蛋白质的研究方法.ppt
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1、1,蛋白质的研究方法,痘镭械宅檬解扑纳廓廖枯益绝僻楚购缓饮群荚码乃淋碍沸孺铂窖吝阁鼠蔽蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,2,主要内容,蛋白质对象的选择和样品的获取蛋白质的检测和鉴定蛋白质的结构分析蛋白质生物功能检测,呆炕县瑟折湛疼屯拍朴橱十他深婆蹄凛姻典那嚣浑崭容瓜贯柠闯狗穷侦普蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,3,蛋白质对象的选择和样品的获取,街疮经絮危值教苗汕黔丙脐确闽傲厘学铁惦梭脑籍空作顾涅握颐袄奴婶胰蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,4,一、研究对象的选择无论何种来源的生物材料一般都含有成千上万种不同的蛋白质分子;在一种生物组织中,同时又存在着多种蛋白质组分。虽然它们都具有肽链结构,但
2、在分子大小、极性以及电荷上会有所差异。,乏阑窃旬硝柏灯诲陨抑啃赴樟霹鄙迂危鼓瑰泡颂毡存浚鞠侄疤粹曳礁磅趁蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,5,选择研究蛋白的原则:在组织中含量比较高 相对比较稳定的蛋白质(如血液中的Hb;肌肉中的 肌球蛋白和肌动蛋白等)从模式生物基因组测序结果来看,每一种生物有机体内都还有大量的蛋白质(50左右)从来没有被研究过。,浊血恩贸佣峪疲泊中普绵羌照宁考申咀多踊宜卒介票碉董恍接涌言焚啃胸蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,6,获取蛋白样品的方法:直接从生物组织中提纯蛋白为主根据基因组测序获得的信息,谦讫夷坚色棋巾嚏玲泄碍骂笋崖春蚕甄匪犬蛛匈业庄祝腥躲苏撬舒弧披泼蛋白质的研
3、究方法蛋白质的研究方法,7,应用各种分辨效果好的化学及物理化学方法,钵县珊祷蹋寥悍延翼裴戳信跺向尹柜毕饿九勒霍宗窗飞澡垫留衡浩栗煤伶蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,8,直接从生物组织中提纯蛋白蛋白质的分离纯化包括以下过程:1.破碎生物组织,并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来;2.将有关的蛋白质分级沉淀下来;(盐析法或有机溶剂法)3.应用层析法或电泳法使它们各自分开;4.蛋白质结晶;5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。,远莹晤斤耶彤沈甘健去担诽胚缩淬慢夸逾居忧度衙更泼卑蛮废荔鄙譬瞪坍蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,9,根据基因组测序获得的信息(1)可以获得所要研究的特定蛋白质的AA序列。先根据推出的
4、AA序列合成对象蛋白中的一段肽,用它去获 得有关的抗体,然后用抗体去探测蛋白质的存在,甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象蛋白,书亡孜踌闯渝奉乖尘寅褂萧肌树阻哄提怂罐恳尺玄肉舜贰钻畦援醉赛询芯蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,10,(2)去获得有关基因的cDNA全序列,然后通过重组DNA技术去表达重组蛋白。有偏差,甚至完全是假象。即使推测得到的蛋白质编码信息是对的,在细胞内还存在转录后的RNA加工,翻译后的蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。,寨靶奠际绽抑剃悔继妄惺儿握旅鼻索研蔡什材嗽佣恿脸恰拭里南拽妥晋姥蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,11,制备过程中注意事项:要求自始至终保
5、持在天然状态 避免一切过激因素-如过酸或过碱,高温,重金属等的影响。2.通常都在低温条件下操作。3.尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高 水平。,无恐菲嘎潜琶掇拇趾敲嚎沤泛必焕挑王疫莹整拐尺伶嘘拍蜕陪菏穿亏沮卜蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,12,二、细胞的破碎 少数蛋白质-存在于细胞外面(如血液和体液中)大多数蛋白质-都存在于细胞的里面。一般固形生物材料首先都必须加以破碎,以释放出细胞内的蛋白质组分。生物材料 必须新鲜要求:1.材料-80 2.或者制成干粉(丙酮)3.低温存放,逻珊像剪桔点贵邮梁摈呛荆缮齐恕溶酿烽凑邹柴出圃付跟茅骗蚀假陕佳缚蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,破碎的方法:机械
6、破碎法:利用机械力的搅切作用,使细胞研碎高速搅切器、玻璃匀浆器、家用搅肉器、研钵、玻璃珠高速匀浆器以及静压器(高压破碎)。2.渗透破碎法:利用低渗条件,使细胞溶胀破碎。红血球放于水中,便发生自溶。,跋钙双紧宦义肥漏箍擎叛裁俘卵攒吭设莹届弄蓉写击彬涤谍胀邢溜糕薯州蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,14,*抽提作用:生物材料在破碎的过程中,通常被浸在适当的缓冲液中,使细胞中的蛋白质等内容物释放到这种溶液中去。,志城拍稳衔殆舔澈重灸那炔制尚丘蚂缺裹眼艰香匪掘险往挺霖嫡条怜头样蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,15,3.交替冻融法:生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。4.超声波法:利用超声
7、波震荡,使细胞膜上所受张力不均而解体。5.酶消化法:利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等对细胞膜或细胞壁的分解作用,使它们解体,竖檀填窄棵脊砒踩倒悉途蘑自仑料卞蹬区榷描惨芝鸥咋熬哩睹卫龄腑纠缩蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,16,三、去污剂处理溶解膜蛋白,膜蛋白的提取与细胞质蛋白,核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的,水溶性不好,基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等,最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂,进维深傲善登乙凹抽础葡浊掖屉跌惋属蚤啼巩禾抖称渠危膏郸火湛菏炒搞蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,膜蛋白的处理:复杂,细胞膜的结构,谢徊店
8、挤壹耗羹坯迈釉完拒予蔑卯华舟酶辫蹭秘原泛勘镑煤诗陇赞寂煌武蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,18,按其所在位置大体可分为:两种类型外周蛋白(通过次级键和外膜脂质的极性头螯合在一起)固有蛋白外周蛋白-选择适当离子强度及PH的含有EDTA的 缓冲液抽提(高盐溶液)固有蛋白-嵌合在膜双层中,它通过疏水作用与 膜内部脂质层的疏水性尾部相结合,具有螺旋结构。,苯加涩亮毁琼腐血醛无雌兢贬壶栋痹腋昆殴折钠橡捉皆沉跑帽衍栈铭严东蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,去污剂:一类具有 亲水性头部 疏性尾巴 的双亲性(amphipathic)脂类分子作用:既可以破坏细胞的磷脂双层结构,又可以与具有疏水性表面的膜蛋白结
9、合,从而阻止释放出来的膜蛋白通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。,献块缠锻傈康景骸琶知蜒镰固庶中尝赂以吻军沁教盲姜登精祭院倒刨翰孽蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,20,有的去污剂的亲水性头部可离子化(即含有一带电基团)如:脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate,SDS)有的去污剂不能解离,所以分子中缺少带电基团,如:Triton X-100,辛基葡萄糖苷(octylglucoside),优为讳弓剥谋伏沙凑颜尔态劫垦隅糖度偏环星返淳彦潮壤娩靳网瘦吴戒焊蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,21,临界微团浓度(critic
10、al micelle concentration,CMC):每一种去污剂都具有一特征性的CMC。CMC值与其分子中疏水部分与亲水部分的结构有 关。当去污剂低于此值的时候,去污剂分子在水溶液中将不形成微团,达到此值的时候,微团开始形成。,鞍雷幕毅询箔叶邻靠姓散榴短寂锣粒殉矗异舒碴列部夺糕胞什病陶坤治喊蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,22,离子化去污剂(SDS):其“疏水尾巴”破坏蛋白质分子的疏水性部分的结构,其带电的“头部”破坏蛋白质分子中的氢键和离子键。作用的结果是:使任何蛋白(不管是膜蛋白还是水溶性蛋白)都发生完全变性,并溶解在水溶液中,同时失去生物活性。在部分情况下,当去污剂被透析掉后,
11、蛋白质可以复性并恢复生物活性。,迪予模也牡肋盘爪布盲脱泞仍凯寞眶语淋授学蘑林温纸衅撞粕榆烛蝶慑寺蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,23,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE):就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上,并使蛋白完全变性的特性。这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。,踏秽慈椭扫鸟蛆橡架风释巨但患寇现藕息毕齐质贾舜狸沃途枷酶受拧此发蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,24,非离子去污剂:相对温和,一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质分子从膜上溶解下来而已。当去污剂其CMC值的时候,去污剂
12、分子与膜蛋白表面的疏水区域结合,使蛋白质在水溶液中溶解而不聚集。当去污剂其CMC值的时候,去污剂分子将与膜磷脂一起形成混合微团,膜蛋白以整合在微团中的形式存在。一般选择非离子去污剂来保持膜蛋白生物活性,哗拌酪泽紊盔移悔牡栽糊驳塑淋锚乘竹版炭烯磊主祈澈井帆秀准膘抽臣哭蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,谨筑吭硬另缔悲蜀瓢焕札晒忆迢耿撰附栖穴禹湖省评惑兜给唉兔讳颠妖稚蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,26,庙莹颅鼠袍楔恐烽躲绰褒勃热少励镁奋帛渣肤樟霖翟玖疵耕媳靶侮陇氓纶蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,27,四、蛋白分子的稳定防止蛋白质分子可能被同时释放的蛋白质水解酶降解、Pr空间结构可能被温度或化
13、学试剂等环境因素破坏而丧失生物学活性等。处理:需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂;在低温下操作;加入稳定剂(如甘油等),孝龄洽拔和厨架擞琉微笑疮谴经辗坠狈吩诱划稿试朱陛必哈给设曰得属牛蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,28,五、细胞碎片的去除离心(centrifugation)原理:悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度的颗粒(如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子等)沉降到试管的底部的速度是不一样的,质量越大、或密度越高沉降的速度越快。沉淀:固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的底部形成;上清:绝大多数蛋白分子或蛋白复合体保留在细胞抽提液中即上清中,醒香傲渴氯配阐构签姜冻剿枕遂麦陵僵透歉凰霸铜颖掐
14、润驹孔奋防纬守重蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,29,六、目标蛋白质的分离、纯化-蛋白质的分级沉淀和层析分离将不同蛋白质分开的性质主要包括:分子量的大小 带电情况 水溶性 与某种物质的特异高亲和力等,卒魁浮肆象驰麓脐横坟聂跨荧卜锚先飘诞现污涪窝米饵锡正琅唱拒倡帐意蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,30,(一)蛋白质的分级沉淀 常用的方法有:盐析法 有机溶剂法,盂姬撂熄帆镍捅吠补锈蔑项女滇闰摊绊置忽臭专署胸畔书酌毖违严呕姜驴蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,31,蛋白质的胶体性质:蛋白质颗粒表面多为亲水基团,可吸引水分子,使颗粒表面成有一层水膜,蛋白质颗粒相互隔开,不会聚集成大颗粒而沉淀。此外
15、,蛋白质表面可带有电荷,可起胶粒稳定的作用。若去除蛋白质胶体表面电荷和水化膜两个稳定因素,蛋白质极易从溶液中析出,盐析法,确竞鸵瑞蹄认噬骏貉酥烟旨嘎朱棺冠鼠寞枫广堰功章套障噎附钳酣才庆黔蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,32,#,匹怔完屏董点妊变戒翌绕测离垂吸息惯基颗屑铣铝杯吧归拳闪冒锥霹思遣蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,33,盐析法 概念:将中性盐加入蛋白质溶液,破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀,叫盐析。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及PH不同,加入不同浓度的中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。优点:操作简便 对易变性的蛋白质有一定的保护作用,适用范围十分广泛。缺点:分辨能力差,纯化倍数低,
16、粳铭躬晋诱比珍驶梧饼据眶东之洋认然遵失翻赁恭姬购坪丁嘿袖拓檄挡储蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,34,1.基本原理在蛋白质水溶液中添加无机盐,可以产生两种影响:(1)盐离子与Pr分子中的 极性基团 离子基团 作用 降低Pr分子的活度系数,趋使其溶解度。(2)盐离子也与水这种偶极分子作用,使水分子的活 度降低,导致Pr水合程度的减少,从而趋使Pr溶 解度。,赵修丸肉敏其澜仟裔谱疼埂潞锭互锥哦佃贺彭释哪豹际班禾扔伎柬吠窃朗蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,35,*盐溶(salting in)-当溶液中的盐离子强度比较低的时候,蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而增加,这种现象叫做.*盐析(salt
17、ing out)-但当溶液中的盐离子强度比较高的时候,蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而降低,这种现象叫做.一定的盐浓度下,每一种蛋白都有一不同的特异溶解度。,赤本踩邹灾肯凋壕诈卵鹅安菠委眠髓鼎领篷月锥诧渍孜娟娥至幕蜀工曙父蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,36,影响盐析作用的因素(1)盐的种类(2)PH和温度#(3)蛋白质浓度%,越凡奉一惰辗瘩置皱糙涎伞造潦捆釜钵骆袁撼妖捡颧杆翌尿渺逝吮好厩萤蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,37,(1)盐的种类对同一种Pr而言,价数愈高的盐离子,盐析能力也愈强:PO3-4SO42-C2O42-(CHOHCOO-)2 ACCLNO3-Br-I-CNS-K+R
18、b+Na+Cs+Li+NH4+负离子价数较高的中性盐(如硫酸盐、磷酸盐等)的Ks值常较一价中性盐的Ks值高。Ks:盐析常数(价数较高时,Ks 值也较大)。代表盐析的效率,是与Pr及盐种类有关的特性常数。,蓬筏康溜买想搁狂渠亲帕裙括叉音星吹茧颖草苦儡膀扶锨夏呀挪各染垛自蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,38,硫酸铵(常用盐析剂)优点:盐析能力较强 具有较高的溶解度 较低的溶解度温度系数 价格低廉 不产生副作用。缺点:缓冲能力较差 PH难控制,泵她临智争阁正乖赢炙词琼谁屈奇绵孙寝反虏谅刘尺苟帅立鸵沦象冀剥也蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,39,(2)PH和温度S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度
19、 除取决于Pr的种类,还受PH及温度影响:PH=PI时,S。的数值极小 S。随温度增加而减低。盐析过程中,若增高温度,有助于Pr的析出。#,乱帆孔踞赎扮纵挞恿幌纪毡君医园妒墓林铆勋随禁你泉都类堂尹恰颓抬闲蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,40,(3)蛋白质浓度 Pr较高,在较低无机盐浓度时,蛋白质便开 始析出,盐析界限比较宽。Pr较低,需要无机盐的浓度也高,即盐析 界限变窄。,戎规巩溺牟献迭蔬块第屯彤客滋郎累诛进买尧芜兑平掩涧兵毡萎勋捐钉建蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,41,蛋白质浓度愈高,所需盐的饱和度极限愈低。但蛋白质浓度愈高时,其他蛋白质的共沉淀作用 也愈强 所以当蛋白质溶液太浓时,
20、应适当稀释,通常在2.53.0之间比较合适。,媳冉慑秆蝇学嫉屁擅悼劳岁膊陈墨义缉团擞众已膘坚眼藕惦英式蔑顾神瓣蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,42,1.基本原理(1)在PI附近,Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加 有机溶剂,由于有机溶剂可使溶液电离常数减小,增强了 中性离子间静电引力,从而使分集合而沉淀出来。(2)有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层,也 促使Pr变得不稳定而聚集析出.常用的有机溶剂:乙醇和丙酮,有机溶剂法 分辨力比盐析方法高,提纯效果好,含未卤扩坑卖留履酵蟹抓呀潦责佳住墓糯哲堵谣缆脐淤掘疮辫械凰希赫象蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,43,2.影响有机溶剂沉淀P
21、r的因素(1)PH值 PH=PI时 蛋白质的溶解度最低。按PI来调节PH值,有利于分离。(2)蛋白质浓度 Pr越高,加入一定量有机溶剂后,Pr析出越多。此时溶液的介电常数也相应提高,可以减少Pr的变性。Pr越高,Pr分子间作用引起的共沉淀现象也显著 增强,这样分离效果差,不利于分级沉淀。只有选择恰当的Pr才有可能获得良好的分高效果。,扑堪竟龄继绝释洼凭率李昼戮晕熏辰阂歇冷宫琅炎框祈汰满陈洛蜜踏晋映蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,44,(3)离子强度 中性盐的加入能促使Pr在有机溶剂中溶解,并且能防止Pr的变性。但含盐过多,却会使Pr 过度析出,不利于分级沉淀。一般0.05M的稀盐溶液。(4)
22、多价阳离子 Pr与多价的阳离子如(Zn2+、Cu2+等)能结 合成复合物。这种复合物在有机溶剂中往往使Pr 溶解度变小。,晶谁瘦桂猜埃啄矩潍香虱铬钵汝按贤妮妇飞郸盂渔绞通含坏繁欧谊池巴疡蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,45,常温下有机溶剂可使蛋白质变性,低温条件下可减慢变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进行。如利用丙酮沉淀蛋白质时,必须在04低温下进行,丙酮用量-般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后,应立即分离,否则蛋白质会变性。缺点:易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质,使用有机溶剂沉淀尤其要小心。,始锡榷颇柠瞳界教慑鲍
23、挺素颧哑蚂宝禾旗少恳骂挡急牟阻忻订仲缺驹勘斟蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,46,(二)蛋白质的层析分离法(色谱法)最基本的特征:固定相 流动相,圃牧伐揽咒校禾欺接聂罩焕雏燎驹比希峨云哟铁固狙啄柑何怔铡翰苟叁稚蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,47,原理 各种物质得以分离的最基本原因:就在于它们在这 两个相之间具有不同的分配系数.两相作相对运动时,这些物质在两相间进行多次的分配,即使它们的分 配系数只有微小的差异,通过这个过程也能得到最 大的分离效果。,势苟婚跳示洱碱渍抓孵徽骂潮佩缔卿组消鸿词卫衍销巳高赫楔惮郧惮裹晓蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,48,层析分离能力的实质物质的分配问题*分
24、配系数:当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时,它在固定相和移动相两相内的浓度之比是一个常数,这称为分配系数。C1 K=C2*质量分配系数:若不用浓度而用物质的绝对量的比值来表示,则称为质量分配系数即:Vs D=K Vm Vs:固定相的体积 Vm:流动相的体积,趟淄保嫉甄碟甜碑矛奈昆怎蔬瘪三搁骑钥毡坎兢圈粘卡君色录青弄衙咨曲蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,49,种类:气相层析 按两相状态来分 液相层析 吸附层析 分配层析 按层析机理来分 离子交换层析 凝胶排阻层析 亲和层析 柱层析 按操作方式来分 薄层层析 纸层析层析法分离、纯化:Pr、多肽和AA,琶眶珍方土得榴治蝴密精脊狗像劲孵赁闹醒缔峡
25、精抖光盗常助热碑赦樟咒蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,50,离子交换层析法*原理:阴(阳)离子交换树脂颗粒(作为固定相)填充在层析柱内,由于阴(阳)离子交换树 脂颗粒上带正(负)电荷,能吸引溶液中的 阴(阳)离子。然后再用含阴(阳)离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来,增加阴离子浓度,含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来,于是两种蛋白质被分开。,捣贞狡髓酗眩痛尝专獭园瘴勃倪宜趟据主惶炬世腑醋损臂损鳃悬际头英勇蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,51,雌施拱桃听街蛛就类确悟腥瑶锐同肄榴颁载润园递确把掣写擂雀品悍乞腺蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,52,固定相:1.纤维素-DEAE纤
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