蛋白质组学研究.ppt

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1、细如抉呛胸阳攘鲜邓馈谢胳醋玉瑰侵札梢绸馏嚏翟辗场琵惺股倚表呻揍暴蛋白质组学研究蛋白质组学研究,引言,随着被誉为解读人类生命“天书”的人类基因组计划的成功实施，人类已初步掌握了自身的遗传信息。为了真正破译、读懂这部“天书”，各国科学家随即将生命科学的战略重点转到以阐明人类基因组整体功能为目标的功能基因组学上。蛋白质作为生命活动的“执行者”，自然成为新的研究焦点。以研究一种细胞、组织或完整生物体所拥有的全套蛋白质为特征的蛋白质组学自然就成为功能基因组学中的“中流砥柱”，构成了功能基因组学研究的战略制高点。与此同时，实施蛋白质组学研究的关键技术平台也已经成熟。近年来诺贝尔化学奖分别授予了发明生物大分

2、子质谱分析法和生物大分子三维结构核磁共振技术的科学家，表明开展人类蛋白质组计划的技术保障体系已经具备。,昂周撕竞坝姬缔殷皿几原较串煤皋育苔胚禾己稍零挫酒甄华狸敷瘴脑熄擦蛋白质组学研究蛋白质组学研究,一、概 论,一、蛋 白 质 组 学（Proteomics）90年代初期开始实施的人类基因组计划，在经过各国科学家近10年的努力下，已经取得了巨大的成就。不仅完成了十余种模式生物（从大肠杆菌、酿酒酵母到线虫）基因组全序列的测定工作，在2003年前完成了人类所有基因的全序列测定。那么，知道了人类的全部遗传密码即基因组序列，就可以任意控制人的生老病死吗？其实并不是这么简单。基因组学（genomics）虽然

3、在基因活性和疾病的相关性方面为人类提供了有力根据,但实际上大部分疾病并不是因为基因改变所造成。并且，基因的表达方式错综复杂，同样的一个基因在不同条件、不同时期可能会起到完全不同的作用。关于这些方面的问题，基因组学是无法回答的。所以，随着人类基因组计划的逐步完成，科学家们又进一步提出了后基因组计划，蛋白质组（proteome）研究是其中一个很重要的内容。,煽京闯龋匹陕塑揪熄教眷趋舆完骤迷茅察梁荤岛怕额方闯毋呜纂蜕杆吗岔蛋白质组学研究蛋白质组学研究,蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与 基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种

4、细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。确实，那些世界范围内销路最好的药物本身是蛋白质或其作用靶点为某种蛋白质分子。因此，蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益。,炯料泰之罕即衰卸乞词瞒吗十斯熬黄崔沉蛮华流游栋种泻男盟邓沿炎裤爹蛋白质组学研究蛋白质组学研究,基因组和蛋白质组到底有什么联系？,生命：遗传

5、信息从DNA（基因）转变为一种被称作mRNA的中间转载体，然后再合成各式各样的结构蛋白质和功能蛋白质，构成一种有机体，完成生命的功能。基因 mRNA蛋白质，三位一体，构成了遗传信息的流程图，这即是传统的中心法则。现在已经证明，一个基因并不只存在一个相应的蛋白质，可能会有几个，甚至几十个。什么情况下会有什么样的蛋白，这不仅决定于基因，还与机体所处的周围环境以及机体本身的生理状态有关。并且，基因也不能直接决定一个功能蛋白。实际上，往往是通过基因的转录、表达产生一个蛋白质前体，在此基础上再进行加工、修饰，才成为一个具生物活性的蛋白质。,屁屹普已凶建旱桅蒙淑伴霄捶并差患蜂惜肿驼椒员忽埔石证房须畸每鸟曼

6、蛋白质组学研究蛋白质组学研究,这样的蛋白质还通过一系列的运输过程，到组织细胞内适当的位置才能发挥正常的生理作用。基因不能完全决定这样的蛋白质后期加工、修饰以及转运定位的全过程。而且，这些过程中的任何一个步骤发生微细的差错即可导致机体的疾病。纽约Rockefeller大学的细胞和分子生物学家Gnter Blobel博士就是因其“蛋白质内在的信号分子活性，调节自身的细胞内转运和定位”研究上的卓越成就，获得了1999年诺贝尔医学奖和生理学奖。,护釉菱歹霜黎亿沙视决腋大轧晓橙蓖哮拥啊雏报建豫蔗冀庶脑搐浴缮元泻蛋白质组学研究蛋白质组学研究,近年来人们又发现蛋白质间亦存在类似于mRNA分子内的剪切、拼接，

7、具有自身特有的活动规律。这种自主性不能从其基因编码序列中预测，而只能通过对其最终的功能蛋白进行分析。因此说，基因虽是遗传信息的源头，而功能性蛋白是基因功能的执行体。基因组计划的实现固然为生物有机体全体基因序列的确定、为未来生命科学研究奠定了坚实的基础，但是它并不能提供认识各种生命活动直接的分子基础，其间必须研究生命活动的执行体-蛋白质这一重要环节。蛋白质组学（proteomics）研究即旨在解决这一问题。,产佐倘哆僚议预醉博岁唯侄叙虎巨冰酣苞猖拄谍努肆掉标绢溃凝卒大弹魂蛋白质组学研究蛋白质组学研究,与基因重组、表达、序列分析的快速、自动化程度相比，到最近为止，机体组织细胞内蛋白质的序列分析只是

8、实验室小规模研究项目。随着对生物学、物理、化学及信息学的各种尖端技术的综合应用，蛋白质组研究也正逐步变成高产量、高精确度的分析过程。现今，蛋白质组研究中主要应用的技术包括：双相电泳(2-DE)、新型质谱(MS)技术、数据库设置与检索系统等。为了保证分析过程的精确性和重复性，大规模样品处理机器人也被应用。整个研究过程包括：样品处理、蛋白质的分离、蛋白质丰度分析、蛋白质鉴定等步骤。当前，蛋白质组分析虽然以双相电泳和质谱分析为其技术基础，但离不开各种先进的数据分析和图象分析软件及网络技术的支持。,仅念埃熄奠赎硼盘糖自坏欧皮志药吸绥侮丫摇缀粟惧怜高朵朵铆抗过参弗蛋白质组学研究蛋白质组学研究,自1995

9、年蛋白质组（proteome）一词问世到现在，虽然只有短短的几年时间，蛋白质组学研究却得到了突飞猛进的发展。1995年，悉尼大学Humphery Smith I实验室与Williams等4家实验室合作，对至今已知最小的自我复制生物（一种支原体）进行了蛋白质成分的大规模分离与鉴定后，到1996年，蛋白质组研究对象已迅速扩展到单细胞真核生物-酵母以及人体正常组织、病理标本等。参与国家在1995年只有澳大利亚，而到1997年时已有美国、丹麦、瑞士、英、法、日、瑞典、意、德等10个国家加入。国际著名学府哈佛、斯坦福、耶鲁、密执安、华盛顿大学、欧洲分子生物学实验室、巴士德研究所、瑞士联邦工业学院等均挤身

10、此类研究。如今澳大利亚悉尼大学与Macquarie大学仍处领先水平，但美欧多家实验室已奋起直追。,编畴茬扰劈恰啮茵庆炒豫宵狠控掺招侈氢赊惩碴冻低韧科抗俊逮荧纳劲嫁蛋白质组学研究蛋白质组学研究,不过，蛋白质组学为一种新生领域，目前还处于初期发展阶段，仍有许多困难有待克服。如双相电泳和质谱分析的灵敏度还很难将体内微量的调节蛋白质精确分析。而这种微量调控蛋白的精确表达在生命过程中起到关键性作用。另外，当前质谱分析仪的价格十分昂贵，约为DNA序列分析仪的十倍之多，严重影响了它的普及和被广泛应用。再者，成千上万种蛋白质间及蛋白质与其它生物大分子间的相互作用和作用方式的复杂性同样也是蛋白质组研究所面临的问

11、题。,报镇奖根挖诞屹央蚌高绵川抛幸缔搐卵顶歧荡肥抨引椿哄朗修睹逐借距效蛋白质组学研究蛋白质组学研究,近年来，我国的人类基因组研究正在迅速开展，并取得了许多有意义的成果。我国曾有很好基础的蛋白质领域方面的研究，如人工合成胰岛素等。然而，蛋白质组研究在国际上正如火如荼、轰轰烈烈，我国则刚启动。如何抓住国际上蛋白质组学研究刚刚启动的时机，迅速地进入到蛋白质组学的国际前沿，是摆在我国生命科学研究发展方向决策中的一个重要问题。,遇长滞乌恰坝褒饰番伶祥赃嫩尿粹体消枪谗抢闽酝邻鲤粤篮浩惮灼牧嘱捏蛋白质组学研究蛋白质组学研究,网上蛋白质组学资源,由于蛋白质组学研究依赖生物信息学和网络技术，internet 上

12、有关蛋白质组研究的技术支持以及蛋白质数据分析的专家系统、数据库等专门网站很多。http:/www.proteomeworks.bio-蛋白质组研究技术、信息等。http:/从新药开发角度，发现新蛋白及新作用。http:/www.proteome.med.umich.edu 可以找到蛋白质组研究相关企业、各 种仪器来源、新闻等。http:/www.proteome.co.uk 各种蛋白质组研究相关信息http:/www.micromass.co.uk 介绍蛋白质鉴定的先进仪器http:/www.expasy.ch 蛋白质鉴定专家系统，Swiss Institute of Bioinformati

13、cshttp:/expasy.proteome.org.au 蛋白质鉴定专家系统，Australian Proteome Analysis Facilityhttp:/expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统，Canadian Bioinformatics Resours,爹拎蔽横添元酌雀剖耻尝荡墒胰伪旺换烁嗽钱炮地匿严鸿澈碌棘械辟娠找蛋白质组学研究蛋白质组学研究,二、酵母双杂交技术及其在蛋白质组研究中的应用,作为后基因组时代出现的新兴研究领域之一,蛋白质组学(proteomics)正受到越来越多的关注。蛋白质组学的研究目标是对机体或细胞的所有蛋白质进行鉴定和结构功能分析。蛋白质

14、组学的研究不局限任何特定的方法。高分辨率的蛋白质分离技术如二维凝胶电泳和高效液相层析,经典的蛋白质鉴定方法如氨基酸序列分析等,现代质谱技术,基因组学研究的各种手段,现代计算机信息学和计算机网络通讯技术等等,任何可用于蛋白质研究的技术手段,蛋白质组学都可能会采用。它体现的是一个开放的思维和研究方式。,墨寺领购牺娄悼冈掠浩惯胳倦炽琅岩商荤昏烟卯暑藩管汝硷廊扬芋稗逃雅蛋白质组学研究蛋白质组学研究,蛋白质-蛋白质的相互作用是细胞生命活动的基础和特征。这种千变万化的相互作用以及由此形成的纷繁复杂的蛋白质联系网络同样也是蛋白质组学的研究内容,相应的工作也已经开展。,产秀堂脾银刺佑眺嚷丁程猫滓撂凝拟速恼原萧

15、法酪达够默坠束临骆童斋抿蛋白质组学研究蛋白质组学研究,酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)自建立以来已经成为分析蛋白质相互作用的强有力的方法之一。该方法在不断完善,如今它不但可用来在体内检验蛋白质间的相互作用,而且还能用来发现新的作用蛋白质,在对蛋白质组中特定的代谢途径中蛋白质相互作用关系网络的认识上发挥了重要的作用。实验表明双杂交技术在蛋白质组学上的应用是成功的。本文将就双杂交技术的产生、发展及其在蛋白质组研究方面的初步应用作一介绍。,换挺咳拦奴刽宜辊高甄忌缕刑恨扛控坤钒衣滦窄彤陡河粉导骤球辛锅佃液蛋白质组学研究蛋白质组学研究,1蛋白质组学的产生背景,基因组研究自

16、从开展以来已经取得了举世瞩目的成就。在过去几年中,已经陆续完成了包括大肠杆菌、酿酒酵母等十多种结构比较简单的生物的基因组DNA的全序列分析1。线虫(C.elegans)的基因组DNA测序工作已基本完成2。规模更为庞大的人类基因组计划预期在下一世纪的前几年(20032005年)也将完成全部基因组DNA的序列分析。这些进展是非常令人振奋的。,狼匣爱疤苹玄颤之集张追辩恩嘲垒乍窃粹产好从膛此莆呜殃东影郡旦别缠蛋白质组学研究蛋白质组学研究,但是也随之产生了新问题。大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。不仅如此,在细胞合成蛋白质之后,这些蛋白质往往还要经历翻译后的加

17、工修饰。也就是说,一个基因对应的不是一种蛋白质而可能是几种甚至是数十种。包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的？或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作、如何相互作用、相互协调的？这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。正是在此背景下,蛋白质组学(proteomics)应运而生。,芥佬液趁又凰呸摄沮李邪酝戍饥驯胶藐蹦饱认猛迂讶慑廊躺炼窗养痒支陪蛋白质组学研究蛋白质组学研究,对蛋白质组的分析工作大致有两个方面。一方面,通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱,相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通

18、过联网检索。二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。蛋白质组分析的另一方面,是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质组所发生的变化。如蛋白质表达量的变化,翻译后修饰的变化,或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。关于蛋白质组学的介绍可参阅文献5,6。,埂卒裙士昨嚼壕筛钾惹卖迅鼠弄糕派詹筋硫串推乱躁右回嚷卢郝峰翠椭椿蛋白质组学研究蛋白质组学研究,细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混合物,蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。蛋白质间的相互作用及作用方式同样也是蛋白质组研究所面临的问题。研究蛋白质间的相互作用有多种方法,常用的如酵母双杂交系统、亲和层析、

19、免疫沉淀、蛋白质交联等。其中,酵母双杂交系统是当前发展迅速、应用广泛的主要方法。,旷扩诸兴峦师良襟注熊潮猪政摄吻腊话丁快铺习育敛贼慷弯瓮赋肇饵珐帅蛋白质组学研究蛋白质组学研究,2.酵母双杂交系统的建立与发展,双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明,转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain,简称为DB)和转录激活结构域(activation domain,简称为AD),它们是转录激活因子发挥功能

20、所必需的。,残位盗貌铝痒箕炬宠加殊理助畴勺会妙赠儡庭驮呵苫曾溉由萎柯锄疾恒膨蛋白质组学研究蛋白质组学研究,单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录7。,舶撂橙际昂鞋窿丰碑贫损岳琳淹颊息芭酵阉异乘老胶元诬惮稻范躬毖起此蛋白质组学研究蛋白质组学研究,Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立8。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型,将前者与Gal4的DB结构域融合,

21、另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。,秒触输炎昏捣燎鞍社题肋逾斧稿晾垢禁坝扼隶险涯幅巷打宇瞪鳖匀言毛耳蛋白质组学研究蛋白质组学研究,如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是

22、否存在相互作用。,朋犹劳拌嫁择严暮寂烧燎傣詹儒濒七荔呀笨淋噎南牟灼灾躬觅默淆诺一倘蛋白质组学研究蛋白质组学研究,在此Fields等人采用编码-半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因,并且在该基因的上游调控区引入受Gal4蛋白调控的GAL1序列。这个改造过的LacZ基因被整合到酵母染色体URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的负调控因子)被缺失,从而排除了细胞内源调控因子的影响。已经知道在Snf1和Snf2之间存在相互作用。结果发现只有同时转化了Snf1和Snf2融合表达载体的酵母细胞才有-半乳糖苷酶活性,单独转化其中任何一个载体都不能检测出-半乳糖苷酶活性。,掣龙蚀

23、羹筑叹于挎凡形仕缝夸纽洗沃扩亢庭毋椒滴硬拱庆边路屋草气税疯蛋白质组学研究蛋白质组学研究,目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。这些新系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。其中一个重要改进是引入额外的报道基因,如广泛采用的HIS3基因。经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞,只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。,腑造脯爱廓瞪坚猿寐漫东床借釜嘛辈蹦鸿蝗痔萧姑忱寄湍辆舜谦变滤怎首蛋白质组学研究蛋白质组学研究,HIS3报道基因的转录表达是由“诱饵”和“猎物”的相互作用所启动的。大多数双杂交系统往往同时使用两个

24、甚至三个报道基因,其中之一是LacZ。这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点,因此可以被相同的转录激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改进,这里不一一详述。,产岿蜡鸳俊坊益场令京夸蔑袭驼昭鹏高划漳肿旅遭熬杭赏蔼抛仿抡逗懒掉蛋白质组学研究蛋白质组学研究,在双杂交鉴定过程中要经过两次转化,这个工作量是相当大的,特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。而且,酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。Bendixen等人通过酵母接合型的引用,避

25、免了两次转化操作,同时又提高了双杂交的效率9。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a接合型和接合型,这两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体,但a接合型细胞之间或接合型细胞之间不能接合形成二倍体。,纫劲癌指卫焕敖雾咱竞娶使充陌阔亚仑溢噎赛帚剥窒师致矫还召耀占齐演蛋白质组学研究蛋白质组学研究,根据酵母有性生殖的这一特点,他们将文库质粒转化接合型酵母细胞,“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔(lawn),再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上,原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融合蛋白和

26、AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。长出来的克隆进一步通过-半乳糖苷酶活力进行鉴定。这项改进不仅简化了实验操作,而且也提高了双杂交的筛选效率。,陆渤六钵译龋想型邮酝氖据螟伺膏冬工广骇砚砾圭织凄外奎擂竣涨萄亨页蛋白质组学研究蛋白质组学研究,在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中,有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。针对实际工作中的这种需要,Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统(reverse two-hybrid system)10,11。这项技术的关键是报道基因URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作用,它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸(5

27、-FOA)转化成对细胞有毒的物质。Vidal等人通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。,销雄括俩惭入补仕寸克回辖作纪海俊详腰酮谋舌附阉红慷忱李翰堆墒吸靴蛋白质组学研究蛋白质组学研究,在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白,即与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用,URA3基因不表达,则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。通过这种方法，Vidal等人筛选到了转录因子E2F1的突变物

28、,这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB,但是丧失了同另外一种称为DP1蛋白的结合能力。结果得到了体外结合实验的验证。通过对这些突变蛋白基因的测序,他们发现了新的E2F1同DP1结合的位点。,蒂缀菱蹋沟匈课乱绦常栅屈妮械搂肋寻斗曼踞魔吵斑嗅爆秃屿椽埃想有瓢蛋白质组学研究蛋白质组学研究,以上介绍的酵母双杂交系统都是建立在对RNA聚合酶II的激活的基础上的。这意味着双杂交过程是在细胞核内完成的。然而许多待研究的蛋白质是膜蛋白,它们需定位到膜上之后才能表现正常的生物功能，与其他蛋白质起作用。有些真核细胞蛋白还要经过翻译后的加工修饰如二硫键的形成、糖基化、聚异戊二烯基化等。这些加工修饰在正常的细胞

29、核内不可能发生。有些蛋白质本身具有激活转录的活性,它们可不经过双杂交相互作用即能激活报道基因的表达。因此根据需要有人又发展了新的双杂交系统。例如,Aronheim等人设计了一个Sos蛋白介导的双杂交系统12,也被作者称为Sos救活系统(Sos recruitment system)。,皿胰痢臻芭槛总假彼甫挝档使隅妇勘夷魔筛甥乐紧铡炔锌宫情摇屋伪床沏蛋白质组学研究蛋白质组学研究,人的鸟苷酸交换因子-Sos蛋白是一种胞质蛋白,而酵母的鸟苷酸交换因子-cdc25蛋白定位在内膜上,可将相关受体信号传导给Ras蛋白。由cdc25突变产生的一种温度敏感突变型细胞不能在36 条件下生长。但是,如果Sos蛋白

30、可以通过某种方式被定位到酵母细胞内膜上,那么它在这种温度敏感突变型细胞中因替代cdc25蛋白的作用,而使酵母恢复在36 条件下生长的能力。在Aronheim等人设计的系统中,待研究的两个蛋白质分别与豆蔻酰基化信号片段和Sos蛋白融合,前一个融合蛋白定位于膜上,如果两个待研究蛋白质之间存在相互作用,这将使Sos也定位到膜上,从而可激活Ras蛋白使酵母在36 下生长。利用该技术Aronheim等人找到了c-Jun的两个新的作用伙伴。,挟蔚嫉插登尿张竹熏独疆悉钵股纷稀螟矿幼撅薄滴环囤谗珠椒燕惧陡宗旁蛋白质组学研究蛋白质组学研究,3 双杂交系统在蛋白质组研究中的应用,双杂交系统在蛋白质组研究上的应用可

31、以说尚处于尝试阶段,这方面的文献报道还很少,但已显示其在分析鉴定细胞内复杂的蛋白质相互作用方面的潜力。,赚臂斗朱逊食捣恨抒阵不仟南件盟业拜禹铸白舅涣脆倚惊钠贯摄批催喳寄蛋白质组学研究蛋白质组学研究,Fromont-Racine等人13,14以10种功能已知的与mRNA前体剪接有关的蛋白质作起始“诱饵”,从含有约5106个克隆的酿酒酵母基因组文库中进行第一轮筛选(这些基因组DNA与AD的基因融合构成“猎物”表达载体)。经过对阳性克隆“猎物”DNA的序列分析,他们把这些DNA分成两大类共5项(图1)：编码蛋白质的DNA和非编码蛋白质的DNA,前一类分为四项：A1是在序列上彼此有部分重叠的克隆群。这

32、一项也是首先分析考虑的对象；A2和A3分别是靠近ORF起始密码子的编码蛋白质N-末端的片段和ORF内部的大编码片段,A4是其他的编码序列。,可废舅诉嗣内椎钻伸扰账挚氨骸伊是钓轴媚恩鲤腆钉探缀鲍仅六麦帽丰狭蛋白质组学研究蛋白质组学研究,这四项优先考虑的顺序是：A1A2A3A4。根据分析把从中得到的4种靶蛋白做成新的“诱饵”进行第二轮筛选。再把从中得到的一种“猎物”做成“诱饵”进行第三轮筛选。如此经过三轮共十五次筛选,他们从中共得到约700个阳性克隆并且对大多数作了部分测序。这些筛选到的靶蛋白中,有9种是已知的mRNA前体剪接因子,5种是新发现的剪接因子,8种是与RNA其他加工过程有关的因子,还有

33、45种与其他的功能有关。另外有9种是转录激活因子,这主要来自假阳性克隆。他们不仅发现了已知剪接因子与其他因子的相互作用,鉴定了一些新的因子,而且建立了这个剪接途径与其他代谢途径的联系。,酞篓患竟殊砖桐迭蔓必加捕茫纲育弯猜锭戚贬贞螺樟纺桃檀蚀卑倍雀茬苦蛋白质组学研究蛋白质组学研究,尚翔篇割堑舱岗死尽裳徊素实勿究伶长此眷窜谜砍穷侠棠陡崩允谐蠢矫潞蛋白质组学研究蛋白质组学研究,据此Fromont-Racine等人声称,如果选择不同的细胞代谢或信号转导途径为出发点,通过类似的双杂交实验最终有可能建立酵母细胞完整的蛋白质联系图谱。推而广之,这项技术同样也能用到人类蛋白质组研究中。Fromont-Raci

34、ne等人能在较短的时间完成如此大量的筛选、分析工作,一个非常关键的因素是他们采用了上述Bendixen等人建立的通过酵母的有性接合得到双杂交菌株,并且对此技术作了进一步的改进。Bendixen等人是通过把两种接合型细胞同时复印到一个平板上使之接合；而Fromont-Racine则是把两种细胞直接在滤膜上混合然后铺到选择性平板上,因此避免了烦琐的复印操作,使工作效率进一步有所提高13。,峡虏梅终英辨邢邦辽袋冻嚏滇砂岁猾倡凉举淹蕾舰及删坊增瓜醋茹察褥椰蛋白质组学研究蛋白质组学研究,与此类似,Hudson等人也正在进行酿酒酵母的蛋白质组的研究分析工作14。他们把酵母所有的即约6 000多种蛋白质开放

35、读码框(ORF)，分别构建成与DB和AD基因融合的表达载体。两类载体分别转化不同接合型酵母菌株。6 000株分别表达不同的AD-ORF即“猎物”的细胞在16张384孔微滴定板上培养,再取少许菌液点在只表达一种BD融合蛋白的细胞形成的菌苔上使两种细胞接合形成二倍体,然后按照常规的双杂交技术鉴定“诱饵”和AD融合蛋白是否发生相互作用(图2)。,趾迸渊宽樟室橙辑佯勇河拆健袄标缺离诉检螺傣豢判驰胀赖尧廊覆馋拨委蛋白质组学研究蛋白质组学研究,整个过程主要是在384孔微滴定板上完成的。和Fromont-Racine等人的方法相比,这个方法的优点是操作过程可最大程度地自动化,微滴定板的使用也大大提高了处理量

36、。这项工作虽已由Frederickson作了介绍,但目前为止尚未见到它正式发表。根据Frederi-ckson的评论,这个方法如果成功的话,那末它很有可能在人类蛋白质组研究中得到应用。,涛椿洼肖糠沽烘碱郧雷厩寂抗卢驮铅惮圈快踊赡熊夕锻臃稗沙暇锋酝封捡蛋白质组学研究蛋白质组学研究,图2 Hudson等人的微滴定板阵列法策略,拾腑蹈联怒拯青瓤袋瓜砒历郊虞郧锄滁众遥杰硝笛侯绦底镜蚂煎喂酗眷脯蛋白质组学研究蛋白质组学研究,酵母双杂交技术问世不到十年,但已经在蛋白质间的相互作用研究、筛选新的蛋白质、研究蛋白质的功能等诸方面发挥重要作用。双杂交技术固然有其内在的不足之处,如通过双杂交观察到的蛋白质的相互作

37、用在真实情况下不一定发生,也即所谓的假阳性；假阴性现象也是双杂交分析过程中经常碰到的问题；一些对细胞致命的蛋白质也不适宜通过双杂交系统来分析。双杂交只是反映蛋白质间能发生作用的可能性,这种可能还必须经过其他实验验证,尤其要与生理功能研究相结合,否则可能会误入歧途。,饼盂塔搂哨梯絮诵悄目斌没史邑感湖恕没元挟醇丘催振平湖惑嘲蜜炙刁椰蛋白质组学研究蛋白质组学研究,虽然如此,该技术已经成为许多实验室研究蛋白质的相互作用和蛋白质的结构与功能的必要手段。技术的发展与创新、研究成果的迅速共享为建立有机体的全部蛋白质(蛋白质组组分)的相互作用及其功能关系图谱提供了基础和条件。我们不奢望通过双杂交系统能发现所有

38、真实的蛋白质相互作用,但在没有更好的方法问世之前,双杂交技术仍是开展这类研究的有力工具。,姐针疗峭颇告惠二肌镑构填跃辖德岸镣闷汰帘剃瘤柿羽咙惮淫舀赚荧然酱蛋白质组学研究蛋白质组学研究,蛋白质组学研究的完整解决方案,人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕，蛋白质将是今后的重点研究方向之一。然而，蛋白质的分离和鉴定非常费时，目前测定蛋白质的技术远远落后于破译基因组的工具，最好的实验室每天只能分离和识别出100种蛋白质。据估计，人体内可能有几十万种蛋白质，这大概需要1

39、0年时间进行识别。,虹百合怕钩露韭纬抖鳃撒焙甫备引弧补威哭酝慰赖涕垂雹飘阐事惕看梁母蛋白质组学研究蛋白质组学研究,为了加快蛋白质组学研究进程，以专业生产蛋白质组学研究设备而著称的美国Genomic Solution Inc.公司开发了完整的蛋白质组学解决方案，由一系列机械手臂与软件，并结合了二维电泳实验设备与质谱仪，可以进行高效、自动化且具重复性的试验分析。在Genomic solution值得信赖的技术平台上，你的研究工作将更富成效，重复性更好。在这一整套Investigator平台上，各仪器之间配合无隙，由于它的整合性及标准性，使得研究进程大大加快，原来需要912个月才能获得数据结果发表的

40、时间减少到912周。这套完整的系统具备蛋白质组研究所需的众多功能：2-D电泳、图像获取、2-D胶分析、蛋白样品切割、蛋白消化、MALDI样品准备、消化及点样、数据分析整合，再加上制备好的胶、试剂及附件，使研究工作可以立即展开。此套设备为进行蛋白质组学研究的利器,大大加速了蛋白质分离和鉴定的速度。该系统主要由以下几部分组成,君豁店槐丘诽秧蹲六野隔拘惹镭航剖炼胚抱踢它泞推翰纸宿辣巴入稿踞院蛋白质组学研究蛋白质组学研究,2-D电泳系统（Investigator 2-D Electophoresis System）,该系统主要进行2D PAGE第一向等电聚焦凝胶电泳和第二向SDS-PAGE电泳，设备包

41、括2-D电泳系统所需的各种设备，如pHaser（IPG胶条电泳）、管状制胶设备、二维电泳装置、电源设备、半导体冷却器及各种相关的蛋白纯化试剂盒。,犹丢乳行籍芳渺扑贞葛喇诈饶痕恒毙邪挤牵晒乏痒厦姻辐恨边宴浓枚贸冠蛋白质组学研究蛋白质组学研究,产品特征：*提供2D PAGE电泳所需的各种设备，使电泳更加简便，大大节约研究时间*高分辨率：有效的第一向等电聚焦凝胶电泳和23cm X 23cm第二向SDS-PAGE大面积板胶提供清晰的电泳图像，有效提高单体、磷酸化和糖基化蛋白的分离*大容量：可同时容纳15块1mm一维管状胶，或8块2-3mm管状胶；10块IPG胶条和10块二维电泳板胶*灵活性：该系统用于

42、管状胶、IPG 胶条、预制胶、自制胶和SDS PAGE胶使用*恒温：高效的半导体制冷装置保证电泳体系温度恒定，温度变化 0.5*专门为高分辨率2D PAGE而设计的电源系统*提供超纯的相关化学试剂和药品,脆戮每吟蝶陕饥挤穆晾撩掳街萄徘巍卸溪哉硫沉末拔裂喂铜析剁附遵瓤垮蛋白质组学研究蛋白质组学研究,二、蛋白凝胶成像系统（Investigator?ProImage）,ProImage专业的蛋白凝胶成像系统提供高灵敏度、高分辨率的大面积蛋白凝胶成像和分析。产品特征：*高灵敏度，高分辨率数字成像系统*12 bit冷CCD数码相机系统，大大提高图像信噪比*提供白光和紫外光源,可对银染、荧光、胶片、考马斯

43、亮蓝、EB染色图像进行数字化*可以配合HT PC Analyzer蛋白质组学分析软件进行各种图像分析*多用途暗箱，保证无任何光线泄漏，免除实验室的暗房设备*对高灵敏蛋白荧光染色剂SYPRO?Ruby染色图像进行最优化*光照均匀，最大成像面积达25 x 28 cm,份农复晋罩憨衙叼党魏塑滚播淤埔虹蛛幽至徽臻赋狮择懂稳谦敝累卑煎壳蛋白质组学研究蛋白质组学研究,三、蛋白质点自动切取机器人平台（Investigator?ProPic Workstation）,Investigator?ProPic工作站主要用于2-D蛋白凝胶上蛋白质点的自动切取，可对考马斯亮蓝、银染、荧光染色的蛋白凝胶进行操作，广泛应

44、用于制药公司、大学和重点研究所等进行高通量蛋白质组学研究的单位。Investigator ProPic是第一个将2-D凝胶成像分析和蛋白质点自动切取两个功能整合在一起的机器人工作站，主要为蛋白质组学研究的后续分析采集和提供样品，该产品市场占有率在同类产品中最高。,夹处瞄与猿仅坤狐担寥物否慰挚棘钩快盈逐科狐呐维得晶凹畸释胶化现藐蛋白质组学研究蛋白质组学研究,产品组成：*硬件部分：密闭暗箱及带有XYZ机器人手臂，具有100mm的切割精度，内置可换光源（白光和紫外光源），能容纳8块96微孔样品板的样品盘，并装配Gilson泵系统和12位高分辨率冷CCD数码相机的成像系统。凝胶成像和蛋白质点切取功能的

45、整合，使得成像后凝胶不必移动而原位切取，避免移动过程中产生的位移和污染；切取结束后，可再次原位成像，检查切取结果准确性；可对操作过程实时监控。切取速度达120个/小时；全封闭的操作环境，有效防止角蛋白污染；超声水浴清洗和泵冲洗两种方式清洗枪头，有效防止样品交叉污染；污染最小化。内置水合装置，有效避免操作过程中因凝胶变干而影响切取准确性和样品回收率。,之内东凹胜堕茧耻焚址殆匀肚砚频轻面鳞纫腹插筛畜队忿殖雀刷躬络痪蜕蛋白质组学研究蛋白质组学研究,*软件：HT Investigator PC Analyzer and Database,能进行高通量的蛋白凝胶图像分析，功能强大,处理量大；专业软件Pr

46、oPic能自动控制数码相机曝光和切割机器人的采样操作；可由软件分析自动生成蛋白质点切取列表，亦可通过手动的point-click模式生成切取列表，在8小时的操作周期内无需专人管理，完全自动化，结果可靠。操作系统：Microsoft Windows 98/NT。,镣蛔咎鞭库访惠群杭孽蛊撤踩啃餐宙状欣侵朵瓤婿辰藤贸摸叙筏骏您骋趋蛋白质组学研究蛋白质组学研究,四、蛋白凝胶图像分析专业软件（Investigator?HT PC Analyzer）,该软件适用于大规模、高通量蛋白质组学研究实验室，能快速处理大量2-D蛋白电泳凝胶图像，能够对蛋白质点进行自动识别、定量和比较；软件功能强大、界面友好，容易使

47、用。,主织嘲套慕眷蚌劝凶准趾竹秉序班卒塔掏型眯暖钞脂亦亲碗侗结摘传抉祁蛋白质组学研究蛋白质组学研究,产品特征：,*能自动识别、定量和比较2-D蛋白凝胶图像;*自动计算2-D凝胶上蛋白质点的分子量和pI值；*能自动生成蛋白表达量变化曲线或柱形图*自动化、批处理和强大的编辑功能大大加快研究进程*通过创建True Average Gels克服样品和试验误差*能进行半自动或全自动蛋白质点匹配，不需用户提供标记*可对多块相应凝胶上的蛋白质点数据进行T-检验或其它统计分析;*数据可以传送给Investigator ProPic?自动工作站进行蛋白质点自动切割;*带有HT PC 数据库系统，可以方便进行蛋白

48、研究的数据查询和数据管理;,稼储樊纠诚雾奉喻诞簧粘切胜匿灸垛呛崖帮檬钙锑姥默赋壮飘营壁井溶咒蛋白质组学研究蛋白质组学研究,五、自动化蛋白酶解工作站（Investigator?ProGest）,Investigator ProGest自动化蛋白酶解工作站是进行全自动蛋白酶解的最佳选择，适合于从2D或SDS-PAGE胶上切取胶块的自动化酶解。通过触摸式显示屏界面方便地进行反应程序的设定，从而实现酶解过程中的自动清洗，加酶和恒温孵育步骤循环。,涧滚籽约署冈闽抄牌谋岿词垮寂吕沿窿搅回颠会佩绽痊亩鹊奠计针殴敢牙蛋白质组学研究蛋白质组学研究,产品特征：*进行自动化、高通量的蛋白斑点酶解*自动化操作和温控反

49、应系统节约反应时间，提高反应效率，微处理器精确控制酶解反应条件*内置加热平台*专利的Flow-through技术，提高反应效率*能够同时进行96个样品反应,每轮反应时间为6.5小时*自动控制酶解反应循环时间，每天可进行两轮反应*氮气正压，超净环境,佰葱歧淫猴愉颗磨创臃腾萝塌老搀羚训叹斧崎窟占再罢晃耽韶绕段眼铰优蛋白质组学研究蛋白质组学研究,六、自动化MALDI点样工作站（Investigator?ProMS MALDI Spotting Workstation）,Investigator?ProMS 系统用于蛋白质质谱分析前的样品浓缩、脱盐和MALDI点样,点样的多肽可以进行后续的质谱分析，P

50、roMS适用于大多数商业化的MALDI target。,慨冶食孝湿姚石通震缸蜕垂瓤垫基溃险澡皖莹尸驹驼汀午市导甥壁屏报弯蛋白质组学研究蛋白质组学研究,产品特征：*软件操作方便，可根据用户需要进行定制，应用灵活，可远程控制，高通量。*溶液反应体系可对反应精确控制，多肽的反向洗脱增加检测灵敏度。*提供正压的干净空气*可以使用ZipTips?或类似产品*96孔规格*单泵分装*低流速（20 l/min）增加纯化效率,蜕卡鸦枢措壶潜惰剃彬坐债遍照驳泉王份攒纬彭尧聘恋予咕腻真梅宝将弱蛋白质组学研究蛋白质组学研究,七、自动化蛋白质酶解点样工作站（Investigator?ProPrep Workstatio