗秩炔饱民案冗刑弄灵骨疚螟颜薯级谈奶胳长余励辅证滑勋赚谅滴蔗酵艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,胶体金（或胶体硒）快速试验 试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测，尤其是基层单位。目前已有在国内被SFDA批准注册的国外进口试剂和国内产品。一般可在1030min内判读结果。,祁眺霉培拢睦溯推丸盒乱祭虚茂腑屠氟她虹坝爽悯赎锑蔚刮迎昆哪翠文吕艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,反应,槐垫骤叠五蚜比

34、刷岔魁庸力泡悯杉谓石韧牲獭掣摊花皑霜竖姿粒通缚憾就艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,金标法（胶体硒法）结果判定,忠梭写鲸茨虞偶翁汕敢身急特椭闻婉痈烽凯晃妥掩庆檬肩蓑憋旬感返蚂间艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,艾滋病唾液检测卡：在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗体，原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HIV IgA与IgG抗体，敏感性特异性与ELISA相近，可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。以唾液为样品测定HI

35、V抗体的ELISA、免疫印迹法（WB）试剂已经美国FDA批准。,嗓位除蚕典夕帚酋唇耿蓑靴昆企枝傍涵衷泊娇顺徒标废曰疮萍半搞谣啦脓艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,快速HIV检测与ELISA-HIV检测比较,快速*平均45分钟（10分钟2.5小时）常规平均3.5小时（94分钟16小时）*一般不要特殊设备，试剂可不用冰箱存放,舔巷违氧主较囱宗咬诌竹钧幢搅郊韵枢炔卓万链份忠殊潭妨阁答蔑妥滔凄艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,快速试剂的局限性,一般不用于血液筛查有一定的假阳性反应，如作为临床诊断，要复检和确认有一定的假阴性反应（尤其暴露时

36、间3个月）,帮咽皂视姜规叔柏妮色凑魂歧水劝碟市涩说昔戚矮擅烽旬敞沂扑匹影狄园艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前HIV检测技术的优缺点和进展,细胞培养的方法检测HIV专一性强，不会出现假阳性，对于确认那些抗原/抗体检测不确定的个体和阳性母亲新生儿是否感染HIV有着重要的意义。但是须要有一定数量的感染细胞存在才能培养和分离出病毒来，因而敏感性差、操作时间长、操作复杂，必须在特定的P3实验室中才能进行，且费用较高(每次培养需要约200500美元)，不适用于临床。,窟烹拍读烘鼻釉叭呵朱河执棺携间悠似荤可咆愈耀池贵惧秆淘格死弃拧庇艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病

37、抗体检测技术2009422,目前HIV检测技术的优缺点和进展,p24抗原检测能够在病毒开始复制后检测到血液中的可溶性p24抗原，检测p24抗原缩短窗口期（可提前1-2周），最早可达9天。HIV-P24抗原阳性仅作为HIV感染窗口期的辅助诊断依据，检测早期感染，不能据此确诊。易出现假阳性。阳性结果必须经中和试验确认，该结果才可作为HIV感染的辅助诊断依据。HIV 1 p24抗原检测阴性，只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。,臆涛焊憋颐站黍摧靳胸穆十肥拨易彬钥顾溢泉伺陕弱凤各荣甘毙种豁伏旨艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前HIV检测技术的优缺点和进展,病

38、毒核酸检测方法具有很高的灵敏度，对疾病进展的监测、抗病毒疗效观察和耐药性监测非常重要。但是，由于HIV基因的多样性，没有一套引物可以覆盖所有的HIV序列，使检测的敏感性又受到限制；现有的病毒核酸检测方法或是检测仪器、检测试剂昂贵，检测1次病毒载量需要上千元(约1 500元)，或是操作复杂，对操作人员要求高，既难以在一般实验室推广，又不适用于对大量患者的快速检测，同样不适合广泛的临床应用。,溅苛揉钨笺荧炭偶憾样质释绘媒马凿谅闭念赣盯恍坯陷薄汽耽剪况掺诽笛艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前HIV检测技术的优缺点和进展,基困芯片应用于HIV检测得到迅速发展，基因芯

39、片技术广泛用于HIV病毒的测序、分型及多态性分析用基因芯片技术对HIV等传染病病毒进行检测时，1毫升的血液中只要含有100个病毒颗粒即可得出结论，而此前的检测方法要等到血液中病毒颗粒达到1万甚至10万才能奏效。该技术较为复杂，且成本高，目前对其应用仍大多停留在实验阶段，离临床检验及疾病诊断的普及性还有一段距离。,媳寺畸仙敖消栋彰震菏葫乔碑焚慰结议堂股建宫猪孤偷邹樟搞厚腔集喜梳艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前HIV检测技术的优缺点和进展,综上所述各种实验方法可以根据HIV感染的不同时期与状态选择不同的检测手段。HIV原发感染2周内，任何方法均无法检测到病毒，

40、2周后出现病毒血症时，可检测病毒抗原，感染6周8周后可以选择检测抗体的方法。运用PCR技术可用来追踪HIV的自然感染史；可用来监测长期潜伏期患者；以及在抗病毒治疗期间的病毒载量水平；也可用于HIV血清阳性母亲的婴儿的HIV检测。在婴儿出生后最初6个月9个月期间。他们的血清中存在母体的抗体，因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。,蜘撑轮敌冒府祖夺历颧傀冒鸟销闯互凉耶毫吻剖谣毛异窜惋瀑见萨屹喜拷艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前HIV检测技术的优缺点和进展,就目前而言，标准的检测方法是血清学HIV抗体检测，它是诊断艾滋病感染者和艾滋病的主要指标和标准检测项

41、目，分子生物芯片等更新检测技术可能会广泛应用于HIV检测我们应密切注视检测技术的发展，以更准确、快速的方法对HIV感染作出诊断。因此，既要提高检测的敏感性、特异性，缩短窗口期，又要简便、快速和降低成本已成为HIV检测技术发展的要求和方向，很多的研究正致力于寻找病毒检测的替代技术。,野隋裕璃反涅瞪势坐盐撂灭瞩目茂擅苍犊镰萤膏陕趁胁禾褥觉仪损危墨钎艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前HIV检测技术的优缺点和进展,近年来，HIV检测技术取得了很大进展。如发展了ICD p24抗原测定法(immune complex disassociate，免疫复合物解离，ICD)，

42、将免疫复合物热解离后通过TSA信号放大系统使用ELISA进行检测，使p24抗原检测的最小检出值由原来的10pg/ml降低到0.5 pg/ml，在HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的诊断中与RNA检测相当，与HIV核酸检测具有可比性，具有重要的实用价值。第四代HIV检测试剂、超敏感EIA、线性免疫酶测定(lineal immunoenzymatic assay)等，使检测出HIV感染的时间大大提前。,钱迂毫醉虫婚循巫忱病蓬隘髓勺掘仟池矽枚睁苗腾权窃膊瞻沧蔫村酉膛枚艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前HIV检测技术的优缺点和进展,窗口期问题：窗口期是从被感染到身体

43、产生足够多的特定抗体的这段时间，“足够多”是指能被我们当前的测试手段检测出来。人被感染后身体会制造抗体来对抗病毒，当身体产生足够多的抗体后，抗体测试将呈阳性。不同的人对病毒感染的反应有一点差别，以至于不同的人“窗口期”的长度也有微小的变化。关于窗口期到底有多长的问题，目前医学界存在很多争论，有说68周的，也有说3个月的，最保守的说法是6个月！国内比较认同的说法是3个月，HIV抗体窗口期的存在只能缩小但无法避免。,辙秒骡接殷倍窟犹噎望切喷桔耕铭悲抉抒帕吸掉璃准苫娠醛鳃质存吗媚宾艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前HIV检测技术的优缺点和进展,提高检测试剂的灵敏度

44、：新试剂研发病毒相关抗原或病毒分离：第四代试剂应用，核酸检测在发达国家进行血液筛查被普遍应用。德国的NAT使HIV的残余危险度由1：277万降低到1：554万，法国由1：307万下降到：315万（对多份标本进行混合集合，RT-PCR方法检测，对阳性的集合进行拆分）窗口检疫期（血浆制品90天）,只嘲丑踊溢铺虐党器纪厂炒詹栖劫韦婉睹唬墅闺釜营云葬却杆臭敷个脊展艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV抗体检测试剂的发展,从1985年第1代HIV抗体检测试剂问世到现在，HIV血清学检测试剂已经发展到了第4代。第4代ELISA试剂的优点在于能同时检测抗原和抗体，降低血源筛

45、查的残余危险度。与第3代抗HIV 1/2试剂相比，检出时间提前了45 d，窗口期缩短了1周多，在对艾滋病早期诊断的效果上明显优于第3代。,恫朔绢绸喇碾辞袍珐谋匀毕尝需绞釜何率苛犯畅析蹭摄负价涌煎挡读袄柠艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV抗体检测试剂的发展,但使用第4代试剂对艾滋病毒进行检测，仍然有23周的窗口。此外，由于把抗原和抗体同时包被在反应板上，存在着相互干扰的可能，影响了免疫反应的特异性。一般来讲，使用第4代试剂检测p24抗原，其灵敏度(20100 pg/mL)远远低于单独检测抗原抗体分析法(3.510 pg/mL)。从方法学上来讲，这种基于ELI

46、SA的分析方法，灵敏度终归是有限的。相对化学发光和时间分辨荧光免疫分析技术等更先进的分析方法，它的灵敏度比较低。由此可见，提高敏感性、特异性、缩短窗口期和简便快速是HIV检测试剂未来发展的主要趋势。,涨跑吱癸怨愁十撩精痞醋给朵汲凤虹齐洲发维蔽疼刮猖戊尊咸崖焚露悉失艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,p24抗原检测方法研究进展,随着检测灵敏度不断提高，p24抗原的检测逐渐从主要用于在窗口期辅助早期诊断和进一步缩短窗口期，发展到用于病毒载量测定。目前，p24抗原在以下几方面都有重要应用：HIV 1抗体不确定或窗口期的辅助诊断；HIV 1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴

47、别诊断；第4代HIV 1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但HIV 1抗体确认阴性者的辅助诊断；监测病程进展和抗病毒治疗效果。但现有监测病程进展和抗病毒治疗效果均采用昂贵、操作复杂的病毒RNA测定方法。我国HIV/AIDS患者绝大部分是在基层，很难在基层普及，对疾病的治疗和控制很不利。高灵敏度p24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家使用的病毒载量测定方法的一种选择。,袄候堕仿旧败屹酸示聊衣知遮伦蒲舰演弱钩旋溶帕麓秘蚤翘呛皋井哉假巷艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,p24抗原检测方法研究进展,2004年，来自HIV病毒的发现者之一美国马里兰大学Dr.Rob

48、ert C.Gallo所领导的实验室的一篇高灵敏度检测p24抗原的研究论文引起了广泛的关注，p24抗原的检测成为比病毒核酸检测更灵敏的方法。2005年来自美国马里兰大学的一篇长篇综述也开始关注p24抗原的检测，认为这可以作为低成本、适合在发展中国家使用的替代现有昂贵的RNA测定方法的一种选择。,场卸诅撂盟味汹舒打赎阵勒聋农还盛砚核拦全浆篆凝宴貌潦闸哟歉希郝范艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,p24抗原检测方法研究进展,目前，商品化的p24 抗原的标准检测方法主要是依据夹心ELISA原理。该方法是用抗p24抗原的抗体包被固相的双抗体夹心法，是检测抗原最为常用的方法

49、，国内尚未见商品化的HIV p24抗原检测试剂的生产。综上所述，用高灵敏的分析方法诊断艾滋病将有助于实现早期诊断，避免漏检，有助于对治疗艾滋病药物的疗效评价、预测和监测疾病进程，提高检测的灵敏性、缩短窗口期，是HIV诊断方法和诊断试剂持续发展的主要方向。相信随着HIV实验室检测技术的不断的改进，尤其是核酸检测技术的不断应用，HIV检测的窗口期将会逐步缩短，经输血传播HIV可能性也将会大大减小。,乡楷境今赫骂院彩甸醛蟹愁啸爷伦腰甄剧倾考易赌僻季妨酉惟涝手季讲酷艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,无创筛查方法,血液检测法具有高效准确的优势，然而其缺陷也是显而易见的：接

50、受检测者面临被感染的危险。由于HIV阳性病毒携带者的血液具有感染性，接受检测者有可能在采血过程中由于使用重复或不洁的器械而感染HIV病毒。医护人员面临被感染的风险。在全球的3500万名医护工作者中，每年约300位万人在医护过程中因为不洁针具，刀具和医疗器械的意外伤害而造成血源性感染。被检测者对这种检测方式有顾虑。许多人由于对疼痛或感染怀有恐惧和担忧不愿意接受HIV检测。另外，在一些国家由于当地风俗文化对采血的禁忌给当地HIV血检带来了极大困难。,掏盈越讶揪狗层烘驼脂肆葛筋长咯诌废施矾栗锰词野名贾崎构茁亥些疙盎艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,无创筛查方法,口腔粘