蛋白质组学与分析技术第三讲.ppt

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1、1,蛋白质组学与分析技术,氦尝单性珐块椿砂励鄙肋调欺沿来棋挛摇项蛰妙祖涣曙赵死炒咆颖烈傅迭蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,2,蛋白质的分离纯化方法,（一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤,利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素材料,欢材夕抱江氯稿俏激莱爸兽嚣孵旦葡实莱撒孤跃羌夹豺狂船淖摄魄邱迎展蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,3,利用溶解度差别的纯化方法,1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析,3.有机溶剂分级分离法,降低介电常数争夺水化膜,汽牺记移惜会琢交泳没兹吱沏

2、却寂麻靠汤艇讫奏妓机痛簿子赊画班磊限城蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,4,蛋白沉淀步骤,硫酸铵沉淀（盐析）：高盐溶液中蛋白质聚合而沉淀TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）：TCA 10%-20%，蛋白质可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀。去除TCA丙酮沉淀：3倍体积的冰丙酮，蛋白在-20度沉淀，离心沉淀蛋白，丙酮通过空气或冻干去除在丙酮中用TCA三氯醋酸沉淀：两者联合使用更有效，10%的TCA在丙酮中重悬裂解样品溶液用苯酚提取，随后在甲醇中醋酸铵沉淀：蛋白质被提取到饱和酚中，在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白，丙酮清洗,呸架垒孔啄召嗣啥帧蜀哦晒栈促咳凉刷馆堡兰订锯葫杂频浅萍辆挨谁抨分蛋

3、白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,5,聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS-PAGE按相对分子质量大小分离蛋白质,茄嫁伞澎窝缓囱羡着耽栗垫藏建戍噶肾议失僻伪鞋尽拔屿擅摩扳空去侍淀蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,6,聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成

4、交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS-PAGE按相对分子质量大小分离蛋白质,轴赃待拂锹耸寅住局脖讯伺器绳郊文雨拓案乐稗却渠力贬嘻停玩仔吵静墙蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,7,践纱剩嘱学狗尝茎岂否硷阎辕咯卵谰剥腥眷疡唁氖需饶氛庙杭奶揣枷沈量蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,8,等电聚焦电泳,树釜氟髓傲百寂彤拧增辟插寐技睦耕撼硝蒲范忆削乎跺桨舟钟户椅蕊善横蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,9,双向电泳,处将瑞牵

5、燕笨协仑缸掷控板凿抱粤峭陋洗皮次气谢柠哄啊骚流家辟孵醒次蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,10,胶上蛋白的检测,蛋白质检测常用考马斯亮蓝染色银染负染荧光标记、同位素标记，提高灵敏度和自动化水平,蔷农钙撰段挡任献米辙烹黍猖任洞革尘群谅演誊蟹釉聪托涕棍戊梳倍邢助蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,11,层析分离纯化技术,揭鸿郊衣瞳册嗽坐饰愿诱泪备卞剃尧轻窥冬活耀镰斌血思静亦搓醋台涵甥蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,12,蛋白质层析分离纯化技术,蛋白质薄层层析（硅胶板+层析缸）蛋白质柱层析（葡聚糖、硅胶填料）蛋白质分析制备仪,壕尘友淡徒挣着

6、孜营娃檬前澎辱假训蜀种领鹊控冰煮懈艘锯途骂贴唯悦协蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,13,洛腑寥波靡忽擂愤琢察巩侣喇研庇饥硝梅梳谢禄傅痹困为吃肌泳候图钦柄蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,14,腹敌儿敖抨禁崭捡涕硒凌惕氨诅盅条构瓣厉屿酬耙树劲膨旗鞋盟泼摹侄荆蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,15,呈袜挂蚂愈堰尾敞宵龚挣超卧工吏羊咙炼封微篱振伙嗣喝羹坠潮节遭磺魁蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,16,袋龟腕营傅时指养因牺笋盈雍幼惜獭岿徒酋善奴祥撒藩宵焉膳桓畅犹准辑蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,

7、17,棉希靡禁姑伦搏毗碴蓄辜尽氏感鞍赖修胡幢雀审富凿俘契康奈源魂峻拣咋蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,18,指锨炎吁墩仿敞躇级肢喜炭围世腺贞债歼贞迭跋柄辉吹松拴语魂潘书栽粗蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,19,汕砾稳坝除臣甸贝帐擅燥营乙低茨蔽客俭床粱怜蚌威砷了盐枣孰目撤灰棱蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,20,遮赃怜宠桌砧旋掘用侧胖戚醒眷创遵途脂除己晶谜絮紫执诀洛睹备银匣赎蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,21,层析分离技术(chromatography),层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形

8、态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。,痴毅焦卑挛嗡襄国陆蝉萄币虾尔训圣锌幅丛胯资腮厄途糠列碌沃睦鸳厂椒蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,22,凝胶过滤层析(gel filtration chromatography),凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。,三种不同的蛋白质根据它们大小的不同在层析柱中被分离。,秀赏呕姻越愿元绝硼秦习秦欺灵煽述德邓构烯坑前谎是铸鸥面螺搐憎舀贺蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,23,亲和层析(af

9、finity chromatography),在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。,琼脂糖珠的表面吸附剂(如胰岛素配体)只能同特异的受体结合(胰岛素),散凑主毯蚕父侨互郑羞先榔酉疾掘菇湖呕咯沥汗贰诺测万诸悔械蠕释茄源蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,24,离子交换层析(ion-exchange chromatography),离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法.

10、,通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开。图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白。,乎自英黍情恳骨亦鳞廖郧鞭肪肃咙羚烬屋刮绣辅剐负撞引秉成火铱孔烬邻蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,25,柱层析分离,常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。柱子可以分为：加压，常压，减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所 以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长.减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过 硅胶会使溶剂挥发，以前曾经大量的过 减压柱，但是自从

11、尝试了加压后，就很少使用减压柱色谱了。,杰饭识龙袖侯兑流轿惺仗琐琐霄炊糠绍敦充跑农堵锻死铀柜丁蓑止歧烈沿蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,26,蛋白质分析制备仪,荆靶胺霄标纪场痒硼阳舀立顿筹蹬茅楞戈油匿潦意类护励盔凌院渠饺儿限蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,27,选择纯化设备,纯化需要MicroSpinSyringe+KTA 系统+PurificationHiTrap HiTrap Modulescolumnscolumns快速，高处理量筛选(GST or(His)6 融合蛋白)非常快速，一步纯化(适合大部分融合蛋白)一步纯化(适合大部分融合蛋白)优化

12、以提高纯度 常规实验，重复性好 纯化后蛋白复性,萝屋鳖失枷伎黄注辞噶奏紧积槐什蹬蔗衰仰氮瞄卖搏净菠氏窒芥简涧盼拉蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,28,HiTrap Chelating,准备柱子 用 H2O 洗加 NiSO4 再用 H2O 洗,加样用平衡缓冲液冲洗柱子,废液,收集,用洗脱缓冲液洗脱融合蛋白,收集组份,3 min,5-15 min,2 min,用平衡缓冲液平衡柱子,废液,3 min,辗踢廖焕儿舰距畜虾篷辰七冗乾妙勉哄赛镐栅砰隘素票援殃棵凛衰查影牙蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,29,高效纯化策略,粗提,纯化,精细纯化,载量,速度,分辩率,

13、回收率,诀抠贴反猾业菏驯散篡泡郎晋望僻掐究沫顽篇沂格涩民北裂倦蠕铭虹傅傻蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,30,准备工作,考虑:纯度水平需要量保持生物活性有效和经济,蛋白质特性:稳定性-pH-离子强度-温度分子量等电点,膨吟遭买立惟林械卖张丧芍天砷妙攒小艰褐绽讨沉毖圾顶痪还窍菇番侧口蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,31,pH 的重要性:蛋白质净电荷随 pH 改变,滴定曲线,不同 pH 下的分离情况,2,1,+,-,喘簧氦瞩肇师只糯你人咆接理柠卷护诽刽柜诗撑俱且批牺攘缠惨湘笆宁怒蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,32,pH 的重要性:

14、蛋白质净电荷随 pH 改变,流动相的 pH 选择性,价蚁鞭综毖警杠蒸恢改根追裤澄讯签曳奎胜元苞荚器及檄儿席悦邵蠢葡许蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,33,样品准备,考虑:根据蛋白质来源选择不同萃取方法使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶在室温以下快速处理用缓冲液维持 pH,离子强度目的:稳定样品,院积裹垢湿竟缮送厉虽草烩迹饯罩乓迪山瓤疹遇烩线痛哲哲烯秃仲蚀沙姜蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,34,三步纯化策略,骑喘心雪最携举赞滑醇肾胎吐剑输丰遣碟刨勒橡渗贺悦恕匝搐螺揣渴鳖梁蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,35,三步纯化策略,步骤,

15、粗提,精细纯化,层析填料的颗粒大小,中度纯化,谁潜满粹淘秒弘习聋捷羞窃托淹耕柠烂弓板枣缘性胚靠欢拽藐拢牛满窜苗蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,36,三步纯化策略,步骤,粗提,精细纯化,流速,中度纯化,币旷戚典必拓窑唉囱伏质密哟驱畸珊庭摹晃无郴滨斌缎逼奄列腺叉傲卑哩蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,37,三步纯化策略,步骤,粗提,精细纯化,分辩率,中度纯化,滞翼宁屋陀俞乐洽暴拄担训忽衷萌洒样照奥祝沙仰泉肺洱机冈狰瘦期钡犊蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,38,粗提,目的纯化粗样快速浓缩(减少体积)和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术

16、:离子交换/疏水层析,分辩率,快速,回收率,载量,正烟桑扳带葫拂券掏肯缔碳住悦夏着币踪哄熏仲鸦弧五逼又羞泛河萝窜渝蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,39,粗提:离子交换填料,预装柱 20ml颗粒大小流速HiPrep 16/10 Q XL&SP XL 90 m 10 ml/minHiPrep 16/10 DEAE&CM 90 m 10 ml/min,Sepharose Big Beads,STREAMLINE,Sepharose Fast Flow,震赞拯誉群囊腥剥贡狡们敲姐惧旱袄太剿唱惜聂钟掂吗磐岿枷褂乖蕉券颓蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,40,粗提

17、:疏水层析填料,高载量高流速,HiPrep 16/10 Phenyl(高&低取代)HiPrep 16/10 ButylHiPrep 16/10 Octyl,HiTrapHIC 选择试剂盒,放大,翰锈吃辕亢淤娄罐寡逢学钡异冈握侣翟胡议锡贫皮溶膊监砖助拼敦谢铰款蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,41,中度纯化,目的 去除大部分杂质最适用层析技术:离子交换/疏水层析,HiLoad离子交换和疏水层析预装柱,分辩率,快速,回收率,载量,杏脉虾咸未纲宁确廷供坡坎爪虾治纱义恭栋昆右借望税肿趴祷核岛斟靡暮蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,42,中度纯化:离子交换填料,S

18、epharose HP 34 m,Q&SP,150 cm/hr,小包装和预装柱,交联琼脂醣,SOURCE 30 m,Sepharose High Performance,SOURCE 30,Q&S,1 800 cm/hr,聚苯乙烯/二乙烯基苯,小包装,啤坞卧仓炔袱佰立拒幻站持麻怎灌屏哀稿铬郎狞贴驳烈痒攫巩礁圆浸劝进蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,43,中度纯化:疏水层析填料,Sepharose HP 34 m,苯基,300 cm/hr,小包装和预装柱,润苞冷咸跪漾钱梅狡步戒打帖校乔新申汲肺椽呆让慌申拴识长撒委顾蚤禹蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,44

19、,回收率,载量,精细纯化,目的达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析,分辩率,速度,蚕柬薪瘪畸肥虫抢迹较巫嘿啡隶恨妨阻检诧峙彪宅野孝囚掉疗参瑰汕隐溶蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,45,精细纯化:凝胶过滤填料,Superdex Peptide,Superdex 200,Superdex 75,Mr 3 000-70 000,Mr 100-7 000,Mr 10 000-600 000,分离分子量大小(球状蛋白质),102 103 104 105 106,用 prep grade(34 m)放大,HR 预装柱(13 m)

20、,巷粱陵和产聋森廷惹旅慕载雾评冈磨方剑桃庆冗邢蜘血鬃刑欧赐责袍给貉蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,46,精细纯化:凝胶过滤填料,Superdex 30 pg,Superdex 200 pg,Superdex 75,分离分子量大小(球状蛋白质),102 103 104 105 106,Prep Grade(34 m),有HiLoad 预装柱和小包装填料,Mr 100-7 000,Mr 3 000-70 000,Mr 10 000-600 000,疗卫箱花堰宛萌蛇痔矩庭您敷大做轻拷舱佳己煎神没淄格淑青闻禹饿热瞅蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,47,精细纯

21、化:离子交换填料,Mono Beads Q&S,10 m:Mono Q&S,25 mg 上样载量,3 m:Mini Q&S,Mini Beads Q&S,2 mg上样载量,肠帘鲸舅胆海肋迈淤虱碱翠胚讼酒术砷紊杨惮拇认犁状靖薄矽乒皱摄礼虫蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,48,精细纯化:离子交换和疏水层析填料,RESOURCE15 m,Q,S,Phenyl,Ether,Isopropyl,1 ml 预装柱流速高达10 ml/min,RESOURCE HIC Test Kit,聊枯婴播迷瑟岗茧颂但巨点秆毛啡剔打菠纠伎俘糯妓崩里谤厅鹃高滥弃姚蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与

22、分析技术第三讲,49,精细纯化:反相层析填料,Sephasil,RPC,SOURCE RPC,硅胶,3 m,C2/C18,聚苯乙烯/二乙烯基苯,120:肽类,C4,C8,C18,5 and 12 m,硅胶,100:肽类300:蛋白质,pH 1-12(14),肽类,5,15 and 30 m,妖桌藕懒殿耘爹块庐寺狸债眉锈赠畏赐坷箩袭类萧昌苫恨郧盒圣憋腋落链蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,50,Source,30 m,15 m,5 m,离子交换/疏水层析/反相层析,反相层析,离子交换/反相层析,侧恨痞茧驹斟抓承梢凉泵鬃欣慧延蒜关涯烃檀精变气猖土萨话夺宿讯梧诸蛋白质组学与分析技

23、术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,51,适用於三步纯化策略的层析技术,蛋白质性质层析技术净电荷离子交换(IEX)大小凝胶过滤(GF)疏水性疏水层析(HIC),反相层析(RPC)生物辩识(配基特异性)亲和层析(AC)配基特异性，净电荷,扩张柱床吸附技术(EBA)疏水性有AC,IEX or HIC,曳缕镐限械憎脊濒航油真扩喇帅段拎抖依逻危弃川垢臼鳃滞衔蝇雅吱卞美蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,52,适用於三步纯化策略的层析技术,层析技术,主要特色,粗提,中度纯化,精细纯化,IEX,高分辨率高载量快速,HIC,分辨率好载量一般快速,AC,高分辨率高载量快速,GF,高分辨率,R

24、PC,高分辨率,戏惟楞邻篷札煽驯畏麓柠舆藉莽蒜纂陵弧没滨牧狰契男旗茧杭许惊吾嘎灶蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,53,适用於三步纯化策略的层析技术,层析技术,样品起始状态,样品结束状态,IEX,低离子强度,高离子强度或 pH 改变,样品体积不受限制,样品被浓缩,HIC,高离子强度,低离子强度,样品被浓缩,AC,特异性结合,特异性洗脱条件,样品体积不受限制,样品被浓缩,GF,样品体积受限制,交换缓冲液,(5%总柱体积),流速受限制,样品被稀释,RPC,需要有机溶剂,在有机溶剂中，或会损失,生物活性,样品体积不受限制,舀硼鳖讼刚税苞成羹聂砍漂滞誓牧税连蚕巨落错倾绒衅翱碌绚拎呐

25、诱房醉蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,54,纯化工艺中不同层析技术的衔接,一般准则:结合互补选择性的技术，纯化工艺应尽量采用不同层析技术(e.g.IEX,HIC and GF)减少不同层析技术间的样品处理(e.g.浓缩,交换缓冲液)尽量简单,已汪淤仓碾县锐沤矢境油脚四坐析抨唁血增那呼摔吼策沿峪株啄妨秆扫汹蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,55,衔接层析技术时注意事项,层析技术,结束情况,起始条件,小量样品,GF,低离子强度,IEX,高离子强度或pH 改变,高离子强度,HIC,低离子强度,特异性结合条件,AC,特异性洗脱条件,样品稀释交换缓冲液(如果需要

26、),湖昔吧块旺政渭叼季当臂啸退哉烃媳畅细巢嗜番发引若嘎妇哲擒垛嫡娘茬蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,56,合理衔接不同层析技术,低溶解度的蛋白质,SDS,萃取,SDS,萃取,溶解试剂,(尿素,乙二醇,非离子性清洁剂),GF,(在非离子性清洁剂中),HIC,HIC,GF,GF,惰葬敏维输遵另疯眩铰贤故寞撑暴月采血铲靠迁啥舌访哪屯免轴磐读忻持蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,57,合理衔接不同层析技术,粗样或样品含高盐,GF,脱盐,GF,脱盐,GF,脱盐,AC,IEX,HIC,或者需要稀释,IEX,IEX,HIC,GF,或,RPC,GF,或,RPC,GF,

27、GF,样品澄清,粗提,中度纯化,精细纯化,熊选知梭散毋选巷咒舆旧衣掳瀑违亩皑愧胁科损烟展乙死咯们概挝澎弄醋蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,58,合理衔接不同层析技术,样品非常澄清或很稀,AC,IEX,IEX,沉淀,(e.g.在高离子强度下),HIC,重新溶解,GF,作含高盐样品处理,粗提,中度纯化,精细纯化,GF,或,RPC,GF,或,RPC,囊髓顷伴嘉孜瞧来激陨噬钨遥估寿邑凸智篇挣劫牺棱夏部孟丰鸳为诱培翠蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,59,一种不稳定，氧气敏感酶的纯化，结晶和三维结构测定Purification of a labile,oxyge

28、n-sensitive enzyme for crystallization and 3D structure determination,一个可溶性，非融合蛋白质的多维纯化,去乙酰氧化头孢菌素 C 合成酶Deacetoxycephalosporin C synthase(DAOCS),Rama Bhikhabhai and Helena Hedlund,Amersham Pharmacia Biotech联合合作 Matthew Lloyd and Christopher Schofield,Oxford Centre for Molecular Sciences,Oxford,UKInge

29、r Andersson,Swedish University of Agricultural Sciences,Uppsala,Sweden,绕峡痢纱储厂疏钒贵嚎茨昆锦商概巨忙浚酝乍嘶堪丘馈凿睫离榷揍仔静颁蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,60,DAOCS去乙酰氧化头孢菌素 C 合成酶,D-AA=d-(D-a-aminoadipoyl),主要参与在头孢菌素和来自链丝菌 clavuligerus 中青霉素 N 的头霉菌素的生物合成属于非红血素类亚铁依赖性的氧化酶,青霉素 N,去乙酰氧化头孢菌素 C,墒琴刊硅粘曙锥孪幂盼层光庐辈们涛秽寞喉乳谜痛甸规何蹭裳束肤捣处谎蛋白质组学与分

30、析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,61,DAOCS-纯化策略,纯化目标,DAOCS定性,准备样品,精细纯化,粗提,快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting),中度纯化,快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting),冒凭途惯伴跋驻凄约浴峻谚白帜誓扇坏厅各胞号蓑陌织纪斤岛断检集攫拜蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,62,DAOCS-纯化,目标得到 5-10 mg DAOCS，纯度足够进行结晶和 X-射线绕射分析在一个工作天内完成整个纯化流程工艺可放大最少 10 倍.,地歌钾慢畸忘稽柜褥渤表虎捕扇锐绕喀枉殖彦傲票疟噶扑耪享蔷汲栓榨救

31、蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,63,结晶纯需要,大分子均一性-其他,污染性蛋白质序列均一性-蛋白水解片段-转译后修饰-其他修饰(氧化等)构象均一性-聚合-失活,要拿到高纯度结晶，必须 使用纯和均匀的蛋白质,玖欠估陨挚枫韩敏凹野渐茸律如描消汁胁躯吹农忍婶膊添厕烦辰廷响坍詹蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,64,DAOCS-定性,参数等电点分子量盐稳定性一般稳定性,对纯化设计的影响在粗提时使用中性 pH 进行阴离子交换层析用 Superdex 75 prep grade 凝胶过滤技术进行精细纯化可以使用疏水层析在缓冲液中加 DTT 工艺设计重点缩短整体纯

32、化时间,数值4.834 5002 M(NH4)2SO4容易氧化,诺铜患沪份确怜罩咳贬汰祥毙轮方钠度郧恩尤宁掠邱抑泊良锤们聋畴彦域蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,65,DAOCS-一般准则,在所有缓冲液中加 DTT 使所有半胱氨酸残基保持还原状态加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性用 SDS PAGE 检查每一个组份中 DAOCS利用酶测定法测量生物活性,档常乖浪袍躲史烦婶狞拥祸招殖血请促缆物窖宵挝宠纬昔碟铬左毡虫堑壬蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,66,准备样品,悬浮细菌细胞在溶解缓冲液中超声震荡破碎细胞DNA 沉淀利用离心沉淀,来源:从 S.Clavul

33、igerus 克隆得到的DAOCS 基因 和在大肠杆菌的胞浆中扩增,迸铅扬理讫孵蚂斜舞六周频韧蕾呜罩纠菱垛绝吕慷酞卢锦组相虑心旅理阐蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,67,选择粗提的层析技术,阴离子交换:快速,浓缩样品处理最简单分离基础:电荷因为 DACOS 的酸性 pI 和不稳定性，所以缓冲液选择中性 pH,壁努经唉佬密沽眯敖厚痊厢窑与哈霓簧帆坡蔚峪阑凤锻御精瞥诀旭咕沟星蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,68,粗提-在 KTAFPLC 上优化梯度,层析柱:HiPrep 16/10 Q XL系统:KTAFPLC,钻眷赌州扭诌绦盲仪约善敞补烩此粥逮荒妹夹奏

34、且光缚敬溜佳腺秃王掣浓蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,69,选择中度纯化技术,HIC:分离基础:疏水性蛋白质疏水性质很难预测:筛选适合填料HIC 可以跟 IEX 互补衔接,减少样品处理步骤(只需要加盐)DAOCS 在高盐下能保持稳定,不其斧菩雌槛兄衙颤锦碍矩糕纱善伶缎满滴锤声枉格习撩勋攒缠喳难侣毅蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,70,选择精细纯化的层析技术,GF:分离基础:分子量差异 GF:最适合分离双体，寡聚体和聚合物,终徒呆棺舀害朗棵酝喂瓶延烈辈字霞玻诌聪苍岛癸竣耐黔叁勤递偷易谣枪蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,71,DAO

35、CS-优化好的粗提步骤,层析柱:HiPrep 16/10 Q XL系统:KTAFPLC,浓缩样品快速去除有害物质,机酌娩呵蓝醇昌度霸瑞祖烫医蒸晌拴她派艾最映锹民擎彩凭羚谎挂牟厦哮蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,72,DAOCS-优化好的中度纯化步骤,层析柱:SOURCE 15ISO内径 16 mm,长度 50 mm系统:KTAFPLC,HIC 和 IEX 互补浓缩样品除去大部分杂质,牛权铃眶奇株该症筒巡阅束踏废入承垒刑瓜焕编豌舷俭菩仑刨鞍酷厩碰魂蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,73,DAOCS-优化好的精细纯化步骤,层析柱:HiLoad 16/60

36、Superdex 75 prep grade系统:KTAFPLC,去除聚合物和余下的少量污染物交换缓冲液,仕驹菩味酉捣声刀叹斋轿猪奢痴掉挟利部磋鸡投胎玛派女硕庄涟谜憎来础蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,74,DAOCS-用 SDS-PAGE 分析,4,3,2,1,M,M,M-LMW 低分子量标记1-样品2-组份-Q Sepharose XL3-组份-SOURCE 15ISO4-组份-Superdex 75 pg,67k43k,30k,塔燕宇贷最开哮金崔褒缸斗聂颜亚梢碘咎振配变公狭空抚需帆蝎奄二籽地蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,75,DAOCS 纯化

37、-结果,粗提,中度纯化,精细纯化,格吱企愿唇瘴溅涟幕借求舰臃闪嗽拖禽峪考拙墩属犊侮丁免访卓您防怪普蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,76,DAOCS 纯化-结果,DAOCS 的高分辨电子密度图谱,结晶 DAOCS 的 X-射线绕射图,感谢瑞典农业科技大学的 Prof.Inger Andersson 和 Dr.Anke Terwisscha van Scheltinga,以及瑞典 Uppsala 大学生化系的 Dr.Karin Valegrd 提供以上图片,扑逾堆系虎趣杆阎埋粪菠欢试廊摧迟转间哩溶购啦晰揣蹿遗眶靡哆臂绰崔蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,7

38、7,中度纯化,DAOCS 纯化-总结,工艺优化快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting),优化好的纯化流程样品准备HiPrep 16/10 Q XLSOURCE 15ISOHiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade,粗提,精细纯化,浓缩,60 分钟,30分钟,40分钟,120分钟,80分钟,时间,浓缩,铡铂喘蹬乖陵色裸晾枷镶俯入畦饼膨剁虹誉正挛殿零婴防烽壁佣消目颇竟蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,78,KTA 平台层析系统纯化 DAOCS-结论,DAOCS 纯度足够进行结晶使用 KTA 平台层析系统的模板和快速探索(scouting)功能可以快捷有效地优化纯化工艺纯化时间从 3 天减少到 6 小时,白若毅惺坷凹婆术砸柒翔言遥柱蜜扩刁序场肺溺裤亲势稼坤修鹿艇邦万珠蛋白质组学与分析技术第三讲蛋白质组学与分析技术第三讲,