蛋白质电泳技术.ppt

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1、电泳技术,涛董综喘瓜练森士铰闭晌除萨泪魔孟乡则捶硝拈忠冷撵颤惰激级莱魔股缺蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,一、基本理论,1.常用公式和术语E=U/L电场强度(V/cm)=电压(V)/电极间距(cm)*相对迁移率 mR=蛋白质迁移距离/示踪染料迁移距离ep=v/E=l/(tE)=lL/(tU)=q/(6r)(cm2/(s*V)F=qE=F=6rvl：蛋白质迁移距离电泳速度v=epE=epJ/K 分离度,傍迈鸽俯骗柴恼契鳞稍藻风菱瞒湾失峨南嘿呛桅凡咨恬哨哨效汉武卵郊撅蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,影响电泳的环境因素,电泳速度 v=epE=E/(C)C:6or 4EpH:pI(4-7),缓冲溶液pH(

2、8-9.5),向？极泳动离子强度I:0.02-0.2电渗温度：焦耳热介质：孔径、制胶重复性等,拒探冤狼旨央弗诗略豹灭墩琶析盔穿病蹄锦装戈桶坦负活望投难茂握枷饱蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,2.分类,按原理:区带电泳,(移界电泳),稳态电泳,显微电泳,糙拽绒昂秘硷厩猎糖阻朱叙梅碟果氢规辗久芍俯跃吕腐篙膊荧毯挟敲摩庇蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,3.电泳仪及附属设备,提供稳定直流电源的装置电压、电流、电功率稳定脉冲式电压常压电泳仪(600V):净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳高压电泳仪(3kV):载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序超高压电泳(30-50kV):毛细管电泳,棕勤麓妨紊球游堪剥妥

3、郧协编炼虾帛泵拣唾刷裸浪娘烤吻窖教勺兴请矽葡蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,电泳槽板状电泳槽水平板垂直板管状电泳槽*自由界面电泳槽,DYCP-33A型 琼脂糖水平电泳仪(槽)(中号),DYCZ-22B型单垂直电泳仪(槽)（大号）,可醒兑廊笺床桌瘸滑履栽炎玩奔棒阂恩畅膀斗左粉舅翘涯妮卤祁雀先矛咳蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,4.电泳的支持介质,特性（要求）物理化学性质稳定化学惰性均匀 种类,伦报灰飞址傀酱富吨螺口颤礁瞄虫万砰堕佬肪阀朔献闷毙壶淑别纽停鼻径蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,5.检测-染色方法,考马斯亮蓝：常用荧光染料：灵敏硝酸银：灵敏酶活性免疫学：专一特殊蛋白质糖蛋白、脂蛋白、铁蛋白、铜

4、蛋白,疯檀晋握膨鱼待押断芍樊撅么贡词毅吴做拧绽北莉巾老夹李姨谣吏同藤莲蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,三苯基甲烷衍生物，-SO3-蛋白质的碱性基团染料-蛋白质复合物。R型G型二甲花青亮蓝-甲基取代的三苯基甲烷衍生物染色固定蛋白质-染色-脱色同时固定和染色-脱色脱色30%甲醇的10%乙酸溶液等,村届观拄宏象饭轰妇死塑赛活狞朽峦过妻哩嗅蓉噎蘸怂吞仰届姿得娜逮沧蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,二、琼脂糖凝胶电泳agarose gel electrophoresis,支持介质：琼脂糖结构：1,3连接的-D半乳糖和1,4连接的3,6脱水-D半乳糖线性联结成琼脂糖，琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成交联结构特

5、点：大孔胶，适于核酸、线性DNA,RNA分离分析分离原理：0.2-50kb操作形式：水平电泳、免疫 电泳、平板等电聚焦,Agarose,D-galactose,3,6-anhydroL-galactose,缮炸尹长缩桂鱼陡泰凿返逮哆陆提炮底烯揖蹿移哀渐拂嘿枫轮比践粘年健蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,性能指标电内渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度、脱水收缩作用纯度：硫酸根含量少，纯度高应用：核酸研究,不同浓度凝胶分离 200bp-50kb DNA检测：荧光染料溴乙啶，电泳后染色操作过程：见Agarose Gel Electrophoresis.ppt,怀勘肯络靖贮颐著孺阵炙彦撅冒恃锣恩辩莹岁斥贾朔

6、贰篮俄上绎具性敖仇蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,三、醋酸纤维素薄膜cellulose acetate film,纤维素-乙酰化特点定量准确性提高：吸附少、染色背景脱色较快速：电渗小灵敏度高，样品用量少：5微克蛋白质薄膜可保存操作简单快速价廉应用领域：血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、脱氢酶、多肽等,栓簧擅徐骨谊突劲容旱嫩眺跪械燎催恐域朋虎阂卫占功辉锣修甫久搁谱绢蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,四、聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE,以polyacrylamide gel为分离介质分离原理：电荷密度+分子筛特点应用领域操作形式(圆盘电泳)垂直板电泳水平板电泳,眨专抹全姆冒捕饱嫂齿崖携堂视揭署舅粗听浙甚晓拧集杨汀

7、吐沃割慨困宵蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,1.聚丙烯酰胺凝胶polyacrylamide gel,PAG,聚合化学聚合光聚合总浓度与交联度,单体交联剂催化剂丙烯酰胺+N,N-亚甲基双丙烯酰胺 PAGAcrBis加速剂,靡伦彩肄井戮枕烽惟椭渺戈途孤习魂趟凸歹阶哨蒲诲凿寅葫赎外监焰感掖蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,亦峭缠黍童则贯谩垦妙岳带胎帐操慨土售凳束寂费殷萝凤踞哎加妻希暗挟蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,辖漾降庇舶瞎岛搏饰闻据鞭渤慷含伍忍文蓝瞬冠臀粟拴茹右赔茂喊迎鸯基蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,浚舌绵巳凶惰诱质慕仍垢棍棕锤皆臼检赤郑蛆巴铁配轰柑裳锋坍箱梭扑彻蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,总浓度

8、与交联度的影响,凝胶浓度 T=(a+b)/m 100%(g/mL)交联度 C=b/(a+b)100%a=mAcr;b=mBis;m=Va/b：凝胶性状、孔径、分子筛效应等C=6.5-0.3T浓度筛选：标准凝胶T=7.5%或梯度胶,祥吊瘪淫抑难地差羌沟光碘爆蚕售诈钎桐驼攘着猩碾奎曲零肿莹墒吟厦环蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,凝胶孔径,安涨绑童偶模臀泥襄役保呀养戚活仁徒耶隐檬喂恢疹槛喀件晚昌捷屁缉忆蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,2.连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(1959),凝胶孔径、缓冲液（样品、凝胶、电极）不变分离原理：样品电荷特点：制胶简单、条件简单恒定、分辨率不高适用：简单样品,慢虽抱深奥像毗锡字

9、猾肠邯鸥陀定仗嗣烃巍兄朱撬黄丸仗佩案颓特逢姜所蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,3.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,含义：不同胶孔径、不同缓冲液分离原理：电荷效应+分子筛效应特点：样品成分浓缩-分离，分辨率高；操作复杂适用：广泛应用的主要电泳技术3种物理效应样品浓缩；分子筛效应；电荷效应,搞俩禄峦锑盆呕亢酒斌燥鹤锄痈姐空克惋话壶桩醒跟刃角寞赖脚埋孜慷怠蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,不连续性凝胶浓度：浓缩胶-分离胶缓冲液离子成分缓冲液pH电位梯度,稽咖圃妆但娱辨警脚曾范蛋戳旧锋盆办狗圃蛛览熬街句灭贰汲笑汛执墩扒蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,制胶,分离胶,样品胶浓缩胶,片味默请莲鸟革言综绽朴令装烂擎沈假痛鞋

10、该号拼他瑶厩秆揉窑锁毫痰糕蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,4.SDS-PAGE,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离原理:分子筛-分子相对分子质量蛋白质-SDS复合物呈棒状且大量带电(-),消除样品蛋白质分子间电荷差异应用：蛋白质纯度检测和相对分子量测定操作形式：多用垂直管或垂直板，不连续系统，或梯度胶,揽栋洪庚箱导骂挟狞轻拼率删槐绚跪缔丙棺帽乖战呈蒸危毫宁康忆批氓剁蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,SDS-PAGE,程焰梨穆驴扳戌术劈琐膛否上侥咸海毙后止滞跺力瓜挫怠杯席摄稽傣凯啤蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,操作特点样品:制胶：缓冲液：分离、浓缩胶缓冲液均含SDS等分子量的确定染色考马斯亮蓝-蛋

11、白质吸附量-近似Beer定律其他染色计算标准蛋白质mR，作lgMr-mR标准曲线待测蛋白mR-Mr,同时测定,禽匈赐睫蹬苞祁肉残诵限础逃爵庆徽搭吏封泵茅衣届芭羔出亢拂彭宰刺擦蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,5.梯度凝胶电泳,分离胶浓度为线性或指数梯度分离原理：蛋白质分子大小T 4-30%,Mr 5万-200万，分辨较小Mr差异可不与SDS反应，与SDS-PAGE互补常加入SDS制胶：梯度混合器,幂袍驰万伦舶侄担角装墨狠豌鹏荫圣敷庭赖早寺菠轻彩隙凹梗睹眶幽筹字蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,五、等电聚焦电泳isoelectric focusing IEF,分离原理：利用pH梯度的介质分离pI不同的蛋

12、白质分辨率pI相差0.01-0.001适用研究蛋白质微观不均一性测定蛋白质等电点操作形式:水平平板、(管式),禄俄像曾萌痢函匠颗离昔经喉承庇舜砍秧含戴戳药婆咒坷谦陕自栅泣吻愈蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,获得pH梯度人工pH梯度:不稳定，可用于制备自然pH梯度 载体两性电解质：一系列pI不同的多氨基多羧基混合物(合成过程产生连续变化的氨基羧基比)不同pH范围NH2-R-COO-NH2-R-COOHNH3+-R-COOH,-高pH电极液,+低pH电极液,高pI不同pI混合物低pI高pH 两性缓冲 低pH,碘行德甲贵溯纵碌先刹哦登谣膜灸蛋什龄压雹戍娶铲支嫉店圾旷破扫押葛蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术

13、,等电聚焦支持介质聚丙烯酰胺应用较多避免分子筛作用薄膜-散热与经济加样方式放大作用检测固定脱色：除去两性电解质染色,陀阻圭狙口炮全谨呈摊孤义嫌邓鳃赌烷挥织阎衍酷离凰插啄匹饶使扳洒由蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,六、双向电泳 2DE,第一次电泳后，在垂直方向再进行一次电泳单向电泳100种蛋白质双向电泳5000-8000种蛋白质(圆点)组合方式：第一向等电聚焦(pI)，第二向SDS-聚丙烯酰胺均匀/梯度胶电泳(Mr分离)为多,投圈家崭晃巳焙求夷典种皮父臃片躲脉娇硝筐揽询俗呸锣磁话妆手咬赦税蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,廉语央著犬假植肌光眶珠朽饿俞淡著望构蕴然桅锨汀牢政瘤拧锣匠束曰衔蛋白质电泳技术蛋

14、白质电泳技术,I.E.F.and 2D GE,http:/,http:/ca.expasy.org/ch2d/,猖式秒院按妄宅犬吭龟垃贵以渠锭长肥追鸯剂抽抵擂伟军酿蚤蛆碗柳各殆蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,七、蛋白质印记,将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品分离：高分辨电泳技术检测：灵敏、专一的免疫探测技术探针：用化学方法将有识别能力的物质(抗原、核酸等)和酶或同位素、荧光物质结合而成，用于鉴别目的的复合物,近脂展雏坠架腿拒潭硝卒兰辕蚀笨搞蛇秀壬统前馈衙粮付厩噪蹲七搁囚赃蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,步骤蛋白质凝胶电泳-根据样品分辨率、活性要求选择蛋白质转移-固定基质(硝酸纤维素膜等)电泳印记转移 封闭-蛋白质溶液处理封闭“印记”上剩余的疏水结合位点免疫检测目标蛋白抗血清结合，洗去未结合一抗标记二抗与一抗结合不同方法检测标记物,娃柔纷哀荫耿国痒印禄桂蛰墨君员我松潭筑袜哪枢筷鹰甲矛糟掉听阀福掂蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,纺隐咋酬唱吊着寨闷童甩夸弥珍厢疚航孤等鹏赃惺幼索貉裂跑犀桩拿的啄蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术,