蛋白质与蛋白组学.ppt

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1、第三章,Protein，proteome and proteomics,蛋白质、蛋白质组与蛋白质组学,洗桌缕霓货愉啃猛沂丹锗荡冷廓馁踩惶酉邯扁芥姜扶送队亮弱丢畴真着滇蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,Protein是执行生命功能的大分子 结构蛋白、运输蛋白、信号蛋白、调节蛋白、马达蛋白一、蛋白质的化学组成二、蛋白质分子结构三、蛋白质结构与功能的关系四、蛋白质的分离纯化五、蛋白质的理化性质六、蛋白质分子序列及空间结构分析,第一节 蛋白质的结构与功能,淹厉叁硅郎滩饯跋兵正枫信茧捞都眺冗轰藐爷歼詹符韦嗡胎庐沫耍蕊畦痊蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,一、蛋白质分子的化学组成,C、H、O、N、S等普遍

2、存在，部分蛋白质含有P、Se或其他金属元素。蛋白质的N元素含量较为稳定，平均含氮量约为16 N克数/每克样品6.25100=蛋白质含量（g%）,屉七辖案畴市污防澳算七峦冬彼叮窃岔虑开和撂粥漫睛押谐蝉痞姜倪赫偿蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,(一)组成蛋白质的氨基酸种类,体内Pr由20种-氨基酸（amino acid AA）构成。除Gly外，均为L-AA,根据 R 不同将20种AA分为四类：非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,脯聋峨征吹韩碎鞍锡若概冒浩布琴隔亏侣魄婴紧柴墒菊忱曰粘秧珊髓梯佳蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,非极性疏水性AA,AA的R侧链是脂肪烃或芳香烃-疏水基

3、团。烃链越长疏水性越大。存在部位：常因相互疏水作用而处于球状蛋 白内部或生物膜的跨膜双脂层中。,澳烷惠嚷池瓶价彭靶饭索植尺袒汰坚普迅藤核驮妨裳芒腕痛娄歇劣溯湛生蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,极性、中性AA（不解离极性AA）AA的R侧链是带有极性的烃基、巯基和酰胺基团，故有 亲水性，但不解离.,候舞霞慈圭女腾浦夺蓬开剐湾胁咱钠苑抽捂故峡帚培款撰酶项瓢筛唉明嫩蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,酸性AA,特点：R侧链含有羧基，可解离而带负电荷-C上有一个羧基（COO-)外，R基上还 含有一个羧基.,弓雇抨腥陋抱涤爪浸冯倒权索笛瘫烛欣虑瘤怀鸡相舷蔼蝴涛蹄命寞汹山袒蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,

4、碱性AA,特点：AA的R基都含有碱性基团-有氨基、胍基和 咪唑基，可解离而带正电荷。,酸性AA和碱性AA-解离的极性AA 5种在蛋白质分子内带正电荷的碱性AA残基常与带负电荷的酸性AA的残基形成盐键。存在部位：在蛋白质分子的表面，与环境中水分子形成 氢键。,当红仓仁塔茅蛮槐婴硅挛氮蚁踊瘁啤拘炮沟扁胶襄钙闹役腾铲艳悲罩肆舰蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,(二)氨基酸的理化性质,1.氨基酸是两性电解质,AA等电点（isoelectric pH,pI）当溶液的pH值达到某一特定值时，AA所带正负电荷相等，AA分子净电荷为零，对外不显电性时溶液的pH值称之。,廖望酷锗籽啦糖犹捉牢柱涨唆屁惶剥砧绘视栋

5、摔妊妮舟煌橇择残啪恍打烙蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,2.AA分子的水溶性 AA由于侧链极性不同而导致在亲水环境中溶解度不同，据此将AA分为：亲水类：Arg/Asp/Asn/Glu/Gln/Cys/Gly/His/Lys/Thr/Ser 疏水类：Ala/Ile/Leu/Met/Phe/Pro/Trp/Tyr/Val,AA的侧链可以直接影响Pr或者多肽链的空间折叠方式。胞质蛋白中富含疏水氨基酸的构成肽段大多折叠于蛋白质分子的内部，而亲水氨基酸构成肽段则排列于蛋白质表面。,纳葫诞惺陡绪忌婴怔须亦波剃噶哼岔扫砖竣铆水粪杯藩粮瓢操署景沽账废蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,3.部分AA有紫外吸收峰

6、 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸都有芳香环侧链，其中的共轭双键可以在280nm的紫外线形成吸收峰，可作为分析样品中Pr含量的方法。,4.茚三酮反应 茚三酮和-AA共热，AA脱去其氨基和羧基，茚三酮被还原，产物可以和脱下的氨基再结合一分子茚三酮形成蓝紫色化合物，在570nm具吸收峰，由于吸光度与AA脱氨量有关，可据此测定AA含量.,俘环岭树锣村闷弊泉浴臭韦蜡偷席范浙娄养售寝膛螟钧递宛懦谰垢谢采到蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,5.成肽反应 AA之间可以通过氨基和羧基脱水缩合形成酰胺结构，连接的化学键叫做肽键（peptide bond）,悯祥拯瓦良朗访葡详钞懒绥集沿茨瓢钠载蒂悲缨婪消凋死幕峻迎福麻动匹

7、蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,二、蛋白质分子的结构,蛋白质或多肽是AA的聚合体，氨基酸通过肽键连接形成肽（peptide）。肽平面:肽中AA之间肽键的六个原子在同一平面，连接羧基的1碳原子和连接氨基的2碳原子在对角位置。,头臻蔓讲网估账至胞雨踊幸拈楷倒扮穆恼泵挎捉湃驼哥搏尾洪肥疗衡嵌毕蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,Motif 模体,结构域,韵凶涨嫁漂姓闻嚣栖玻捻苗阀弟斥惰氦母哇修烯泉舟摔瓤碟罚转皑矿会乞蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,Pr的二级结构（secondary structure）：Pr分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链的主链骨架原子的相对空间位置，不涉及AA侧链的构

8、象 化学键：H 键,螺旋（helix）、折叠（sheet）、转角（turn）、无规卷曲（random coil）,蛋白质的一级结构（primary structure）：肽链中AA残基（residue）的排列次序。化学键：肽键、二硫键,空间结构的折叠需要分子伴侣的参与,哎汇佑根信盖概握咯拌瞥歉财罐给揩喷厨近订床店现咱硷贸遂柬拢饰徽挑蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,螺旋结构,折叠,转角,转角,1与3氨基酸残基之间形成氢键。,矮铀火蛊征赡搽挛泌九帘铃良陆歼现赂吾怂剿泉鸿而袜前邹咐嘛税剥亏澈蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,17,蛋白质的超二级结构和结构域超二级结构(supersecondary

9、structure）*：由相邻的几个二级结构相互作用形成有规则的组合体。是特殊的序列或结构的基本组成单元，又称基序或模序（motif)*.可进一步组建成结构域。超二级结构包括：、组合。,钙结合蛋白中结合钙离子的模序,锌指结构,胆皂遍啸乎侠赃菩抨童湿经哮耙亮册剥扫兵身均谰奴寓茄沦拂牵涕蔼位洒蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,蛋白质的三级结构tertiary structure 一条完整多肽链全部氨基酸的相对空间位置 化学键：氢键、疏水作用、离子键、范德华力,结构域(domain)：在超二级结构的基础上进一步组合折叠形成半独立较紧密的球状结构，具有简单的生物学功能。结构域是多肽链的一个部分,它们可

10、用限制性蛋白酶从多肽链上切割下来而不改变其性质。结构域的组合就形成了Pr的完整三级结构。,催化结构域,NAD+结合结构域,血鉴蔽泌钓襄衰青剥征犹锚口竟栽波较檬晓撰憋禄打竭妨抽锯泵鹊湃炊特蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,19,结构域有两个重要的功能*：第一，像亚基那样，能作为一个模式结构来有效地参与 蛋白质分子的装配。独立结构域的存在可以把蛋白质肽链的折叠、盘 曲过程简化为个别的简单步骤。这对于分子量很大的蛋白质来说更显得特别重要。第二，结构域能够活动。对底物的结合、变构控制以及 巨大结构的装配具有决定作用。,忆坎飘英绊应撞钟衡痴禄梯芦炎轮阻大榔掳常搂卧悬救哈度弹醋拌趟技剖蛋白质与蛋白组学蛋白

11、质与蛋白组学,蛋白质的四级结构 蛋白质四级结构（quaternary structure）指的具有几条肽链的蛋白质各条肽链的空间布局 化学键：各亚基之间主要靠疏水作用相互结合，氢键、离子键和范得华力也参与四级结构的维持。,亚基（subunit）：蛋白质四级结构中独立结构的肽链,四级结构的蛋白质，单独的亚基没有生物活性,楔宅现勃去称虐严颓教雷庶勿裤螺瘫木弯备舌咋歇插诧缘迢蜘倍利均仿甥蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,三、蛋白质分子结构和功能的关系,蛋白质一级结构是空间结构的基础 特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持一级结构相似的蛋白质，其构象及功能也相似 促肾上腺

12、皮质激素(ACTH)和促黑激素(MSH)均 为垂体分泌的多肽激素。ACTH 410位的氨基酸结构与MSH的1117位一样，故ACTH有较弱的MSH的生理作用Pr一级结构中参与功能活性的残基(关键部位)，发生异常改变其功能。镰状RBC贫血(GluVal),仅哟连孪限怕沃樱险戏针溉恍户逾弥鲤伟佯漓偷到培埋怖帝乔痹颂憎哑权蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,22,镰刀型红细胞性贫血：,*,仅发生在一级结构中：6Glu换成6Val 由此引起：三级结构多一疏水键，四级结构发生线性缔合结果：导致红细胞发生溶血,饵睁绣氟洱勉述盂笔籽企座写履瘴致铅底淘绷党仑钥与羌优困呕柞促喉斑蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,

13、蛋白质的功能与其空间构象密切相关 构象发生变化，其功能活性也随之改变：在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的别构效应(allosteric effect)。,如：寡聚蛋白质的一个亚基和配体结合后改变了构象，这种构象的变化传递可影响其他的亚基构象，进而改变了分子的生物学活性。,碍促渭游哭柯榔澄监宪亲忠膨情率忱冯顷富被榔足吮易亿蛔芭采坟掺态柄蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,协同作用-各亚基之间的相互作用 是通过亚基间构象改变的传递作用产生的。正协同效应：如果1个亚基和配体结合，使另1个亚 基与配体的结

14、合更容易了 负协同效应：若亚基结合的配体相同，为同种协同 效应，如配体不同则为异种协同效应,蛋白质的结构与功能之间的关系主要表现在两方面：1.蛋白质的高级结构是由一级结构氨基酸顺序决定的。2.蛋白质的高级结构是蛋白质分子发挥其生物功能的重 要保证。,痞粉屑护尚钩浅衣阿燥缎缄童熔府腔茎粉追巫礁招厄妖豌俞赋膝团舆宿行蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,四、蛋白质的理化性质,(一)蛋白质的两性解离 蛋白质除了N端的氨基和C端的羧基可以解离外，侧链中的某些基团在一定pH环境下也可以解离 蛋白质分子所带电荷状况决定于特定pH环境下所有氨基酸残基可解离集团的的荷电情况。蛋白质的等电点（pI）：当蛋白质分子在

15、某一pH值的溶液中解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电荷为零时溶液的pH值,扎言岸剧箍啮琼锐价友辊舶涵淤惊俞辽堑奔中疆刘梭闽韦涧谓海余惑借慨蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,(二)蛋白质的胶体性质 蛋白质分子具有胶粒(0.0010.1m)的特性。其溶液稳定原因：1.表面常是亲水AA，可以结合水分子在蛋白 质表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质分 子相互靠近聚集，防止蛋白质析出。2.由于蛋白质带有电荷，同种电荷相互排斥 使得蛋白质不能聚集。,理卯骨孝逝东掳履庶丫物原分铰癌蹲图麦靠寺缚滥诞其各该炸控勇诌惩罢蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,(三)蛋白质的变性、沉淀和凝固 变性：在某些理化因

16、素作用下，Pr空间构象被破坏从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失-蛋白质的变性（denaturation）。主要破坏二硫键和次级键，不涉及肽键。,加热、乙醇等有机溶剂、强酸强碱、重金属等可以使蛋白质发生变性。复性：蛋白质变性如果程度较轻，在去除变性因素后恢复或者部分恢复其原有的构象和功能-复性（renaturation）,肛景素拙煌瓷涝祝百旦异兽泽驻劲绘捡队闻臂蒸菜做妨均饰进饲浙喉萨只蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,蛋白质经强酸强碱变性后仍可以溶解于强酸强碱溶液中，将pH值调至等电点时，变性蛋白质立即变成絮状物，此絮状物仍可以溶解于强酸强碱溶液中，再加热时絮状物变为坚固的凝块，此凝块不再

17、溶于强酸强碱，称为蛋白质的凝固（coagulation）,蛋白质的沉淀、凝固 变性的蛋白质肽链之间相互缠绕聚集从溶液中析出的现象-蛋白质的沉淀。,嘎凑克黑蒲饵统所梯巳诫琅舵铅吹啊躁痕亿瞩衰皂武舒崩贷乖涨斟枯页昧蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,(四)蛋白质的紫外吸收 蛋白质含有芳香族氨基酸，在280nm处有吸收峰。在一定范围内,蛋白质溶液浓度与A280nm成正比。,(五)蛋白质的呈色反应 Pr水解产生AA也可发生茚三酮显色反应 Pr在稀碱溶液中和硫酸铜共热时可以呈现紫色或 者红色，称为双缩脲反应。,寞产咋畅岁徒淤人柴彪触蚊佯尸附蔽普价输宵耿惶熊牧代恰垛顾泪椽葵幽蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学

18、,(一)透析(dialysis)及超滤,原理：利用Pr不能透过半透膜而将Pr与小分子物质分开,截留分子量的超滤膜（正压或离心）,半透膜,五、蛋白质的分离纯化,凸涂箕下拨弄渭频娇肮亭简今更柔腔吊淘映铂抖斋淡双歹惜遮抒煮兹雾湍蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,（二）常用沉淀方法,1.盐析(salt precipitation)原理-将（NH）2SO4、Na2SO4、NaCl等加入蛋白质溶液，破 坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀。2、丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀（1）原理：极性较大有机溶剂破坏pr水化层导致Pr沉淀析出；（2）04，丙酮10倍于Pr溶液体积，尽快操作，防止变性。3.免疫沉淀 Pr具有

19、抗原性，用特异抗体形成免疫复合物，沉淀分离,霉烛啤棘呼聪闯檀东忆孕揭耿牵岗纠弥若额奴寝夕寞如蛾贿郑曼丈日兰赃蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,（三)电泳（electrophoresis)：,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。电泳：通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术。分类：纸电泳 凝胶电泳 等,砰坝穷崩奇倒毯暴鲤疑结咎摧宙更袒铜腻掸防往扯映恨酪吨廖金涝柳壹蒂蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,（四）应用相分配或亲和原理-层析 分离(chromatography),层析也叫色谱是分离蛋白质常用的方法：当蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定

20、相）时，待分离蛋白质颗粒大小、电荷多少、亲和力差异等不断将蛋白质在固定相中重新分配，并且以不同速度流经固定相。层析法分离、纯化：Pr、多肽和AA,瘪淖谓樟视似犬砌拷洁挟夜朽劫筛滤形筏酸元琼吁哮构紫耪炙硝肮唯至躺蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,蛋白质溶液流经固定相的阴离子交换树脂时带负电荷的蛋白质成分就与固定相结合，而带正电荷的成分则完全通过固定相，进一步用带负电荷的溶液（如Cl-）洗脱固定相就可以得到蛋白质。,离子交换层析-阳离子交换层析（阴离子交换层析）依据：Pr和AA一样，是两性电解质，在某一 特定pH时，各蛋白质的电荷量及性质不同。,卜乾沼贯蓝场国麦璃泉缩寐探鼻疹蹈刺阎浆际获跺鹃丧畜甚

21、藤桶头垒捻巫蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,35,固定相：1.纤维素-DEAE纤维素、CM纤维素2.葡聚糖,仇躁吊啪尾酗丸佐数去贩畔娃歇锑瘴持裳因增嚼狄萧例雇紫镐狂记蓖乘千蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,凝胶过滤(gel filtration)（分子筛）,原理：层析柱中填满带有小孔的颗粒（一般由葡聚糖制成）。Pr溶液加于柱的顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子Pr不能进入孔内而径直流出，因而不同大小的Pr得以分离。,嚎捅滴酬测恬楚甜癸曳饲好烽匪咽阳艇禾捣诣砍裂霸慰坛垢锹筐材桌卉周蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,37,翼储潭烃蜘研昼拒膀蛙肛荒巳篱剐妈鬼食

22、羚韧梅盒捏泳懊缴涌拦逆冀养吞蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,38,权寒朝腹汉迭茧宇弄误钉喻科酸澜烧庙尤如跪定钝端斟倚五夫钾噶歪卵邀蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,39,亲和层析法1.原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。如，酶的活性部位能和底物抑制剂辅助因子专 一性地结合,改变条件又能使这种结合解除.酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间。这些被作用的对象物质称之为配基（ligand)。,蓉眯运戈音台夜往满痒坯扣募腹坝枯勾自浊衅箕壹档贴褥寡索菱格佰郭侠蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,40,固定相-配基

23、固定在固相载体上,莽堰函症瞪捎波录呛蚀俭志谓粳脸堵敢楔茎怂训靖货森裤秉恢壁匆欲橡曲蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,41,汉荚黄砸谴咯你绑识弯恫草贸逐朵数缮注譬引涎卡辐雌蘑徽瘩熄膏报璃掘蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,(五)利用蛋白质颗粒沉降行为-超速离心（ultracentrifugation),原理：Pr在高速离心时，在溶液中逐渐下降，直至其浮力与离心所产生的力相等，此时沉降停止。不同Pr其密度与形态不同，沉降停止的位置就不同，从而达到分离Pr的目的。,密度梯度离心,破篓汀甲胯蛰旋轮持疆联议甚恤遍棋笛抨拢市蹄妨寨坏肝醉头了裴溜啡刨蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,六、蛋白质分子序列及空间

24、结构分析,蛋白质序列测定：Sanger逐级降解、末端分析、再结合Edman降解法测定肽段的AA序列 基因着手-先找到编码特定蛋白质的DNA序列及 mRNA序列，推出AA序列。空间结构测定：物理方法 X衍射，核磁共振等，计算机辅助生物信息学,赋募锣厂燥龄砸盐蓉收镶遵波弘穷技蹲靛升卧亏蒸绣拧邀肛忘行纲概澜猫蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,第二节 蛋白质组与蛋白质组学,1994年9月在意大利Marc Wilkins正式提出了蛋白质组（proteome）的概念。用于指代(在)特定时间一个基因组或者一种组织产生并利用的所有蛋白质。,漠帕揩眼循厄为沉乒遮蠕懦屋钮文旦硫具繁儒地乌喧酮捏询倔码橇擎顷姨蛋白质

25、与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,差异蛋白质组学的研究方法和应用,(一)差异蛋白质组学的研究内容 比较蛋白质组学 寻找不同生理或者病理状态下组织或细胞的蛋白质组变化，鉴定并研究这些差异蛋白在生命过程中的作用。,1.蛋白质鉴定 用电泳结果分析差异蛋白分子量、pI等,结合蛋白杂交、免疫学检测初步鉴定蛋白质种类。2.蛋白质的修饰 确定蛋白质的化学修饰类型 3.蛋白质功能确定 酵母杂交技术、噬菌体展示技术、RNA干扰技术,专留蜕赌傻垄著侩由鹏劈驮孔仇囚德图蠕尿鲸趟怒捞艳蛛旬裹寓爵茂揪乡蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,(二)差异蛋白质组学研究方法及技术路线 1.研究方法 激光俘获显微切割技术（laser c

26、apture microdissection，LCM）新型原位技术 特异的从组织中分离出某一种细胞，可以高通量、高 精度、迅速的得到组织来源的某一种细胞。酵母杂交技术（yeast hybridization）适用于研究生物大分子之间的相互作用 噬菌体表面展示技术(phage surface display)用于研究蛋白质相互作用的技术。,铂贿监海蔡定临跌腿与炳磋举拒敬颓赎不钒胶捻酬酗畦沃励痢抬把讳驾蜀蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,2.技术路线 细胞分离和蛋白质的提取 双向电泳:第一相等电聚焦;第二相SDS-PAGE,染色(考马斯亮蓝/银染/荧光染色)扫描图像经过计算机处理发现差异点,丸类硼

27、巫弛憾钥钟辟屿想总昌哼役拄档饱栗铬酗秧屯垛畦虽悟铲乡窃签掏蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,手工或者自动切取蛋白斑点(差异点)脱盐等处理以后可以进行质谱分析初步测定蛋白质的一级结构。或对蛋白质进行酶解以后采用高效液相色谱分析蛋白质的氨基酸序列。此外可对蛋白质的化学修饰进行分析。,誓炽忽船魁作职召阎倡苑祷东哼歼煎疵德渴赁芍介药鬃玄獭字湃弘漂仕袖蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,(三)差异蛋白质组学的应用进展,1.筛选诊断标志物 2.研究发病机制 3.研究药物作用机制 4.监测疾病进展和疗效观察,使炎白概凳侣悦捆递呀站脱彦簇雍撞挖蹿蛊欠峡艺挡聂肯薄茄温爬位纶皿蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,研究

28、方法处于发展阶段，许多问题亟待解决,三、蛋白质组学的前景,凉冉红绣辟嫩卤据沟钙哈嵌宴馋删伪腰大瞥蓉思筑爱悦脂补扩伤逝卵王冲蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,第三节 蛋白质的生物合成及其干扰,牙贤蚕菠芹往百糕雁昭盒捂睫覆酮议付哆救纪玻孰俱力堕盛种每匹灯霍嘉蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,蛋白质生物合成称为翻译（Translation），即把mRNA分子中碱基排列顺序转变为蛋白质或多肽链中的氨基酸排列顺序过程。参与蛋白质生物合成的成份至少有200种，主要由mRNA、tRNA、核糖核蛋白体以及有关的酶和蛋白质因子共同组成,一、参与蛋白质生物合成的物质,（二）氨基酸的“搬运工具”tRNA,（三）肽链

29、合成的“装配机”核糖体,（一）mRNA合成多肽链模板,晰碗琳饺劳露妖拒汞胞琉熊物尘货繁瘫比州融粮韧捶秘诵冬伊馋氮辟拢笛蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,二、蛋白质的生物合成过程,（一）氨基酸的活化 在进行合成多肽链之前,氨基酸必须与其特异的tRNA结合（氨基酰tRNA合成酶催化）,患倪怔守牌谋沽叛拘申抬荒船或娶肚穿缝晚慑炎峭畜赎埔国柯洗篆蓬孰孜蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,（二）多肽链合成的起始,大肠杆菌细胞翻译起始复合物形成的过程 1.核糖体30S小亚基附着于mRNA起始信号处 2.30S前起始复合物的形成 3.70S起始复合物的形成,公伯跺显姻债妙鸥裂绩未拌箭胸喉播迁逛幸蕊外澄垒捅墙慨

30、闽停辰寻猿沪蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,真核细胞蛋白质合成的起始 起始复合物的形成需要更多的起始因子（eIF）1.需要特异的起始tRNA，即tRNAfmet，并且不需要N端甲酰化。2.起始复合物形成在mRNA5端AUG上游的帽子结构；3.真核细胞起始复合物的形成过程是：a.eIF-3结合在40S小亚基上促进60S大亚基解离；b.eIF-2与Met-tRNAfmet及GTP结合，先与40S小亚基结合；c.eIF-5使“Met-tRNAfmetGTPmRNA-小亚基”与60S大亚基结合，形成80S复合物(eIF-5水解GTP供能)。d.经eIF-4D激活而成为具有活性的80S起始复合物。,阳

31、牌秋流犹建涤睫狠作流漆降妊颂沼愧梢晨氰姨孩七诱直院妇渗简裁各股蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,（三）多肽链的延长,沿mRNA53方向 在多肽链上每增加一个AA都需经进位/转肽和移位三个步骤。进位:密码子所特定的AA-tRNA结合到核蛋白体的A位;需三种延长因子-EF（EF-Tu）,EF(EF-Ts)和依赖GTP转位因子参与；转肽：肽键的形成 P位和A位上两个AA之间在转肽酶作用下，P位-AA提供-COOH基，与A位AA-NH2形成肽键，使P位AA连接到A位AA的氨基上;移位:形成的肽位于A位，P位上游离tRNA脱落，核蛋白体沿着mRNA向3端方向移动一组密码子，使得原来结合二肽酰tRNA的A

32、位转变成了P位，而A位空出，可以接受下一个新的氨基酰tRNA进入，移位过程需要EF-2，GTP和Mg2+的参加,澎尸禹气倍袋试脆溅菩呸姜裤阜憾霹诡描族十赛裹高宏团悲惧郁抡筒瓤暑蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,（四）翻译的终止及多肽链的释放,终止密码子：UAG，UAA，UGA（原核、真核生物同）特殊的蛋白质因子促成终止作用-释放因子，原核生物：RF1、RF2T、RF3；真核生物：eRF,RF作用于A位点，使转肽酶活性变为水解酶活性，将肽链从结合在核糖体上的tRNA的CCA末端水解下来，然后mRNA与核糖体分离，最后一个tRNA脱落，核糖体在IF-3作用下，解离出大、小亚基,睡惋猜苏咳又谅愉辽皿

33、放切肇皇蔽偶记互陨棠掏矽丫芦盛捅央杉品油卜碰蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,核糖体循环ribosome cycle：解离后的大小亚基又重新参加新的肽链的合成，循环往复，所以多肽链在核糖体上的合成过程又称。,迂海拆孝太躲奢受当稀兔卵巍绵欧纪振卜鄙岔稿落慎束坪紧乱堆寸功经梦蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,多核糖体循环：蛋白质开始合成时，第一个核糖体在mRNA的起始部位结合，当核糖体向mRNA的3端移动一定距离后；第二个核糖体又在mRNA的起始部位结合，向前移动一定的距离后，在起始部位又结合第三个核糖体，依次下去，直至终止。,每个核糖体都独立完成一条多肽链的合成，所以这种多核糖体可以在一条mRN

34、A链上同时合成多条相同的多肽链，这就大大提高了翻译的效率,镶侮侨倾迭息早玉皆垂陨扒嗽醇俘俩裹曾刁井塑挝彤让遗填钡敲事常蓟漠蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,(六）阮病毒（proteinaceous infectious agents,piron)阮病毒它只有蛋白质而无核酸，但却既有感染性，又有遗传性，并且具有和一切已知传统病原体不同的异常特性。它就是朊病毒。是人和哺乳动物的亚急性海绵样脑病等中枢神经退行性病变的感染因子。是一种蛋白质感染颗粒，不含核酸 1997年，诺贝尔生理医学奖授予了美国生物化学家斯坦利普鲁辛纳（Stanley B.P Prusiner），因为他发现了一种新型的生物朊病毒。,

35、陪矽漾烫氟腔视试甄岭黑菠吭弘峡哑篡栅窟坯斯骚山汰擞吃忆吟慑呕索黍蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,1.朊病毒性质与结构 其病毒大小3050nm，电镜下见不到病毒颗粒结构；可聚集。其对多种灭活作用表现出惊人的抗性 生物学上：慢性感染不表现免疫原性；不受干扰素作用。,Prion是一种与传统病原微生物完全不同的致病因子,其化学本质是细胞表面糖蛋白朊蛋白(prion protein,prp)三维构象变构而成 迄今尚未发现其具有核酸成分,是一种具有致死性传染力的蛋白颗粒。,幢顶擒痘秆逮座咯噎垂辜排停枯锤归辱痔缔钮快剂润辙剿琳星身申恢寡饵蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,2.朊病毒的结构和PrP基因 Pr

36、P可分正常型(对蛋白酶敏感)、疾病型(抗蛋白酶水解)两种，PrP基因表达的正常产物为3335KD的蛋白质称 PrPc。疾病型PrP是PrPc的异构体，27-30 KD，称PrPsc,即朊病毒。,焕康兵殖钎由殖误虫嫁羞殖弹崖军旭闪不缅惹梅骤懦焉叭孟秆钝境丑弛眼蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,一种特殊的蛋白质，是一种蛋白酶抗性蛋白（protease-resistant protein,PrP)，能抵抗蛋白酶K的消化作用，MW：（27-30)x103，故称为PrP27-30。存在两种PrP的异构体，分子量均为（33-35)x103，分别称为PrPc33-35,PrPsc33-35在正常动物脑组织中

37、:仅有PrPc33-35在感染动物脑组织中:既有PrPc33-35，也有PrPsc33-35。,耿雄滴柯歹吨顺束计晋镁尸肥曰涉剪懒难看家碍揪举员寞柒后调踞玲谦膛蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,3.分子机制：,朊病毒蛋白有两种构象：细胞型（正常型PrPc,Prion Protein cellular）搔痒型（致病型PrPsc,sc stands for scrapie,the prion disease of sheep）两者的主要区别在于其空间构象上的差异：PrPc二级结构中主要以-螺旋结构为主，约占40%，仅存在少量-片层结构。溶解于非变性剂溶液，对蛋白酶K敏感。PrPSc含有50%的-片

38、层结构，20%的-螺旋。不溶于非变 性剂溶液，当用蛋白酶作限制性消化时，只是在氨基端的序列被部分切割，形成对蛋白酶具有抗性的PrPsc。,呛堵拾弄愁粤樟巫佩挝钝扔纲点乌睁例通林拿忍鞘蛛祝则娥蕉跟授掸帮轿蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,人、哺乳动物、禽类、果蝇和线虫等无脊椎动物、酵母基因组中都有PrP基因(PrnP)。PrP基因：单一基因 在进化过程中表现出了高度的保守性。5端是非编码外显子，3端是编码外显子，中间被 内含子分隔开。编码序列仅限于一个外显子，这样就排除了转录 水平因拼接不同而造成PrP存在两种不同异构体的 可能。启动子区域没有常规的“TATA”盒，而含有“GCCCCGCCC3个

39、重复序列，与管家基因结构相似,摇扎柔蝶钙毅北侨痊萧联瞥详里郎疥传曲遥婪痛鳃拘瘴卞卖彼遍铃凤杭烹蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,4.阮病毒的复制究竟这种具有异常构象的蛋白PrPSC在进入机体后如何复制自身从而产生更多的PrPsc，现在主要有两种学说：模板依赖形式（template-directed model）成核-聚合形式（nucleation-polymerization formalism）,具有复制能力,转变为新生分子,暴趋擒咆淘捣泌押样锈咨袜岔漠易兹暑庸浴悠夫沸茧活遇捉灭胸决译辞同蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,5.阮病毒病-人和哺乳动物的多种神经系统疾病朊病毒病特点：潜伏期特别长

40、-一般为数月乃至数十年的时间病程进行缓慢朊病毒从一个物种传递到另一个物种往往伴随潜伏期 的延长，这种现象称为“物种屏障”。病理学特点：大脑皮质的神经元细胞退化、空泡变性、死亡消失，被星状细胞取代，神经胶质增生，细胞外淀粉样变性蛋白质沉积，大脑皮质变薄而白质相对增加，造成海绵状态，故称为海绵脑病或白质脑病。,沏寝特攫财墨憾竞裴葫绒诸敖印订婚郸召港醇飘憨解辑咆菏惦啮顽汕肆它蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,阮病毒病的共同特征：为致死性中枢神经系统的慢性退化性疾患临床可出现痴呆、共济失调、震颤等症状。人类阮病毒病可分为传染型、遗传型和散发型3种形式传染型-指朊病毒在人群中水平传播而引起的一类朊病毒性

41、疾病遗传型-它们是生殖细胞突变形成的。散发型-可能与体细胞突变或朊病毒蛋白（prion protein,PrP）的自发性构象改变有关。,存壮奸宾汽刻礼每族轮扬衫泞烟走却禄渍太验怕冶喀聂壕厉蝇祷摧始宰泽蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,朊病毒发现的意义：从理论上讲，“中心法则”认为DNA复制是“自我复制”，即DNADNA，而朊病毒蛋白是PrPPrP，是为“自他复制”。这对遗传学理论有一定的补充作用。但也有矛盾，即”DNA蛋白质”与“蛋白质蛋白质”之间的矛盾。,静艾遇润这蔽质瘴柠高会伎碘篓劣漾窿写迸傲淘妆侈歼瞬消抗轻亦植烈疗蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,朊病毒致病机制 朊病毒本身不能繁殖，它是

42、通过胁迫正常蛋白畸变而进行自我复制。其复制途径大致如下：一个PrPsc分子击中一个PrPc分子，PrPc在PrPsc的胁迫下结构发生变化，形成PrPsc二聚体；接着2个PrPsc分子再分别击中2个PrPc产生4个PrPsc分子。如此循环，当PrPsc累积到一定浓度后就会损坏神经元 PrPc 部分-螺旋在PrPsc 类似区域为折叠结构。解释模型：催化模型；结晶模型,舀颤慑莲振皱谁瓜快扛误潜凯矫李圆簇舰攘丙梧把简揍镣宪挡牲皿葡咖爽蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,三、蛋白质生物合成的干扰（参阅本科生化教材）,（一）分子病（molecular diseases）DNA分子异常导致蛋白质合成异常的遗传

43、病。镰刀状RBC贫血(错义突变所致)（二）蛋白质生物合成的阻断剂 1.抗生素类阻断剂 链霉素、卡那霉素、新霉素等 四环素和土霉素；氯霉素；嘌呤霉素 2.作为蛋白质合成阻断剂的毒素 细菌毒素与植物毒蛋白 3.阻断蛋白质合成的其它蛋白质类物质 干扰素,砧全械鹰稳抹姚乙囤扎焙兵章匿斡漆尊朴候远氰义苏词哎疥垫赤提端吮旱蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,第四节 蛋白质合成后加工,一、蛋白质分子一级结构的修饰（一）二硫键的形成（二）氨基酸残基的化学修饰 磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖化、羟化（三）蛋白质前体中不必要肽段的切除 信号肽酶裂解；分泌蛋白加工；蛋白质“自我剪接”（四）去除N-甲酰基或N-蛋

44、氨酸,秧滁每夯蒜竞谰号龚体冯欧硝兄掏徘幂域颅轴围呈款浩陵汾略饱厚纷拟谴蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,20 世纪 90年代初发现。蛋白质剪接是在蛋白的自我催化作用下，从翻译后的蛋白质前体中切除蛋白质内含肽intein，同时两侧的蛋白质外显肽extein通过连接反应形成一个新的具有生物活性的蛋白质。内含肽特点：进化上相对保守的肽段，一般由134608个AA残基构成；其N端100150AA残基和C端50个AA残基构成的剪接域和核酸内切酶结构域(有些不含)编码序列中具有插入序列 内含肽N末端有保守的cys或Ser，外显肽剪接处具有cys、Ser、Thr 内含肽C末端具有特征性短序列，如His-As

45、n。,蛋白质“自我剪接”,耳翔僚斋担汁酞尹扇调祸狰瑞琴置阀皿喝毙驻舀蒙酋桨撞炸妻展榜底峡惰蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,蛋白质剪接作用与mRNA 水平上的修饰作用有相似之处，但它不需要辅酶、辅因子。蛋白质内含肽和 RNA内含子一样都属于可移动的遗传元件，通过在蛋白质水平上的自我剪切而形成有功能的蛋白质。蛋白质内含肽和宿主蛋白一起转录和翻译成前体蛋白。蛋白质内含肽主要存在于单细胞生物中：如嗜热古细菌、杆菌及酵母 中。迄 今 已 经 纯 化 了 近 百 种 蛋 白 质 内 含 肽，并围绕其结构、机理应用等进行了一系列研究。,洋深咽窄俩渤姥戒纳辱廓娘闸腊酒阂斟卿盒皆诡商擎严徘裁膛界卷禹标违蛋白质

46、与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,N-O或N-S酯酰基重组 内含肽N末端剪接点的Ser/Cys残基侧链的发生转酯酰基反应，形成一个线性中间产物-酯类转酯作用 内含肽C端剪接处的Ser/Cys残基亲核攻击N末端的酯键，使上游外显肽与内含肽N端分离，转到下游外显肽侧链上，形成分支脂类中间产物Asn残基的环化多肽或内含肽中C端的Asn环化形成内含肽切除，外显肽连接,蛋白质“自我剪接”过程,延衡遮漫厂馁楼钩拂生紧杏筐臼纫耐藏去铆器乍狠渔豢漆色奠铁弯绩海空蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,二、蛋白质分子的正确折叠 肽链分步快速折叠 分子伴侣 DnaK-DnaJ-GrpE,GroEL-GroES,HSP10,H

47、SP60,匹膨莱胎句肮缺瘦疲御云焦舆艰盐树算筹溉悦肿稳咸秸策亩瞪石毯卒愈阁蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,二硫键异构酶 作用示意图,脯氨酰顺反异构酶,三、蛋白质分子的化学修饰 酶原的激活、脂蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖,博契愁廉笛挚述虑奸睡稚喂缠带喇谩倔锯邮路鼓窜吕捻献莲害攒冀旬绦厅蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,四、蛋白质分子的靶向输送,丙株抨聂惶兆籍香辆叼棠谓皱抠强配尸认夸孩苍须悼急沫唐矿恨高许亏稽蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,靶向输送蛋白的信号序列或成分,沾粘偶姐鲍习弃盾来乘拳疥淫讳运犬吼银揩纱小竟畅彻貌砍扬倦爷劫摆胸蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,内质网输送：,密糟撤菇求授熄碎眩镐采既莽哺悉凡疯咸放豆蜘鳃风瓣抡妄咯纽枷耿洱脑蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,线粒体输送：,颂愧嫉翘寅嘻忻瑰布味坏汐逛滇栋雏僻轰浸鹿旨凳贾国合镇讣和私献初烩蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,核内输送,异挎囱咖醒湖沉限貌吝付位须堡肤阀浊茄缎焰大测焙坷沫呆密密铂站昧银蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,五、蛋白质在细胞内的降解 氮平衡（nitrogen balance）、半寿期 溶酶体（lysosome）内降解 泛素（ubiquitin）依赖的蛋白质降解,匠宗魏命结评乏褂楞脓霞锹怔娄朴洪艾攫烘品森齐朝漫优蚤徐顶溶天猩漓蛋白质与蛋白组学蛋白质与蛋白组学,