葡萄糖苷酶催化合成红景天苷.ppt

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1、-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,置紊释济迪反班屠破跑秩截旨桩漂母坍澄官低溜贮沟性比访纫陀卑旅茂旋葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,1、研究背景2、论文创新点3、结果与讨论4、主要结论与建议,柞民歉殆骇樊侣炬率串之沙乐娄店谆饼谆望珠挤从截侧绣婴边梆蓟立肖型葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,1、研究背景,红景天苷是中药红景天中的主要有效成分，在抗缺氧、抗疲劳、抗心肌缺血、提高机体免疫力等方面具有显著效果。目前红景天苷来源有植物来源、化学法合成和酶法合成（图1）三种。2004年，Tong等利用苹果籽粉-葡萄糖苷酶以酪醇和葡萄糖为底物首次进行了合成，反应完成后红景

2、天苷浓度可达11.8g/L；此后，Yu 在叔丁醇体系中实现了1.9 g/L/d的时空产率；王梦亮在缓冲溶液-叔丁醇体系中反应50 h后产物浓度达到6.0 g/L；刘璘等人在水-1,2-二乙酰氧基乙烷体系中产物浓度达到了12.4 g/L。,图1 酶催化糖基化合成红景天苷,掺次喀把寐墟豹杨藐骨欲好之咨您只垒绿仑荤膛凄押写鳞蘑锨谦如亩舱仔葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,2、论文创新点,（1）对来源于苦杏仁中的-葡萄糖苷酶在含离子液体体系中的酶学性质进行相关研究，有关研究未见报道。（2）对在离子液体-有机溶剂混合反应介质中-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷的研究尚未见相关报道。,吭寂膳

3、觉孟讼雷裴疥棒龙芒甭唁肠税浚患秩钎痕沤泰踏割约弄瓷布交栖猩葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3、结果与讨论,1、含离子液体介质中酶学性质研究2、离子液体-有机溶剂-缓冲溶液体系中酶法催化 合成红景天苷,幸茨欢亡耕褥啦贱呻酶杜然则惯臣密歇贸拙牺楚持媒绑酌设抵喝宇氯爪仰葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.1 含离子液体介质中的酶学性质,酶在不同反应介质中的活力往往具有显著差异。通过调节离子液体的阴阳离子组成、极性和浓度等可以改变酶的活力。目前，对糖苷酶在离子液体中酶学性质的研究尚处于起步阶段。研究含离子液体反应介质中-葡萄糖苷酶水解对硝基苯基-D葡萄糖苷（

4、pNPG）的反应特性，以期为酶催化合成糖苷的研究提供理论指导。,慢准霜志毙栋互羡衣殊叔姆学化永祝恫诚尖肤揽誊阔答憋戚凯烘苗蜜许菱葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.1.1 缓冲溶液体系中的酶学性质,缓冲溶液pH和反应温度的影响,图2 缓冲溶液pH值对-葡萄糖苷酶活力的影响,图3 缓冲溶液中温度对-葡萄糖苷酶活力的影响,6.0,50,沫撰纸集堕焕膀彦账触温嗓章罢钢迟樱春础渝那蜜吟挖早事伺寨名坟昏肇葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质,离子液体种类和含量对酶活力的影响,图4 离子液体种类及含量对-葡萄糖苷酶活力的影响,肃

5、笼驼腮破琶英发善赏凿韵滁席薪凌卖毡面衣靛屑抑何媳瞩赐它矽娱咸锤葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质,不同含量离子液体中反应温度对酶活力的影响,图5 不同含量离子液体中温度对-葡萄糖苷酶活力的影响,50,珠誉场鹏偶奖在梢探枯揭漱氟烙血凄日僵驶篱骚卷笛舶济参惩允歹檄恰鄙葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质,含离子液体介质中pH对酶活力的影响,图6 离子液体-缓冲溶液中pH值对-葡萄糖苷酶酶活力的影响,6.0,踢坡辉胰淤昂讹裔臃刮暴黔属卒煤奋冰惩浙予霓俏螺换鲍孤险儡采唐篇折葡萄糖苷酶催化合

6、成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质,离子液体对酶热稳定性的影响,图7 离子液体-缓冲溶液中-葡萄糖苷酶的热稳定性,滥勾团筒咎茁墨恕氢棠鳖椅盘姥巴菲帖波括呸骏准疲贷吾序空秦溺屎状肤葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质,动力学参数测定,图 8-葡萄糖苷酶在缓冲溶液和60%C2MImBF4中的酶促动力学曲线,通过Lineweaver-Burk作图法可计算得到酶在纯缓冲溶液中的Vmax为25.1umolmin-1mg-1，Km为3.55mmolL-1；而在含离子液体的反应体系中Vmax为3.55umolm

7、in-1mg-1，Km值为5.52mmolL-1。,鹤试必妊锭座言匝绞尉士隘咎妻篮石要炳咀园郴叹瀑吸询沼买根菩纷冰大葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质,由以上数据可得，在含离子液体的反应介质中酶催化水解pNPG的Km值变大，这可能是由于离子液体的加入增强了酶分子活性中心的刚性结构，致使酶与底物的“诱导契合”效应减弱，进而增大了反应所需要的底物浓度，导致在含离子液体反应介质中的Km值变大，Vmax值变小。,筐存镊甸刨古茹情特泄江獭营硫靠诞凤凿芒馒鞍榜深今郧沂叼殴惮仪没敬葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体

8、-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷,（图1）显示，在传统水相中合成红景天苷因受水解-糖基化反应热力学平衡的限制而导致糖苷产物浓度较低。以传统非水有机溶剂为反应介质是近几年酶催化生物合成的研究热点，但非水有机溶剂中存在以下困难：（1）-葡萄糖苷酶、底物、产物均易溶于水，难溶于有机溶剂；（2）在极性有机溶剂中，酶的溶解性、活性和稳定性差；（3）高浓度葡萄糖对酶具有抑制作用，且容易生成二糖。因此，选择适当的反应介质实现在同一个反应体系中协调以上困难之处，是实现高效率合成的关键。与传统有机溶剂及电解质相比，离子液体具有一系列的突出优点，而离子液体的可设计性使离子液体成为非常规反应介质的

9、优秀候选者。,篓搁向烩刁翰答睛巫筑箩袄嫁锹顶龄响空日菠幢脊抢导坞肾侥碗豺颅基浓葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷,离子液体种类对糖基化反应的影响,图9 离子液体种类对酶催化糖基化反应的影响,Note：1-control；2-C1MImMeSO4；3-C2MImBF4；4-C4MImBF4；5-C6MImBF4；6-C4MImPF6；7-C6MImPF6；,劣烤蚂链啮蛹剧忘幕饶烙壳藏苗厨伟煞靴疹漾旧可乃谰次取桨属二后坚醋葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混

10、合体系中酶法催化合成红景天苷,有机溶剂种类对糖基化反应的影响,图10 有机溶剂种类对酶催化糖基化反应的影响Note：1-control；2-叔丁醇(log P=0.37，粘度：3.316mPa.s，30)；3-1,4-二氧六环(log P=-1.1，粘度：1.3 mPa.s，20)；4-二甲基亚砜(log P=-1.3，粘度：2.20 mPa.s，20)；5-二甲基甲酰胺(log P=-1.0，粘度：0.8 mPa.s，25)；6-四氢呋喃(log P=0.49，粘度：0.55 mPa.s，20),躲虱这贬罗包碟再栋邵肩淹气御弃蛇碱弘谢咳柳培滇未侈坍蚕呵硬掐歇葱葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖

11、苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷,离子液体和有机溶剂体积比,图11 离子液体/1,4-二氧六环体积比对酶催化糖基化反应的影响,1:4,甭示双萧洗纺腐紧丰姻何阮乞咱推攘肖赎鄙狞翼抉俭蜂亦协勾乖物晤副赌葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷,缓冲溶液含量对糖基化反应的影响,图12 缓冲溶液含量对酶催化糖基化反应的影响,15%,秋瓢脑益遏彩存泥食桅峭蹿溪安蒜吾漱和激附效至俄立建丁廓汐旺酒胚蔡葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体-有

12、机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷,反应温度对糖基化反应的影响,图13 温度对酶催化糖基化反应的影响,50,疵汐茫拒资剐蔫慢省屹盆徽樊吐薯席把戈笨沤桃兵壹赛门脱型悦扯岳弧职葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷,底物浓度对糖基化反应的影响,图14 底物浓度对酶催化糖基化反应的影响,220g/L,100g/L,栓宁培至略樱土琐砰液补接锐遂砍般乞龟馅令疗惫囚社泞涎碘呈望苦桩蘸葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷,金属离子种

13、类和浓度对糖基化反应的影响,图15 金属离子种类酶催化 糖基化反应的影响,图16 Mg2+浓度酶催化糖基化反应的影响,5mmol/L,疟埋歹戴饯燕俯咒根耗姥乞响岔硅押麻颓狸奢芋帆仪馆班楼诱尧荣布呀俗葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷,传质效率对糖基化反应的影响,图17 振荡速率酶催化糖基化反应的影响,275rpm,钢甘驹簧慧靡剿澳乔性魂旷凿项塘腺焚蛹冯惶浚位忱税氢淌卯簧房跑翁贴葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷,糖基化反应动

14、力学参数测定,图18 不同反应介质中动力学参数,通过Lineweaver-Burk作图法可计算得到酶在含15%缓冲溶液的1,4-二氧六环中的Vmax为1.50 molh-1mg-1，Km为0.31 molL-1，KI为1.16 molL-1；而在含15%缓冲溶液和含17%C4MImPF6 的1,4-二氧六环反应介质中Vmax为2.03molh-1mg-1，Km值为0.45 molL-1，KI为0.17 molL-1。,阳芥其冯戳逗蔼兄臂梗闪搐纪打哼索柬脸佐润镍蒋注扩柠钱贯嘉暇括瓤潘葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红

15、景天苷,以上现象可能与底物的去溶剂化和过渡态稳定化的能量有关。由于离子液体的存在，可能导致反应介质中的水活度低于含缓冲溶液的1,4-二氧六环中的水活度，因而极性底物D-(+)-葡萄糖在后者的基态能量更低，从而引起反应的活化能垒提高，最大反应速率Vmax下降，且反应底物与酶结合能力的Km也下降，底物抑制常数KI上升，导致临界底物抑制浓度下降。除此之外，该现象还可能与底物的扩散性、酶结构的变化及酶的构象可塑性的变化等因素也有关系。,煞执售仟奥你苞苯并炯苍僳柠类挠翰眶溺渤留课掉顿骂韩摆址开瓶提个翘葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法

16、催化合成红景天苷,糖基化反应的时间进程,图19 酶催化糖基化反应的时间进程,120h,晨棘陆贵峭宰离迈秘狼泡赴那峰面饰葬橡涣钧噎毕诫髓与港谋账串去囱匡葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,4、主要结论,1、含离子液体反应介质中，-葡萄糖苷酶的最适反应温度为50，pH值为6.0，离子液体的加入在一定程度上增加了该酶的热稳定性能；2、通过Lineweaver-Burk作图法得到酶在纯缓冲溶液中的Vmax为25.1umolmin-1mg-1，Km为3.55mmolL-1；而在含60%离子液体的反应体系中Vmax为3.55umolmin-1mg-1，Km值为5.52mmolL-1。由此

17、可见，离子液体的加入对酶与底物的缔合造成了一定的阻碍作用，减慢了水解反应速率。,仙虽百犬甘牌孺唁躺意纽租屠童涂衣统缩袋魏阀捆捎衙荐结梳绘六总宜吏葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,4、主要结论,3、-葡萄糖苷酶催化D-(+)-葡萄糖和对羟基苯乙醇合成红景天苷的反应介质最佳组成为离子液体C4MImPF6的含量为17%，柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液含量为15%，有机溶剂1，4-二氧六环含量为68%。在pH值6.0、振荡速率为275rpm、底物葡萄糖和对羟基苯乙醇浓度分别为100g/L和220g/L、金属Mg2+浓度为5mmol/L条件下，反应120h后。红景天苷最大浓度可达到18.9g/L；4、通过Lineweaver-Burk作图法可计算得到酶在含15%缓冲溶液的1,4-二氧六环中的Vmax为1.50 molh-1mg-1，Km为0.31 molL-1，KI为1.16 molL-1；而在含15%缓冲溶液和含17%C4MImPF6的1,4-二氧六环反应介质中Vmax为2.03molh-1mg-1，Km值为0.45 molL-1，KI为0.17 molL-1。,潜扇兵晴首耐树创拿杨装甩扎卤专梨市滤忧侥甲皑讽骋验断茸尤秘末萌巫葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷,