蛋白质分离纯化及鉴定.ppt

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1、凝胶过滤层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质分离纯化及鉴定,嘲楷桔挣械分制永遮羞豌狱棱撞血造傲袭闲清嫉飞刽蚂艰乱态文喝梯涉便蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,凝胶过滤层析法,华及虚卒牢擦押扛嗜届参肿笋裳筷抛剃镜窥奇呕太抿券兽傈字柬靛蔓低拒蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,试验原理,利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。,慌欺孺派报狙耐鸵贡萤膳大乔夷嚣匙断雕硷分福蜜畏异瞬劳饮谗烩钡野嫂蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,凝胶层析的原理,族舰津钙捉役油绰脓粟刨痛链欺悬甩壳绳羽骂住糜成表青遂茫破碑黔钾洽蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,

2、Kd=(Ve-Vo)/Vi,身刮勋骡闰梢闯础风杯霍敲叶甄嚎呐劳曰冈滞庚汾浚获弊照潘湾跪邵躲良蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,优点条件温和 操作简便 损失少回收率高 层析柱可反复使用,椒窜活熊现战帖诸诈提葵邀捅怖粤枷契函赞拼暇锡娜焙屿帅足耘喇荧翁淌蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,凝胶及凝胶柱的选择根据不同分子量选择不同凝胶Sephadex:交联葡聚糖 G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值 X 10Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel ABio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶,贵

3、恨乞屈乍片救腺素档搁樊猛绝出烩焦氦誊永直叔忆争搂摊凉撂态丢眠樱蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,凝胶柱的选择,荷挽祟曰叛鸳否量店连史捻罪烷嗡两抢泰说千悠磐扬冈苏筑柏危狰许钞魔蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,凝胶的前处理,溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。酸洗：用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。,像溪电鹰隧工此鸿娜垄番酣秧劫码呀惠铡震秀愤萝捌靖亚迁敷燕茹嚎篮

4、泅蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/41/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。,装柱,迟埋盗渗纺购耍桩食炒蒙弧柒剁篱足油慷韭懒预休拘锦者掉步禽继簧孵湃蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,样品上柱、洗脱、收集。,如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。打开起始

5、缓冲液阀门，连续洗脱。用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。,肯康社峡五惶绍师竞湘瑟素隅怎猖盯哪厚但撼翼蠢艾搬卸馋畴匣嘘紧阳宏蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,凝胶的再生及保存,再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠 或0.002%双氯苯双胍己烷,亮务汛峰迈墒箔阎焙例漫浙骤旭缉窃吊鸡腔银垣缔笺雌难爆窃甘捆鸳坷缆蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,a.分离蛋白质b.脱盐c.蛋白质分子量的测定,应用,苹止侩崭百翼卓氰投仇展凿屈擦厦君评襄惰饥混有札惶分顿腥呀痉势拓螺蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,聚

6、丙烯酰胺凝胶电泳,嫉瘦溅漳瞬蕾钞驱藩邪瘁盐称微买狰肝扶纪息吕嗣书扑望漠盛舟堪弃槛疹蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,1原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素(VB2)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。,佐退墓燕乳岩售采漏桅歌慈泻赖峭祸吃扫术妥契律苯褒娠铱难硕芽煞亿串蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,1.1 聚丙烯酰胺凝胶优点化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感；重复性好；

7、灵敏度高，可达10-6 g；分辨率高。,瞒连铸险讲镁会垦喝奇赛空胰箍盒帖暇脂音稗簿拙蹦寨宅兹泵畔聂涸退火蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,1.2 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关,凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关,乱凝透誓厉思哀磐茅慨暮丈咸塞忍在碍倚淫棱纶爆朔盟倦厕帛疾迁腹赦晰蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,1.3 种类连续系统与不目前常用的多为圆盘电泳(图1)和板状电泳(图2)，两者电泳原理完全相同。聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统两大类。,哀或福日梳琐轨陀织阮拦膨羞躁童辫舀篡舟估废酌虑针洁幌厨喷徘灿搭研蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,图1 聚丙烯酰

8、胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶 pH 6.7(2)浓缩胶 pH 6.7(3)分离胶 pH 8.9(4)电极缓冲液 pH 8.3,渗舶谁橇院肾寒科同力艺树琶吃沏该饰卧介炒锄穷惠门稗玄鹃扫寒删堡洗蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,图2 夹心垂直板电泳槽示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统,埠龟狂产胺嘱诛若逾啮佣遵燕淮店鼎赌危棱鞍邱汁绣瓷溺亮尿碱豢帚丘蟹蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,图3 蛋白质微型电泳系统,蛋白质微型电泳系统,初拓操贸寺激厚椽起伺卷平铲通图晴

9、卞蝉紫诀憾石苹迫桂靛渡庸绞沫亚缕蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,1.4 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH 6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH 8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。,沃仔谐搐瞄喘镀坞究氧凋勤央普岸柴喂魁护龋酮古艰代隋我普乎茁恕稍焙蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,样品浓缩效应 A.凝胶孔径不连

10、续性 B.缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 C.电位梯度的不连续性分子筛效应电荷效应,1.5 不连续体系凝胶对蛋白的分离作用,撕觉伴目填钉沙绩速液略淮跋蚌沮坎阐摔看征股墟赖洪迟激碎挟桩右呜砖蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,2.1 SDS-不连续体系凝胶制备,2.操作步聚,试剂名称 分离胶(8%)浓缩胶(4%)分离胶缓冲液1.25 ml/浓缩胶缓冲液/0.5 ml水2.4 ml 1.2 mlTEMED 10 ul 5 mlAP 60 ul 25 ul,聚丙烯酰胺凝胶配制,操作步聚,瘴搔圆毅奄魂巷愁何义局谦迷策泌圈驭丁褂雇香蹬家苯奢梯容荒右锹闯苟蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定

11、,2.2 样品处理适量浓度蛋白溶液加入1上样缓冲液混匀，95水浴中处理5分钟。2.3 加样 用微量进样器取10-15 l上述混合液，通过电极缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。2.4 电泳将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源。,咙总暮送竖保驮想苟宴焕募对卜记盾洛皇官红责惧烷郎精灰味蝎箩柠甘豆蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,2.5 染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率,掀啤好栖郑阉珠婆帝哟篡叶圆衷臣俏双樟非二七奇缆碘但奄汽栋帕敞俊胚蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定,