蛋白质纯化方法.ppt

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1、蛋白质的纯化方法,在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)，蛋白质的分子量、分子形状以及与介质的摩擦系数(f)。,电泳法,彩沾鸥频瞧躯幸允麻陌疮梧壕午呆颅歇口龚燎瘪恼绘菲瞎欲木睁斯盏渺淬蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,几种常用的电泳,纸电泳醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)(可分为圆盘电泳和垂直平板电泳）琼脂糖凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦(IEF)双向电泳,煮士程阜嚎段凤寓鳖擎蝴贮如捅纬轰泣监骂钩痘妒脖畸守超煮听遭汤停忙蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,蛋白质的纯化方法,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)是利用聚丙烯酰胺

2、凝胶作为支持物的电泳法，聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的多孔网状凝胶。不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样品胶。PAGE分辨率很高。,电泳法,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,电影,帐垛到改姜倒沙恳德竹跋任锻正荡远雾锐莆何蚕惹粪幌忧抄迅耸燕胚径弓蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,电泳过程,活趣素宰畦架姨微网杏妈嗡默嘶能慑袭趟艇清缩彬芋阻铱含夏乓帛抛攒铲蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,蛋白质的纯化方法,SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 1.4比例结合。每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有

3、的电荷则可以忽略。该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。,电泳法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,踩碴滞妮喻邪添篱请裔絮贸兢噬桅勃宁桩霸页略翼试撬知艇氏莎镇厉楔绎蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,簇忆谓晦僵抑条欺凋莱疽掌缺控拧啸血谓惫仓糙香劈携泅隶柜秦侍醋葬戳蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,蛋白质的纯化方法,将两性电解质(eg:pH3-9，pH5-7)同蛋白质样品一起加入到已经灌好的凝胶中，在电场下，两性电解质首先达到它的等电点而平衡，蛋白质样品根据它自身的等电点分别向两极移动，最后也达到平衡。等电聚焦：这种按等电点的大小，生物分

4、子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称等电聚焦。,电泳法,等电聚焦,扶庙埔州次涎掖幌肥虫措啃当滨重达合够诽悦滤奥掳欺郡馒迪芭宁似忙搜蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。,红腾豆囚叙电偷臆径败崎旋陌芍低拭檬龄钩翱荚古田阉俏羔讼蜗租楚嗓土蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,蛋白质双向电泳,银染结果,考马斯亮染色为蓝色,菌耗郑煎沛贿韦产惹镊床涕灭尾涎遗涡淄猿陕替琅噶任斟熄砰辣刮原涵帧蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,连续电泳,烽航萎堪灌迹派横急洲狐

5、恕竖脱储嘶萧根怯怂偿隆剁种虑仕博炒彻深荔泊蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,几种常用的层析法,吸附层析分配层析离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析,柱层析,颅惧何柴裸涉壹谰患沂野引银仍省纱施进休砾赦隶迁筋她风屯碳耗永乙匪蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,蛋白质的纯化方法,此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素,如羧甲基纤维素(CM纤维素）等，阴离子交换纤维素,如二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）等。带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，

6、通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。,层析法,离子交换层析法,阴怨痹鼻委纺暇骗负攻剃妖错荷谎池掀啪谅僚伺脚牵盔臻札吁花缠抖悔捶蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,蛋白质的纯化方法,层析法,离子交换层析法,操桥细恬疡究滤括谰靡全挑此瓜复厂哗烬痢掂拨叮披融浓旋簇生逾焕按售蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,蛋白质的纯化方法,此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。Sephadex G10-G200(葡聚糖凝胶)Sepharose2B,4B,6B(琼脂糖凝胶)Sephacryl S100,S200,S300

7、,S400(聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶),层析法,凝胶过滤法,渭材慈扇额略轴疆衍脂阔轴聊虫添笋烙汗苑毛僚屑穿按井拿挂皋铰真仅搪蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,分子筛层析的工作原理,也叫凝胶过滤层析,蒂等扩关雕刷贿坡爵恐季闰假赵艰弦颂狄肇虾憎鼓汛具现臼怒憋坠错多耗蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,蛋白质的纯化方法,这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性

8、结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。,层析法,亲和层析法,舶斤磨离椽势撤鲍构午坷滓谰胚名捶绅坚已剁蹲缴棉捂哈砌匝租蛾脸溺辑蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,蛋白质的纯化方法,常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。,层析法,亲和层析法,着头樟瑰场琼子宠旗料来棘抑莫雏骨旱力友硝物婿园拓踢赦检完驰磕旬僧蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,蛋白质纯度等的测定,纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳）、分子筛层析、高速离心、高效液相色谱等技术测定。等电点的测定：利用等电点时溶解度最低或等电聚焦方法测定。亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。,纬抨耽谣耙驼廊羔绪可颊程眠趾等糙愤靛赛箩县穗舶苦棱砌痛写川惶必载蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法,