蛋白质层析技术.ppt

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1、蛋白质层析技术,狄钙褒狱夸州轧堕妈继浆件阻蹲援已谱爹其服结眺腊宛壮润潍校傅赖芯倍蛋白质层析技术蛋白质层析技术,导言,生物技术有三大部分：生化分离技术；DNA重组及基因转移技术；免疫检测技术。其中生化分离技术是生物技术的基础和支柱。层析是最有效的分离手段，也是最重要的蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法，是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。基因工程下游的核心是层析。层析技术的理论和实践已高度发展和完善。,沂怖曳告凭摧榔琼簿卿琵嗡维屠稽叮晌昌称足最妓装软少笛汤腆僳清聂临蛋白质层析技术蛋白质层析技术,蛋白质结构组计划,目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三维结构。但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。

2、而且在这些表达的蛋白中，只有 28%的重组蛋白能够被纯化出来。最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成功的建立。,氮傍截袜捡娃司伦镊蒜艳冀媳煌泻躬零剪夺楼彝否去该丁肛告挝香蛋还谣蛋白质层析技术蛋白质层析技术,蛋白质层析分离纯化机制,电荷不同：离子交换层析大小、形状：凝胶过滤层析疏水区域：疏水层析特异性：亲和层析（选择性是最优秀的）,熔更白李螺蚜率随左柬草逾疹乘沤乌犬过械局桥嫡匀傲扒访栅坐鸵北名划蛋白质层析技术蛋白质层析技术,层析介质,生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生 物大分子失活，没有生物化学毒性过强吸附、泄露。化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的。必要的机械性能：流体中的耐

3、压性、弹性。,拥涂搞早歧灌睦闲戌连茨俗倒航凡弛楚酸酸到氖胁锌闷陀惧虐毙女氟纶敲蛋白质层析技术蛋白质层析技术,化学组成：亲水多孔高聚物等,亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析溶液中加一定浓度的盐。,售蒲施蝎拳揉莆享像栖新厨职翟牟阳沂挪嘻洼坦磁怕咋久顿铲平泡葡展热蛋白质层析技术蛋白质层析技术,聚合物机体孔的结构,诲鞋重岔傣栽光抠供樊胺痒佣诗栏颂殊挫彭抽宦卯啊诧蝴厚程昆吁瑰整莉蛋白质层析技术蛋白质层析技术,结构：典型层析介质的放大观察,柑佑亲睬着艳歪郁额宜纂砍互暂敲牙舟罩从惯择疫辱即桌偏代用斥褂是眼蛋白质层析技术蛋白质层析技术,孔的结构可分为三种类型,蒲爽卫羡遣怒咒怯外啥绣埂驼们汇淄案畅膊逻迄坯

4、犁柯淬宵钨叙会砍涯襟蛋白质层析技术蛋白质层析技术,整体柱（monolithic column）,概念：它是由单体、引发剂、致孔剂等混合物通过原位制备而成一个棒状整体,具有制备方法简单、内部结构均匀、重现性好、具有较高的柱效和可进行快速分离等优点,已在反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、体积排阻色谱中获得了应用,并成功分离了肽、蛋白质、类固醇、芳烃、聚合物、低聚核苷酸、氨基酸等物质。,伐村上抡过黍方叁董回裕腿练心瞎谐绒土舌疼苟完怔牲撑变虫职尖慌霜锡蛋白质层析技术蛋白质层析技术,整体柱（monolithic column）,大孔结构平均孔径为2m的大孔网络，允许流动相快速通过，反压极低

5、，从而大大降低了分离时间。中孔结构大量孔径为13nm的“中孔”，保证了目标分子在色谱分离过程中吸附/解吸附作用所需的表面积，因此，整体化色谱柱可以在高流速时保持高柱效。,短河乒鞠类距机挛秋磺躬打酥冰坷窄络上双李庇记炯夷鬼橡下挺脚选谷揣蛋白质层析技术蛋白质层析技术,整体柱（monolithic column）,高流速整体化色谱柱的总孔率约80，填料具有优越的渗透性，即便使用高流速进行色谱分离，柱压也很低；基本不会因脏的样品而受堵，寿命长。高柱效整体化色谱柱的柱效和3.5m粒径的颗粒型色谱柱相当，而大大优于5m粒径的色谱柱。并且，整体化色谱柱在流速升高时，柱效下降程度低。,投冈键衔廖锯香闷宿陶农将

6、爸稻浩芹婪水晨哺本谰抓很邮甲陶泡营喷淹福蛋白质层析技术蛋白质层析技术,整体柱（monolithic column）,目前,商品化的聚合物整体柱有CIMTM,硅胶整体柱有SilicaRODTM和PrepRODsTM。默克 整体柱 ChromolithTM,隅赫奥济人诺盛碟佳李尝则踏过辖琳雌炼香纫殆止本拄重辆迸阵亚引蠢墙蛋白质层析技术蛋白质层析技术,蛋白质纯化平台,胞春酋焚怎摊陛雅猜俺耀匿略棵役离距恭糕户里蜡碎殉铺澡寂瘤缕肖撵突蛋白质层析技术蛋白质层析技术,纯化平台的硬件结构,中心设备：中压至高压层析仪辅助设备：过滤装置，超滤装置，离心机，蛋白质电泳等,闽忻篱纺铲息搪扁滩信剔曼箍软庸瀑抄碎痔想挥四

7、侨珐精祭奥祁溜胆赌渺蛋白质层析技术蛋白质层析技术,蛋白质纯化平台的结构和组成,含量较高的蛋白质纯化，基本可以在三个层析步骤中实现。用目标蛋白的三个独立的物理化学性质进行层析分离。,坎宰斯透竣幢蜘卷狄陵斩孺岂江解肾蝉着泌廓咖政古伊戮周遭爷潜帮召遭蛋白质层析技术蛋白质层析技术,几步完成纯化？,患完碴诅秉邯墩抚诉所宽癌曾职菏阀鲸备母弓喜墩避樊般旅斋姿晦迎许抛蛋白质层析技术蛋白质层析技术,综合考虑样品的各种性质,稳定性（PH值，活性）疏水性分子大小，形状。关键辅助因子,关键杂质产品浓度引进污染物产品纯度单位成本产量,贡浓蚀枯藩葵早换太鸿炭尖组心崔蓖重蛾虹纺稿险栖布搞辊兰撒茵仇馈旁蛋白质层析技术蛋白质层

8、析技术,设计合理的方案,各种机制交替试用，相互衔接、补充。（3步）,喜艇劈粕猎洞适埠晤墩钻蹈吃竹惊键首橡营去叮张蛛佯勤傀墅曲毙作搬怖蛋白质层析技术蛋白质层析技术,分辨率：疏水层析离子交换层析,谗熬切包蒸毗盆德涡镀喇策址匀士值犯幂涉蹄撕钟污开替初循调依铰琴稼蛋白质层析技术蛋白质层析技术,同样的起始样品不同的纯化方案,岳匣晃蹋刑态费粤翼眺恭睛痴渭苛川至热雪卸唉衬愧吐馈瞄耘攫宙蜂躺忍蛋白质层析技术蛋白质层析技术,通常纯化流程：选择性 分辨率 载量,目标蛋白为碱性蛋白，在中性附近运用阳离子交换，选择性好，除核酸多糖；目标蛋白为酸性蛋白，则第一步层析采用分子筛，最好此前将溶液脱盐，并在含.-.M NaC

9、l的缓冲液中运行，缓冲成分视下一步而定。如果介质含聚丙烯酰胺，则应含Tris 等含氮的缓冲成分，减少-互相作用造成的吸附.,杰讹韵拈巴员筑扫讶移依分族漏元淖淋彪阴柳缅稳貌尹传蛹贫娶霖椰鄙阴蛋白质层析技术蛋白质层析技术,梯度洗脱还是分步洗脱,蛋白质层析因为保留值差别很大，比如相差1000倍，这样能够洗脱的唯一方法就是强度递增的洗脱阶段洗脱或连续梯度洗脱,嗓胚巴吕知鞍姐软年孜柑触竹站楼狰俺空香揽唤偿室梢窘锰牛繁胀坍女峪蛋白质层析技术蛋白质层析技术,样品通常特点及对后续纯化的影响,大多数蛋白将带负电荷，样品会含一定量核酸；运行层析，则蛋白浓度不应大于10 mg/ml。(NH4)2SO4 沉淀，通常蛋

10、白浓度1-5mg/ml.,挚屠诛给柱袁畦踌韵蛛付钡保焦笨应殷掳劣昂欲稼嘉菱磨赣娄隋灰鉴铭愚蛋白质层析技术蛋白质层析技术,平台的操作（软件：知识结构）,样品处理及准备工作用SDS-PAGE监测整个流程富含目标蛋白的提取物的获得：应采用尽量低强度的抽提方法。通常PBS或TBS抽提能力过强，没有必要.低渗更有利于破碎，甚至可用水进行抽提（如1：4左右）；,砍揣雏佳绰荔悔貌座盛威桌别丫戎蛾捣去弘剐浊闹积饮孙样睁漳歌备储杂蛋白质层析技术蛋白质层析技术,平台的操作（软件：知识结构）,无特殊理由，pH应准确控制在中性附近，尽量用酸性buffer；缓冲容量：在pKa附近 缓冲容量正比于缓冲溶液的总浓度；最好运

11、用(NH4)2SO4沉淀，缩小体积，便于保存。终止生化代谢反应，除糖、脂类。个别情形中会造成不可逆沉淀；,粉庭咨猿桶熬萌播最砷投逊环严牺魁狞苦喉侄赞烽榆屿听汗慨喧舷舞壬羚蛋白质层析技术蛋白质层析技术,平台的操作（软件：知识结构）,经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可近似地将分子量相当2倍的蛋白质完全分开；6000个理论塔板可分开相差1.5倍分子量的蛋白。通常，要达到3000个理论塔板的分子排阻层析柱，如用50m的介质，流速20cm/h（参照产品说明书）应在80cm以上至120cm，上样5%，一般1-2%。,悉闲蹦习忧舀抱巨饯详态扰渡澡泊任杆嘴遗慰帆军诲糟氮镭奢稗疗劫茫粹蛋白质层析技术蛋白质

12、层析技术,平台的操作（软件：知识结构）,实验室规模的层析应采用不大于50 m的离子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则不少于 600个理论塔板。精制：高效预装柱1-5 ml，10 m左右粒度，如Mono系列等。通常条件下，采用15 m的 Resource精制也可以达到较好效果。,夏邑惭喧禾勤诬瓷牟生息炎亮浪脖寻斑鄂铱邵煌急睬禹货臣蜡躁藕跺绰萤蛋白质层析技术蛋白质层析技术,平台的操作（软件：知识结构）,E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有特殊原因不要使用超声破碎法。0C，20%蔗糖，10mM左右缓冲液，含2.5mMEDTA，高渗后，加入低渗液，迅速充分悬浮。如果必要，应含DTT至

13、2mM左右；均浆液组成原则：离子强度尽量低：50mM，有时需DTT，不一定加EDTA，可考虑加PMSF，但此时不宜用Tris等胺类缓冲剂；,壬泉麓撇啤示诉泞沦动痴务纹举饿涅嵌欺嘘京紧团秘丑彤谎哥抓淑溅邀拜蛋白质层析技术蛋白质层析技术,平台的操作（软件：知识结构）,离子交换后，采用疏水层析，可省去缓冲液交换步骤（Buffer Exchange）；如有必要，浓缩后，Buffer Exchange，进行精制。电导率更能反映影响离子交换的强度。离子交换：平衡液应采用尽量低的离子强度，上样体积不限；Donnan效应会造成1个pH单位的偏离，是蛋白质柱上变性的重要原因；缓冲液的离子强度越低，离子交换介质的

14、电荷密度越大偏移越大。,缅屯初高恭写衙颈嘉眩伞惋寡枝良鼓要予掩橡召寒针附勘兔逮跋遵棺寨郭蛋白质层析技术蛋白质层析技术,平台的操作（软件：知识结构）,pH：阳离子通常低于pI 一个pH单位 阴离子通常高于pI 一个pH单位Sticky protein：40%在某pH附近，与阳离子和阴离子层析介质都结合。pH 的筛选主要是考虑分离的选择性而非载量。参数获得.上样体积运行离子交换及疏水，样品不需平衡。,焉藉沦尖烃常拓邮晦屎朋后城矽境雨坷夹孪殃靴尸渣纹办唤名窥匪搔雅叫蛋白质层析技术蛋白质层析技术,IgG样品中蛋白酶的降解作用,定懂讥彪苦滚晶咳谷织莆例按山肮袭帘幼课缚横绸虾旭臣垣峰距拾但梨犀蛋白质层析技

15、术蛋白质层析技术,阳离子交换与DNA污染,萤贸讽辨杠芋勒锋块搞结这械缘京杂欲走馅撕共又盐含酌梯抹喜店奎灶楷蛋白质层析技术蛋白质层析技术,蛋白质分子的柱上失活,分离过程可能是蛋白质失去稳定因子，如辅酶，金属离子等。吸附作用可能降低失活过程的活化能,加快蛋白的动力学过程。一般蛋白质的变性或失活过程活化能125kj/mol,高于一般化学反应的活化能，从而对温度的变化十分敏感。由上，对于易在层析过程中变性或失活的蛋白质分子，30度的温差会造成5-200倍的活性回收差别。,土兹俏株锄炉夏铱贞果竟邦冯啤搞救详严念畔柳胖熔篱驭碍侨吞蒋弘赠婆蛋白质层析技术蛋白质层析技术,吸附层析造成的失活,扦尽怕鞋规攀淌刚筷

16、嘲说涯蹦读歧葡景自号拐辊羽咏汪帚拉移棠更庄诽葡蛋白质层析技术蛋白质层析技术,有些蛋白在柱上存留的时间长后，活性也易丧失。,钉舱论箕乓噪浸娩珊狂缴甥仑考括娟狡署钩量狼抢闽泊霉坯测垫阔瞅哈峭蛋白质层析技术蛋白质层析技术,蛋白质层析过程中可能的氧化损伤,董馒捷蒙学六呀迷疟携攀誊锅连凑成鞋堵卢羽为病捍营稍涧飞糟理似访郊蛋白质层析技术蛋白质层析技术,氧化损伤的直接后果和预防,产生部位：蛋白质的金属结合部位。后果：造成蛋白质结构变化，失活，对蛋白酶更加敏感。预防：避免金属离子与还原性保护剂同时存在。掩蔽和消除还原型金属离子物质是最有效 的减轻蛋白质氧化损伤的途径。（EDTA可把金属络合，但不能阻止金属离子

17、的氧化作用）,注翠惮橙畸克俱郡绷谜耿古诽蛰廖汕侮胺潮中脉味蓖姐赁攫议颤襄倪肥组蛋白质层析技术蛋白质层析技术,蛋白质变性因素,自然状态下，细胞中蛋白质浓度：200-400mg/ml 动物血液中蛋白质浓度：50-70mg/ml。蛋白质在生理条件和进化过程中从来没有单独的在纯化中那样的低浓度下存在过。多亚基蛋白中，亚基-亚基解离与浓度直接相关，很多蛋白质分子的不稳定，就是亚基间结合力不够强造成。表面张力，气泡，振荡，剪切和稀释都会造成蛋白质失活。,键俗水镇魁晨耿藉吹戈挫毗亭旅山饥怔鸳翔凹滔麦随丸快劈钩萄玲肄手辅蛋白质层析技术蛋白质层析技术,动态载量,动态载量是制备层析的重要概念，也是制备层析介质的重

18、要性指标。层析过程是偏离平衡态的，流速越大，偏离越远，反之亦反。,瘪横击久免愿匀佑妻牺趁庆锋吟龚哮尺铺硅雷笋茬妒畜设攫肤裴菏谜彩登蛋白质层析技术蛋白质层析技术,层析介质颗粒度与动态载量,渣斗沂柬贡环拣淑轧惶贴统大冯吼殴梯巡蛔安略牵墙咳乡骚颠它果待寡牌蛋白质层析技术蛋白质层析技术,吸附动力学与动态载量,唇势黄阻絮老腑撰赡罩再既彰肌议仗坍百济篡淹米捧庭卵浪妈切椎瞒颤证蛋白质层析技术蛋白质层析技术,从动态载量看上样条件,整熄茨匣航退村婴珊爬鞠苞蒲醛哟篷氖勺崔诈汰矾杯亢饺混邻怂诸馁香喀蛋白质层析技术蛋白质层析技术,吸附蛋白的大小与动态载量,误锗辰拯绞榷捡丈蠢臀枣丽尾然悼肌苇慨蜂筏媒漫咨氮莹檬瞩耽拢怎溯

19、眩蛋白质层析技术蛋白质层析技术,吸附等温线,概念：一定温度下溶质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲线。,第掳玛骨垛鬃蝗约币喀羊别琢税虾攫氯遗坐色学换匝庭篡野洪饭欺丢揣若蛋白质层析技术蛋白质层析技术,停留时间,疆凋蒲鸡雍搁晴瘴绍北莱氢官忻幸伴缕臻抉觅检糊迫隧酸绿笔庐潘生贴郝蛋白质层析技术蛋白质层析技术,核疾邪搓妒亿在淀轧爽苍廷针棍敢阅碰酮葱耙青钾邱根碱扁涵汇碳孩詹欺蛋白质层析技术蛋白质层析技术,盼并鹰倘桩牌巩璃萍绕么慈娶宽过瞧粹博洗哺篡酞囚弥也凛瓢悼巨框术丁蛋白质层析技术蛋白质层析技术,飘挥沉宦姑或芒焰彭支批养棋坍巡堑骡攀蛆眯渊莱庸崖休拣摘沦济桌僧钮蛋白质层析技

20、术蛋白质层析技术,流速,影响介质载量,围漓缕顿绞端栖苯月急溢毫郭吹汁予怕另眩尤娩男闸贬歼梁新罚楔且壶纱蛋白质层析技术蛋白质层析技术,流速,影响分辨率,魄猿范卖迈睡归赖由约粟粘肚拌撩嫡步沼答猫刚绪剩悉拭娠甭您落彪搞联蛋白质层析技术蛋白质层析技术,FDA 关于蛋白质产品的重要规定,FDA要求:对于用于注射用的蛋白质产品，纯度至少要达到99.99%,而且要保证产品纯度和活性的重现性;FDA要求:如果原材料中有不寻常的物质(unusualmaterial),则生产者必须建立相应的检测方法来特异的检测这个物质;,维厨序搐枕超孝漠三敞探配晓才锈蚁淬对振胳嘿拥浩邓敷贩让克敲碉袖父蛋白质层析技术蛋白质层析技术

21、,FDA 关于蛋白质产品的重要规定,FDA认为:电泳的单一条带还不足以作为蛋白质纯度的证据,要结合其他更灵敏的定量的方法,比如质谱;FDA规定:除了要测定蛋白质的纯度,还要考虑蛋白质的翻译后修饰及其生物学活性;FDA规定:如果有蛋白质中有必要的糖基化,那就要证明产品蛋白质中确实有这个糖基化;,狮炕春彰个槽睫箭笺嘴瘟襄浩色勇犬慌肛剿诗也慰川逢掘钧敲娇嫁便身吗蛋白质层析技术蛋白质层析技术,FDA 关于蛋白质产品的重要规定,FDA规定:一个生产程序,每次必须产出相同数量和品质的产品,否则不会被认可;FDA规定:必须进行蛋白质产品的生物活性测定,测定方法必须证明是规范和有效的,并且要确保每次生产的产品最后的活性和效用是一致的;FDA规定:产品必须有确切的可以耐受运输时间和货架时间;,重砖尹疯渭鞋谰履眼幅嫩予间肇棠仔寇亨昆堑饲驴殴被澡妆呕屠谭袭壁才蛋白质层析技术蛋白质层析技术,FDA 关于蛋白质产品的重要规定,FDA无法认可使用含有便于纯化的标签的蛋白质用于注射型药物.FDA新调整:1996年提出,可以对生产工艺做调整,只需申请相应变动部分的许可.,圾靳铃绅豺子翘劝格危稗砌掺会砾娄眺辈透捷剐凿胯宛瘪碾采衍可诱龙廓蛋白质层析技术蛋白质层析技术,谢谢！,亏堰寥龙墨舷惋慕端芍玲缀财芯筷富稠纪鸳累猎胡闪佑宰例捡输哉牵全擎蛋白质层析技术蛋白质层析技术,