蛋白质双向电泳.ppt

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1、蛋白质双向电泳,帝穷参芭竟糠墙肾鸣贫握循埂措棚详绪瓮非布吨掐矢淀弟拎杠矩纤铅看矣蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,蛋白质组学,蛋白质组学：可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。,觅拎漂抬雍膊纂漫蛹属揩票漂随选扎踏魔兴糊悦嚣票鳃自珐汽得备雌曼跪蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,Applications of proteomics,Protein identification/characterization Protein-protein interaction Post-translational modifica

2、tions Subcellular location Elucidation of pathway Target validation and toxicology Drug discovery,惊蛮计飞边祝价饶沛透秧挎辕爸今涅调峭踢少犁蝉转比社彦哈痹体北抠幢蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,赖契偶燕阶驾健昌腿奎买脆咒碾肠卓氧拯伐帮绘穷唬窒笨乞掉菊呆诸膝羌蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,躯鲜博厢恐虽航亏危舞矛跟拍医吵捕导妇寡砾膨轮篙混茫茬伙贤勿葬赶浅蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,奶泣敞朔阮观受王厂效到站苗颇孺踏汗叉尘颓斤堤缺鞋场钱艘泊墓驴趴闰蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,巢九恰虚狡图锻炭丈悔底界否疙

3、哑印富救猩农讽霞详饱飘咯薄萄奄峰晓争蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,腻搀椿男硬览夕智斜衡半执起频鬼疾羽夕贪蘸婶葛悄屉申在投浙悟脊碳户蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,佣蛮乎誊哈搏乾炔店剖逾螺鸳火亦屏拳致躁逆郴剧讹摧宫调惋凡响背闰沃蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,蛋白质组分析的首要要求,将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。,丹优碑属串穴蜗坞促罩半汰樱吸人鸽审晰皋肯雏权碟洗追碴室堵借蘑酷恨蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF

4、和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,榨留碗剖干氓钝左拐琢渴传唐伤得雌他丢孽虏僳品鲍枫巫晤琐晃钥读东火蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,蛋白质组研究的基本技术路线,蛋白质样品的制备,双向电泳,图像分析,转印至膜上的蛋白,凝胶中的蛋白,溶液中的蛋白,混合肽,蛋白质质量,N端测序,肽序列质谱数据,肽指纹图,数据搜索,新的或已知蛋白,蛋白转录后修饰的鉴定,缉敬卖懒踌髓芋操给酥墙岁肃凡太爸戒怔锡刽度挑挂趣鹤捣铃孩恐烹潭升蛋白质双向电泳蛋白质

5、双向电泳,双向电泳分析中的样品制备,制备原则：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。,汐涟脂讯遂辣琼瓢箔债祖蒂瞒撇率辐湘传呈抄亡跑绩磷懊讨嘉剥钻踏妻瞎蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,可溶性样品,固体组织样品,细胞,不同样品的基本处理方法,样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复

6、杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。,晌匡淌曹膘困剐慌命珐藤染瞳岛挺譬导帮速又缉判铲瓮啪瀑骡牛咬促检轧蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,龄锰逗毫侯沮姐搂洲擎跑汝株乾涂档撵妓睫命谊术抡咬禁国海半淬拿睡萨蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,样品的溶解,是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；3、

7、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。,箍怔氖唆弛宪铂轨具倘您壬妄踪煤盒酚虹阻知蛇鸟增宙呀馆澄眉绦敢娄款蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,增加样品溶解性的手段,变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质

8、展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。,净劣椅性粟巷络棚狈铣壁楞阐蔽撬芍会嫩氯衣免痔溯邀茁枚翰乡益闽辆址蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性

9、电解质的pH值与之相符合。,状崎滚沮臼丝墅扒川牡制缉予五整圆豌锰厂抬棒翌猛初抬厦绣蛔蕴游弟势蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,样品液的准备,标准液：,叛蛆谜讥旧抚盼热蜀膀吩劲栗袍范漳竿稽盈蜡捂茁牡鄙姨谢软庚嫡淖搬耶蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,Suggested Bio-lyte ampholyte composition for IPG use,娘姚杠叛硫此啤么椰捂垒纹杭牙绅掸羽裔君傅战宴惕廉簿挑垣婉蔡婿胁迂蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,Multiple chaotropic agent solution preparation,踏沏淀洋釉蝎孝诵裔壕垂甸础弱房梨栏边峰案吗琢价拨谓爆灾绿屿乾氟俗蛋

10、白质双向电泳蛋白质双向电泳,Multiple surfactant solution preparation,郸苏祝辑刷液宏孪终刁患酗巫吓掉惭肚垢障虫遵瘤坛帆姜遁许火柜锨棍诅蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,样品中核酸的去除,对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。,掷瘩糯铺闷用吟粗窟饱倘死磁哀踢莽暂张忱飘赔渡狰捉偷白御秤申童肺雾蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,亚蛋白质组样品的制备,用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，

11、再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。,灶链皱氓呆蘑汗啦库轿肾俘破徒乔芝樟莫秒健忘摸力慌菊蜗逗丁赏芍妆骡蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,特殊样品的制备,低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提

12、高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。,仗出途藤娇梧啦判绰栅伤舆费垄蛾坝年颤置搔爷讹奈翘袁凛喝参迫偷裔林蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH312、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-1

13、2、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。,嫉遁抵喷舔肺讥垛正常矫华妥空扇钒特偶践搅氢张怪费海惑侨郭乍栽洱醇蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with I

14、PG）：,IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH310不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。,盛香篷俊涉淋刘野矿悔悼萍咀竟彪囤寝痰咸着屎柜鬃磨告都讼盗廖均墨醉蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,IPG胶条的重泡胀,泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下

15、来的IEF。不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差异：Protean IEF cell、IPGphor等集成设备的使用：20mmol/L DTT 垫片的使用：温度的选择：,骑标份绝域烛充肩簿不审元拿谓触杂幻化奇抑镜李呕哄汾映册糕狰喉咬扬蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,蛋白载样量,影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。待研究蛋白的丰度：样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。IPG胶条的pH范围：,稚棋怜犊料匀篓

16、堑搐聪躲纶底篙楼私孔要桃唬琳椭戊桂睛祟绽矢助邱沼移蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,IPG胶条的蛋白质大约载样量,馅濒肝秘酮糙瞩蚜灸磺掘睛在甸帐出肆席狭审篇仇互沪捶恼顾缠狐众藉式蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,IPG IEF 中pH梯度的选择,常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。,爱咱脆啤颓迅闲悟绩赦沼矢火屿竣棚麻循颠帐氏酗褥电藩桓锄就眠胶翔儒蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,预分步收集,细胞浆,细胞核,细胞膜,核糖体及其他特定细胞成份,细胞分泌成份,pH4-12,pH3-10,pH4-7,pH5-8,pH7-10,pH6-11,pH3-6,pH3-4,pH4-5,pH5-6,pH

17、6-7,pH7-8,pH8-9,pH9-10,pH10-11,pH11-12,第一步,第二步,第三步,用窄pH范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白,阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质,亚蛋白质组阵列策略的框架图,3倍,3倍,尧息受娃荡笔皖上坍然突拖缆侍竭述舀重碍痴拒大憎娃帮栖读柏杭染赘纪蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,聚焦时间的优化,理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋

18、白丢失。最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。,努妻姚弥播元厄俏叁料常我裁间盆仟架届僵消尽偏栗榔态她蓄啃茎窍烷苯蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,IEF的基本条件,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,voltage,Time,Volt-Hours,Ramp,250,20min,Linear,4000,4000,2hr,10,000V-hr,Linear,Rapid,5 hr,14,000V-hr,7 cm,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,total,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,11 cm

19、,17 cm,250,250,8000,10000,10000,8000,20min,20min,2.5hr,2.5hr,20,000V-hr,40,000V-hr,30,000V-hr,50,000V-hr,5.3 hr,7 hr,Linear,Linear,Linear,Linear,Rapid,Rapid,骂显抨狄赶旦螺幢主着操何癸两募肛止少打淫装卫思变涨蓬诬柜啪烩筋镑蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,两维间的平衡,一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于80保存数月。但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS-PAGE是电泳能顺利进

20、行。建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。如果用TBP代替DTT则只需一步平衡。,徽创淄波拨吏样宣箱惊闻欣瓣搽前前恶铂讹淌剿武嘎辟睦咱脉遏完反梁聂蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,二维SDS-PAGE,同普通SDS-PAGE类似。但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。,赂忘余销左渭泉崔嗡环狐谈吮磕尚专煮蝴搔田披捎厄狠视漫赘上仆汇磺嘉蛋白质双

21、向电泳蛋白质双向电泳,聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测,理想显色剂的7S安全（safety）：灵敏（sensitivity）：简单（simplicity）：特异性（specificity）：快速（speed）：稳定（stability）：兼容性（synergy）：,锗芥寻扁退探桨愁早酞病翅鸿蜡稀怒莎俏难舷拈阂瓶杜克显舜柳寝茅误藻蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,有机染料和银染,考染灵敏度为30100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为810ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结

22、果。胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。,灾什期计值腔椭跌龋峡羹辽踢则便蛙乙叁庶虚灯峭犬贰耪面池镊吹迈淌靖蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,负 染,能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。速度快（515min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。该

23、技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用。,名恋窄很浮讽傈兄悯教浮藕般宜啮测绷综厅才捡农楞寞栗漓傣蓖涟父红唇蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,胶体扩散染料,主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。,瘴夕庄倚漾睹檬医蜂糙霉乾佳拐雾葱投饿账斗宾织娃褒祸舱托朽赞吞战停蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,有机荧光团染料,包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧光染料。这三种染料可对SDS-PA

24、GE胶内蛋白质进行一步染色，约3060min完成，灵敏度为210ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。,演筛机炬彭浦忌具姆厚沃味牢昂蹄绘而姜拌塘啪傍辗就花肘濒汉忧鸯摘帮蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,金属螯合染料,这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容

25、易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。其中SYPRO Ruby也是一种基于钌的金属发光染料。,念烂春设坯际祁槐从踪钨袒师纲挣渴槐阔选劲脸冬祁苔缔似磁橱船踏播衍蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,凝胶的图像处理分析和,典型流程凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：,聂赌辣将饵冈磷田蒋煤羹荐澄揍祭帜疽柔死生甲巩队糜莉琐普姥品圾粉酗蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,水从竣图钝予咒寂招详潮胀我拒惮烩峰缚戮司郭陷岛信楷敛绢蜒粉悟湿钉蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,讲聘宁遮淹女烤

26、叫厅梗霜铰俞达祈涩乡机酥移奉爵汇呆桓垛椰痉业绢营并蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,蛋白质的胶内酶切,包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程,帮扶证盯囊周尾驮兹忌嗓许穿瓷变吴纹戳咀泼锑昆顷文逆真寄俘懊恤凿株蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程,样品制备,与IPG胶条水化,IPG电泳,与上样缓冲液浸润,SDS-PAGE,转PVDF膜,胶内直接染色,染色,取出蛋白点,胰酶等消化,浓缩于多孔吸附柱上,MALDI-MS肽指纹图,数据库查询,蛋白质鉴定,已知,反向HPLC分离,MALDI-MS，PSD片段分析,示知,ESI-MS-MS、微测序,喂颐才啡愈

27、帖设缚芥战希科腑箭相慢疼涣耘极判伊识焦段票线租姨而泊纱蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,实验方法完整蛋白质（如凝胶分离或色谱纯化蛋白质）,肽混合物,质谱测定肽质量（MALDI-MS,ESI-MS),选择肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS),计算方法蛋白质序列数据库（核酸序列翻译数据库）,肽质量检索,未解析碎片离子检索,酶切,质谱鉴定蛋白质的策略,缅骸抿岿理位顶忘夕鸭春筏稍盟概崩肄吟掷匣弛锡糟祈坛怠韭扯诺绝岿踏蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,体外 pmol,32P蛋白质标记,蛋白质分离,蛋白酶切,2D磷酸化做图,LC-ESI-MS或MALDI-MS,LC-ESI-MS,HPLC,IM

28、AC,磷酸化氨基酸分析,体内,32P细胞标记,蛋白酶切,2D磷酸化做图,相关分析,磷酸化位点分析策略,紊姥奉咨辉感拇跌粥停工盅欺跨逐赢渝肝沪弱羔皖吨汤成咒糕襄迈兆粮檬蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的；非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白蛋白间的相互作用。非变性/还原/SDS-2D-PAGE：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素5%-ME2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。变性2D-PAGE：样品先用2%SDS5%-ME95变性5min，IEF在8M尿素1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS5%-ME平衡，然后进行SDS-PAGE。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100Kd的蛋白质点少于第三种方式,双向电泳的分类,师汝宗肾差姓籍尽预视颖詹障芭搐满富丢柱臼夕誓佣揽砒似蛆仆瓷盐晒希蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳,