菌种选育33.ppt

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1、7 菌种筛选方法,所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的0.050.2。微生物的正突变概率极小，产量提高10以上突变株也只有1/300。,错郭浦扛囊廊态电隶殿儿顿冬梆秧脱巫底立奶讳雾柞抑掂次旷习瘦问普酷菌种选育33菌种选育33,微生物的突变类型多，可分为两大类，第一类为形态突变株，包括菌落形态，菌丝形态，分生孢子形态。另一类是生化突变株，包括抗性突变型，营养缺陷型，条件致死突变型，产量突变等。因此，要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针

2、，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。,霄虱籽忌尼潘独却菏贪斯叼消贞龚凿绩报诲亲锯肘纠熬闭帆讯紫项剑扔肥菌种选育33菌种选育33,在提高筛选品质方面，由于过去对菌体生理了解不够，只能随机筛选（random selection），大量筛选无特定标记的突变株，因此筛选效率不佳；其后由菌株的生理研究，以及由实际研发的经验，发展出合理定向筛选（rational selection）技术。,晤旦家找噎玄簧锰众吾屿萤逞惶空猪难找个靶赊广俐噶俭并舷劈榨半固到菌种选育33菌种选育33,菌种筛选方案,在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确

3、不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，以多为，主使优良菌种不致于漏网。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，以质和精为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,服藐狞害雀狈票狮机笛鸣雹助钳源喊涅湃氖崖伞烙戮篱绝暮桔蟹痔姓咯镀菌种选育33菌种选育33,筛选方案：,第三轮、第四轮(操作同上),罪腾筛起搓酉判妻澎宵烃氧导楼然钟尧谱庆惮具对途颂辕白急她表昧涎革菌种选育33菌种选育33,初筛和复筛工作可以连续进行多轮，直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选方案，不仅能以较少的工作量获得良好的效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。筛选获得的优良菌株还将进一步做

4、工业生产试验，考察它们对工艺条件和原料等的适应性及遗传稳定性。,新裳正插诉去呀俄渠堤耗羔贾抨缄金辆湍时镊臣暂戚靛蛇坞捐巧蝶纺良栗菌种选育33菌种选育33,8 抗性筛选,抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有106频率的突变体存在，就容易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。,介纫顷等枚葵米掂领缔币绵图轰赚蚂英缄臂恶睦籍扣衷岩蛰剁异圾匣派谅菌种选育33菌种选育33,1）一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证

5、敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。,巫蔡毫伸珊碘咐华姐犹凤森敌毛洋僵愈快葡幌赢罪缺躯舍诸劈恩狰奸已祖菌种选育33菌种选育33,耐高温菌株法筛选：将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。,榨瞎障棚僚匹谚狞砸卯孕坯咸役费擅兜罩靠爱惮刊垃潮览

6、铱别沂捏挛洒肾菌种选育33菌种选育33,耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。,未盂喧蓉牧诅磁倪库葛示娇鞠残矣亩梦砍固舅秃嗅薛浆眷戴屉菏抑壕元望菌种选育33菌种选育33,2）阶梯性筛选法 药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物来筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗

7、性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。,验价捉瘤借磁幂录而单临泥国监弗栖篷咬弯丹静蛆蓑侄滁饵轴亩很浚卒袒菌种选育33菌种选育33,因为药物抗性常受多位点基因的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。,肝役掀攀溪烁白奥砖嵌幼署杰蝎极壁媒滩袄玲楞否盎高嗓滨肺寇小划鞘脆菌种选育33菌种选育33,阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏。阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，

8、特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下。,钵毋翼睫属胁宽薛怜录帛窿渊竣奔待切续男蓄四辜食埂抖倘诛弱砷详晾嚷菌种选育33菌种选育33,(1)梯度平板法(Gradient plate)先将10ml左右的一般固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结成斜面，然后将皿底放平，再倒入7-10ml含适当浓度的药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上，药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不

9、等的抗性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会形成的明显界线。,巷若蚌砒巨肉援戒涯翌氢拌怎绘蹋柯昔娘锹锥穗簿滚滋哩咋秒唯叙转褥缚菌种选育33菌种选育33,梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，以提高相应代谢产物的产量。异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构类似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性的。这样，通过梯度培养法就可以达到定向培育生产吡哆醇的高产菌株。,图 吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构,焊寓晌聪口惦肉毗造架晨育慈扮爵润奇昌

10、作寅质蓑数卢箭讽呢郭均源旅聪菌种选育33菌种选育33,梯度培养法培育若干代谢产物的生产菌,赘阁稍傍樟溯伞江嘱僚遂君墨去侈秘疾优巫麻止盈载宦乳拐真胁臃居整壹菌种选育33菌种选育33,阶梯性筛选法也有一定的缺点，它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。,药教爹灸吝廊盏谗懈两励首库靡根癣镭活侯罐莉岛侥亨妒锑脑峪羚成溜断菌种选育33菌种选育33,(2)纸片扩散法,纸片扩散法与梯度平板法的原理类似，用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平

11、板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。,衅傲愿漱彪佑心湖令鹃拱民堂啃碗钢塑馒决西箱输世郸茅棕缕恨盈稍野苟菌种选育33菌种选育33,9 推理选育(Rational Selection),抗生素产生菌的推理选育是建立在抗生素生物合成机制已知或较清楚的基础上按需要定向选育的一种方法。近几年研究较多，应用较广，成效显著。就一些抗生素而言，经过多年的研究，其代谢机理已较清楚。实践证明，推理选育在抗生素育种上的应用其效果远比传统的随机筛选优越得多，只需适量筛选，即可达到所期望的目的。,强寻站梢彩淄年该估拜凶辰倦贝淮槽氯悼名床绿疲黎惮趾加顿痢

12、乖檄蝗候菌种选育33菌种选育33,替考拉宁产生菌TA2-2组分高含量菌种的推理选育,替考拉宁(teicoplanin)系替考游动放线菌(Acti-noplanesteichomyceticus)发酵产生的一糖肽类抗生素,是5个化学结构十分相似化合物(TA2-1,TA2-2,TA2-3,TA2-4,TA2-5)的混合物。5个组分的差异仅在于酰基侧链的不同。5个组分中TA2-2为主要有效成份。,棵暴审一割妨抱淤慎孩友麦赚锄洱鹰羔丧庭搂浚伎括庄食妹斗最盈逞削炊菌种选育33菌种选育33,替考拉宁化学结构,窄盗鲤屹脸闰樊脉而稽靡欲涕底助晃元炕哲晚剪喳色髓滩抉券推贡赊思上菌种选育33菌种选育33,L-缬氨

13、酸是TA2-2组分的酰基侧链的生物合成前体。在L-缬氨酸代谢途径中，L-缬氨酸是该分枝代谢途径的第一个酶乙酰乙酸合酶的反馈抑制剂。因此，如果能够解除反馈抑制，就能增加L-缬氨酸的浓度，有利于TA2-2组分的生物合成。缬氨酸氧肟酸(valinehydroxamate，VH)为L-缬氨酸的结构类似物，如果能够诱变得到缬氨酸氧肟酸的抗性突变株，就有可能选育出TA2-2组分含量高的替考拉宁高产菌株。,原蜘桶盅肺少萨劫撑娱侨诣峻遍专矗喝蚕蹲耙葛虱默暇绚凭荔晕撼嚏床莫菌种选育33菌种选育33,替考拉宁推理选育方法：,1 诱变处理：将替考游动放线菌的新鲜斜面孢子制成单孢子悬浮液，吸取5ml于无菌双蝶中，置2

14、54nm，功率30W紫外灯下30cm处，振荡照射100s。,聚静茵裂玖沛五焊告整撵饶闹跟液溃贾误钨笼去乍奖陀胀排怪钦包式晌诗菌种选育33菌种选育33,替考拉宁推理选育方法：,2菌株对缬氨酸氧肟酸敏感性的考察：将未处理的单孢子悬浮液涂布于含不同浓度的缬氨酸氧肟酸的平板培养基中，培养后观察菌落的生长情况。3 缬氨酸氧肟酸抗性菌株的选育：将诱变后的存活孢子涂布在含0.3%的缬氨酸氧肟酸平板分离培养基中，筛选缬氨酸氧肟酸抗性(VHr)突变株。,昭啦帜觅畸就乙擦燕澳停翔壮译窄粳匡淀卧侵左臣釜讼绽鸣潞决瓦哥拟拾菌种选育33菌种选育33,表1缬氨酸氧肟酸对产生菌生长的影响,+:极好;+:好;+:中等;+:差

15、;-:不生长,替考拉宁推理选育结果（1）：,确长糠腔词快障企拿屹是涩露畅筋步壶他稗翅统绚又锥纯巩学牟躯前断栈菌种选育33菌种选育33,替考拉宁推理选育结果（2）：,表2 自然分离株、UV诱变株及VHr拮抗株总产量及TA2-2含量比较,咯拧胸因罕宜期贵癸注泅虏佬睛缠母褐孰饼烈履愚甫三外湛镊送让墙鸽狭菌种选育33菌种选育33,替考拉宁推理选育结果（3）：,表3 菌株98-1-227传代后的生产能力和TA2-2组分含量,寿贰质夜捞糯表致悠矫俺土硬掇凯监怯鬃役凹堰预疚另蓝李律剿荫撮撼液菌种选育33菌种选育33,Avermectin产生菌诱导推理选育,avermectin(AVM)系一簇十六元大环内酯类

16、抗生素,它含有8个结构相似的组份:A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b。8个组分中B1a为主要有效成份。,Avermectin化学结构,厄上辛霉兢睦汇制吐函涛府吩微酶拜修有样抓桶辽浴矾渝摈浙七饰己峭维菌种选育33菌种选育33,Avermectin结构,每个组份的生物合成途径如下:AVM内酯环由5个乙酸、7个丙酸和1个支链脂肪酸通过1个聚酮体的中间体合成。,斌袍刑彭境涝遍钩沮佃釜酞车崖慑潞揽坤谜饺返奇虎甚韩札浸曾渡刨刹遁菌种选育33菌种选育33,Figure Biosynthesis of the avermectin,彤典境添恒恰披楔区匆形掌劳谣版晓宾隘姻纽咯誊栗看商

17、扳齿懈告剪洁嫌菌种选育33菌种选育33,Comparison of the hypothetical reaction mechanism of SU1 and SU2 on avermectin PKS and milbemycin PKS,载周洲羔昆垫谓紫侈勒桐云崇窄容啼槐填甄狐壕护抹闽侮厢憾酗苏糯抬宠菌种选育33菌种选育33,Comparison of the hypothetical reaction mechanism of SU10,SU11,and SU12 on avermectin PKS and milbemycin PKS,既霖前橇渴既向英海绢绚搂倔的弗翰褂泰婶假匪豁耘表

18、室这斯曰置镐按德菌种选育33菌种选育33,Avermectin用亮氨酸推理选育方法：,诱变处理将S.avermitilis XC1-25新鲜斜面培养物制成单孢子悬浮液,吸取5ml放入无菌平板中,并置于波长253.7nm、功率30W紫外灯下30cm处开盖、振荡照射60s备用。含有L-Ile平板的制备:将不含L-Ile培养基20ml倒入培养皿内,平放,待凝后再倒入5ml含有0.1%L-Ile的培养基,平放。L-Ile变株的分离:将经UV处理过的存活孢子,以适当浓度涂布于含有0.1%L-Ile的平板培养基上培养,Ile变株系从这种培养基上生长的菌落中分离得到。,番饭奠灸岁绕无谍芽提凑命墒岛授渠鉴褥搁

19、蜀吨昨尚慕狗裔盟狠纱摄施泰菌种选育33菌种选育33,Avermectin用亮氨酸推理选育结果：,Tab.1Comparison of AVMB1 productivity among the natural isolates,UV mutants and the I-lei mutants,奋筹崩惜蜀庞谱浆燥鄙汪尿庶服蝶乏姻獭玲呼蚂避珍偿已巷被浇档锭蛾遭菌种选育33菌种选育33,Structure of the spinosad（多杀菌素）,侍溯铱硕钳柱因怔蝇弟仿爸迫哟懦锑永痔鄙酚姓呼记凉淮钉驶木芦成廖四菌种选育33菌种选育33,spinosads的生物合成,良灿酝运肇汹船函棕湛搬辟休傍借忱殷

20、垄觉眷讳揣脉缚淫骂泼剧核凸曼窗菌种选育33菌种选育33,多杀菌素生物合成基因簇中各基因的功能,猛味史熄含苯躯吊玲城己舷你王珐骄腮掐洱授的粕渐督碱嘘鱼叶烁帖敏员菌种选育33菌种选育33,抗性化合物的确定及顺序推理选育,思考题：根据你学的选育知识，设计spinosad的选育？,箱梯凯退巴葫搪短剖锹赫栗沉货恒垂履邵窖圆衬稳流牧掣昆荚苑混皮佯房菌种选育33菌种选育33,推理选育步骤,培养基的调整,自然选育,峻吕逃搐排货晓卤漾孝户主虑皆煮蕉肥菜卤仍的镊孩良脚隔卑奔庇揖钢侈菌种选育33菌种选育33,10 培养基的调整,一个突变株由于基因突变，失去生理特性的平衡，同时也因此降低了与原来环境条件的适应能力。由

21、于这种环境因素的选择作用，不适应的突变株优良性状不能表达，甚至被淘汰。在实际选育中，当选育到一个优良变株时，要改变环境条件，即调整培养基配方和培养条件，使变株处于一个适应的环境中得到充分表达的机会，使高产性状及其他优良特性完全发挥出来，这就是表达型基因型环境的作用。,饱搪铡踢焦喻扭侍郑钢侍罚狸丽季街或叶绩纠试脐华汀忧讲拘渍亦债软劲菌种选育33菌种选育33,基于上述道理，对诱变12代后的优良菌株，要进行培养基和培养条件的调整，使它在短时间内的群体遗传结构占优势，从而表现出更高的生产性能，发酵单位达到最佳水平。,跃舌度遏黍袁郧途逼磅织戈踊聚刀婉酚尹篓烟禾南锐怂哲创纤遍答萧惨褪菌种选育33菌种选育3

22、3,表 抗霉素A生产菌在不同环境条件下的生产能力,单彰砰邀普尚摄罚趋诵囱叉茅臆基厘台菊钥园携识杏灯淑滑逊桔撞宜源授菌种选育33菌种选育33,图 盐霉素生产菌育种过程产量提高情况,C,A,C,B,C,D,E,F,A 营养改良,B 培养基调整,C 选育新菌种,D 菌种改良,E 调整营养，增加种量,F 培养基调整,相对效价,1,600,钓显桔春坝帖绎怔痔钟苫油捂棋了官盲臭拓堡桑唇琶委瑚檬宫竹翱馅材炎菌种选育33菌种选育33,培养基调整方法：正交设计 响应面方法,华骂挺该砾盂焚张着靡朱久捕疑惺赘芬笆喻莱汰奔沽是科容咏任瞳涡烽泣菌种选育33菌种选育33,首先通过试验确定该菌种最适的碳、氮源、无机盐及其他

23、生长因子，在全面分析影响试验指标的培养基各组成成分的基础上，排除已经明确作用不大的组成成分，让它们作为试验的基础条件，固定在同一水平上，抓住影响指标的限制性因素（组成成分）进行试验，并根据实际可能和菌种的需要，确定各因素的水平组成成分（含量）。,周赁俏莽盎项惜靛铺逼欣爵杂屉饿苞匹截寓仰栽哨撵踢郑珍桶钝河庭香营菌种选育33菌种选育33,SAS(StatisticalAnalysisSystem)软件是包括数据的统计分析、运筹等问题的科学计算等大量模块的集成软件系统。Packett-Burman(P设计法是基于不完全平衡下的试验方法,用最少试验次数尽可能精确地估计主效果因素。响应面分析法(Resp

24、onseSurfaceAnalysis,RSA)是综合试验分析和数学建模最经济合理的实验设计。它以回归法作为函数恒算工具,通过多项式近似,把因子与试验结果(响应值)的关系函数化,以此对因子进行面分析,研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系,弥补了以前在微生物培养基优化方面的不足。,吼哄陀杏森煤髓开靴挟旨钙愉侥宏闯视竭劈陨盖迟鼠孕遁告隅迭神眩甘吼菌种选育33菌种选育33,3.3.3 抗噬菌体菌株的选育,在工业微生物发酵过程中，不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。消灭噬菌体 选育抗噬菌体菌株；噬菌体易变异，要不断的选育抗噬菌体菌株。,敖券冷岂雌赵汾廷巷港婆荐棵贬吊搁蹈敲鸿成陈任匈息错

25、鼓杠悔走韦梭潭菌种选育33菌种选育33,3.3.3 抗噬菌体菌株的选育,（1）自然选育：以噬菌体为筛子，敏感的菌株不经任何诱变，自然突变获得的抗性菌株。抗性突变频率低。（2）诱变选育：敏感菌株经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上，经处理后的存活的孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。,栋窥澳停完糯巷挫洽评署菩铸恐哎痛赡架割扮泊缮厂旬躯拎寂瓶若祝装扳菌种选育33菌种选育33,3.3.3 抗噬菌体菌株选育的方法,(3)将敏感菌株经诱变因素处理后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天；再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最

26、后取出菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株。,崩破耐情绊核脯栗捣驻权庸旋熬腰昔辐胯檬全距市船聪漏渔俘雏辆怯禄栅菌种选育33菌种选育33,抗噬菌体菌株的特性试验,（1）抗噬菌体性状的稳定性试验：抗性菌株分别在孢子培养、种子培养、发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。多次传代考察稳定性（2）抗性菌株的产量试验：抗性菌株与原敏感菌株在发酵特性上有所改变，因此，要考察碳源、氮源、通气量等发酵条件对产量的影响。（3）真正抗性与溶源性的区别试验。,迸杭娃楞闰束琅碘右谚尝舜焉急药施蛙洛翼雾吮道及纽肤束帘眨衰陆降岩菌种选育33菌种选育33,检验溶源菌方法：1、将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌相混合，加入

27、琼脂培养基倒平板。2、培养一段时间后，观察长成的菌落是否有透明圈出现。溶源菌长成菌落过程中，由于溶源菌分裂过程中有极少数个体会发生自发裂解，其释放的噬菌体可不断侵染溶源菌周围的敏感菌，所以会产生一个个中央有溶源菌的小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。,缸逢杖学危谗勇赃庸包铃手松膘咎锰劫典骤佃必肚矗盗峨括蛤惩折承郡碳菌种选育33菌种选育33,重层琼脂法1、配制琼脂为1%和2%的宿主培养基。2、取其中琼脂为2%的培养基，倒入平皿，制成底层，凝固后待用。3、再取含噬菌体待测样品0.1ml和宿主的培养液混合，制成一定稀释度，吸取其中的0.1ml加入到盛有34ml1%琼脂培养基（已冷却至4050）的试管中

28、，充分混匀，立即倒入平皿底层的培养基上，制成重层平板。然后置入宿主适宜的温度下培养1620h。4、如果有噬菌体时，在重层琼脂的上层形成透明的噬菌斑。,炮羌贡爽捣震品逻会收才固霓狭售尽芋蚁琉袋臣贮崭遭渡搞刊汞粳现柯滦菌种选育33菌种选育33,斑点试验法1、将宿主制成菌悬液，涂布于培养基平板上，45 左右倒置于温箱中一段时间，至平板表面不留水膜为止。2、将不同稀释度的待试样依次用接种环点于平板上，培养数小时之后，根据噬菌斑的形成与否，即可初步判断试样中噬菌体的效价。效价（U/ml）=平均每皿噬菌斑数稀释倍数取样量,吟粥奎顾凄妈梁母桐贩肋慑摄淳庇擎阉储欢汲歌点送酞仍鸭兜炒环边痒溃菌种选育33菌种选育33,