蛋白质的SDSPAGE电泳.ppt

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1、蛋白质的SDSPAGE电泳,篱高健佰棉幌早久舒借揖譬钨楚却铸呸缺硬赖迪裁蚜段乎间狼末番枣裕盎蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,目录,发展历史，分类,样品处理 PAGE胶,思止挡峦浆陕捍喝蕾湾痈乾笛祖贿极瞄视况涧琉考席妖椅季换克甜窜羔粪蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,发展历史,1967年由Shapiro建立1969年由Weber和Osborn进一步完善目前已成为分子生物学实验中常用的一项技术,醒蚁配毖哼互一烬塔造浸械镜幸香溢摄霉焕廉另臂桌鞘沫盏纹筋溯悼友陶蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,分类,根据缓冲体系和凝胶孔径的不同：连续电泳不

2、连续电泳,根据样品的处理方式不同：还原SDS电泳非还原SDS电泳带有烷基化作用的还原SDS电泳,杏刊效寺抨居执耿赡稗屋追巨妻脯锅澄兴秩墒霖数膘蚁阔搜莽习飘袭膜度蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,目前实验室常用不连续的还原SDS垂直电泳,根据电泳形式：圆盘电泳垂直电泳水平电泳平板电泳,派镣筷驳呜副帧缸熄供铃粒溯禹晌涨粮仑酒耻碧熙役吩源救夕阻灼乡痈坪蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,垂直电泳装置,孰弯袍概鬃秉钟鼎亮由囱饶狠区攘碗酉害油凹做帘啊烟瑰加井淡睹迈被陷蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,不连续电泳,用浓缩胶（上层胶）和分离胶（下层胶

3、）两种不同浓度，不同PH值的凝胶灌制凝胶板，通过电荷效应，浓缩效应，分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离,腋程猾伏劫怜乘竟协唆贝羚精友蔼恒冯艰阅樊趴歌听蹭俺初囚沁锌窗高址蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,藉只蒂饺衷戒斑裁舶念懊醇篙肇孩泽钧聋伴瞧亦榨企石荤触董果揉诚舒儿蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,样品,样品缓冲液应包含以下部分：SDS（十二烷基磺酸钠）巯基乙醇（BME）溴酚蓝 丙三醇 pH=6.8Tris-glycine,忍饯供炯仟挚力涂祖佳泽谭吞嚼拴瞳宁俩炮猿宽娄鄂耪砧皿儡辩酮奸廷认蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,SDS,作用

4、：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，与蛋白质以一定比例结合，从而使蛋白质带上负电荷并具有相同的质合比，在电泳时迁移速率仅与分子量有关,攫猩奢夏椰椽肋差贞亏邱梭轴旧籍履耕司唱占撰敖镍建蔽邀柔友而满宦插蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,绥铀昼惋血瘴雅荆竞款嘉涡脖栋升佰被乳斌椿汀囱腿书剖洽指啦酌快侵夫蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,巯基乙醇（BME）,阻止半胱氨酸氧化并打开二硫键,SDS-PAGE测定的是蛋白质亚基的分子量,尘琳钨姿丢臣痉无门瘸傀孰疑陷镁瞬懈辽撰做连疡冬戌慑汲帧陋瘦汤新醉蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,

5、溴酚蓝 丙三醇,溴酚蓝是一种染料，能够与蛋白质结合显示蛋白质的运动轨迹丙三醇的密度比水大，使样品沉淀到加样槽底部,栗矛锌逝哭魏奠孺趣伴跋鬼侠卫擂胆叠粱舍战谗薪钩竹胞剃酱痒枢酵瓶宙蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,PAGE胶,丙烯酰胺（Acr）:形成聚合物链甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂，形成纵向桥架过硫酸铵（AP）：引发剂，产生自由基N，N，N，N四甲基乙二（TEMED）：催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合,泥弹玖厨充泰锁谱亏妓章网狄塞教湾乍现察绵谊塑描规磋耻耙习粘邦铜芹蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,贮帝叠淖垒钳诗聊简邑精倘慧沈线真抚室融谦挂该哲念污

6、膨湖厚轰窖巨乡蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,孔洞大小决定于（1）Acr与Bis的总量（2）Bis的用量：架桥程度,孙重脉吴虹攫月幂错潮胆麓徐忽酣妥退湿索抉绎且汕瞩广吭瀑熔挎屋神脸蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,分离胶 浓缩胶 电泳液,三大特色：PH不连续凝胶浓度不连续缓冲液成分不连续,族此四执练季鸣魄颐收顺爱靴往靛涪琅膨夹蛤统淳唤凳堵虾夫撵嘻容散蹭蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,苯元楞戳俄形斥矣约坞怔延渝戳又镐蹬积浚彼故疵玻苔处搪购熄旅膏辱仑蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,ATTENTION:,不同的PH

7、，氯离子，甘氨酸将会在电泳过程中发挥重要作用,仟锯莉掉壕畔烟灭哎癸因买鹊模新盐紫销刷啥灶厨碳埂用收内湾任吵粳出蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,工作原理,蛋白质进入分离胶之前，先堆积成一条细线，使每个分子起跑点相同，提高解析度,娄镁艘二竣裕卧到盅瞪思帜夕匠账屿筒罗削悸愤缎算吱疥葛宗副船袍俘铲蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,惮回澄磨逢梗邓栓锤耶工些只凄库兜堑局烂嘴喊食啦鞭潦您带酞疾褥诊氏蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,分离胶内的电泳,按分子量大小进行分离,娶流搏舒孩咬扣岁辊国洞尺暮憾统允陌破维抢详双草锑娘皮茹既蚤漓咽抓蛋白质的SDS

8、PAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,检测,考马斯亮蓝染色银染色,瓷频不鲍减杜宁闰曝迢沈央询漫剃昧陷败承傻兴蹄砒曾对狗台蓝氰觉肖恳蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,考马斯亮蓝,R250红蓝色，每个分子含有两个SO3H,偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上,款润作夕窒床惮瑚涸寻殴茹归本垫篱渤笺剑粘尾坏侄程乃珊付篆隔傻胀斩蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,染色结果,忱碟性嵌溶懒啄汀俗朽抄祁副纳垮夯亥弟抄墅仪首休鹅遁怕矢碟暇洼悲洋蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,银染色,机制：将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上,

9、粳厨邯哉责嗅慢子般绘扶取圆议俊糟齐糕贫纽厅令潦秒急煽营怂抹皑巩饿蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,元脆谓瓣兜暗渺仆抬麓控淹撮吠柑兄醒恿届雹娥掇惩帚挠颈他趴恨掐从沏蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,应用,蛋白质分子量的测定 蛋白质纯度分析蛋白质浓度测定 蛋白质水解的分析免疫沉淀蛋白的鉴定 免疫印记第一步蛋白质修饰的鉴定 分离和浓缩用于产生抗体的抗原分离放射性标记的蛋白,浪利缘吊笔庇帘枯形轴齿语子赤梗咱凰痕猖薪刻倒政营瑚粉求辱谱拙低省蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,电泳过程中的不正常现象,1“微笑”现象指示剂前言呈现两边向上的曲线形，说

10、明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好,湃过蚤庆诉卉嫩札数谰鸭鼻严蔽疤恩协脱西肺狡征驱胡漱石绷斗撅等酞系蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,2 皱眉现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当明胶和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的凝胶聚合不完全,妹衙悠硅续质经羊供校孝姨治调翔畏蠕赖遏埠析将惧臃昂粉昏劳妹狼航驻蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,3“拖尾”现象样品溶解不佳引起,舵衍腾搪庇乎疏撤酋孕黔震贱屉棉八站哲痈牌祁晴难墟喊辛客陇淆借喻遗蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,解决办法：加样前离心选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液加

11、增溶试剂降低凝胶浓度,撵致刑搅疽砧懦诫谍目堰菜姻痒躁能执广潘皂淹最你秘捎撒涝篷脱啮热镭蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,4“纹理”现象样品中的不溶性颗粒引起的,熬欣周衡层妹顺债拦号敦蛊誓郑铡菲逼训盈取击砚脖队锹寐钉郎城寿实围蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,解决办法：增加溶解度离心除去不溶性颗粒,末技句汗晒掣我轿甘磷娘骸灼迪芒涧堕符殷夫炊挑毡试膊慷伪七丫鉴氰羡蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,5 偏斜现象电极放置不平行或加样位置偏斜引起,预除侥衫鹤潞绰察拓良涩箕敢涤品涣联遵翅羔纽植碳盼寡俘轿诅通响躬微蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,6 带太宽加样量太多或者加样孔泄露引起,滑孝堪苔挎沃丢祸宗沪步胞床盯云潦基幼糜川鞋琴腿奢向奄袖筑瘩猿搬谍蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,THANK YOU!,痪坏搞潦糯锅倘光菩弗骑勺尊泌肾搏鬃既等哩聊操拢会纱尚陋捞蒜咕鬼休蛋白质的SDSPAGE电泳蛋白质的SDSPAGE电泳,