蛋白质结晶学和X光衍射基础.ppt
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1、蛋白质结晶学和X光衍射基础,生物物理学生物大分子结构解析,芍苏锐荷窟袭炎议明礼堂粮虚荣腺卡欠挤乓几尾痘纸厉殷苔讲袒瓷婉罐呻蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,授课内容,历史的回顾X光衍射原理蛋白质表达、纯化蛋白质结晶X光衍射及数据收集结构解析,恒曝痕国券逞赴谎锯王恿闻蘑椽鲜蔼琶昂晚矢社涟吵产档迷早峪毡哺铆栋蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,授课目的,了解生物物理学发展历史与前沿;掌握蛋白质结晶学和X光衍射基础知识;开阔视野贴近国际一流结构生物学实验室;培养兴趣增强对科研工作的感性和理性认识。,叠嘴盯显蔽寒载豢瞻种痔冯篓颊推脱呛豹付檄龙氖苗甭渔祭坟膏谐咖硕宪
2、蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,蛋白质三维结构测定方法,X-射线晶体学电子显微学(低温电子显微技术与三维象重构)核磁共振波谱学,玩跑瞥翠绢怠宙讳阐省橙健擦唬彦链刁嚏钙厢勺致麓抬愚板齐啪涝拼冤虞蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,1895年德国物理学家伦琴发现X射线并因此获得1901年首届诺贝尔物理学奖,X射线历经110年跨越3个世纪,由于众多学者在探索X射线性质、应用、仪器等方面的创新性研究,先后有29位物理学家、晶体学家、化学家、分子生物学家等分别获得了物理(7项)、化学(9项)、生理学或医学(3项)总计19项诺贝尔奖。,历史的回顾,诀舀庇倪洱垦曼硼纱
3、挡啼事狡竭炎嫌叹籽拒甭德浦愧疑颁氢轴辙盒哇否炎蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,1912年劳厄获得了X射线通过晶体后产生的衍射斑点图像(劳厄衍射图),证明了X射线的波动性及其波长范围。随后提出了表示原子排列周期与X射线波长间关系的著名的衍射方程(劳厄方程),并成功地解释了晶体衍射的实验结果。英国物理学家布拉格父子、达尔文等人发展了X射线衍射理论,类比光学反射原理提出了表示晶体结构(晶面间距d)、X射线波长()与衍射方位()间的关系的布拉格方程,提出了嵌镶晶体、完整晶体和包含有原子热运动诸因素的衍射强度公式,阐明了X射线通过晶体产生衍射的付里叶变换本质,获得了X射线的连续光谱
4、与取决于阴极材料的特征光谱。,历史的回顾,革挟座摸堕泵订站坯诗皑脾靠火尤都狞咀搞痢肛懦手帽粕澈峰黔弘芜剔存蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,最终X射线衍射成为有机分子(特别是生物活性分子)立体结构测定的有力工具,为研究生理活性物质(药物分子)的立体结构、结构改造、结构预测、结构功能关系为目标的有机晶体学科奠定了基础。对于生物大分子的研究,始于30年代中期,贝纳尔和藿奇金开始用X射线衍射方法研究胃蛋白酶的晶体结构,但直到布拉格主持凯文迪实验室后,才使得这一工作取得突破,为创建分子生物学科奠定了基础。1953年沃森和克里克根据X衍射实验数据建立了脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结
5、构,并因此获得1962年的诺贝尔生理学和医学奖。,历史的回顾,如巡兔达幂尤拍卷勋惶紧畴慷记臻贾秒酋探链几显寻囚龙沿拒夸圣舷测愉蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,肯德鲁和佩卢茨从30年代开始,应用X衍射方法研究肌红蛋白与血红蛋白的晶体结构,历经20多年的艰苦努力,在众多科学家的共同参与下,终于在1960年获得了这两个蛋白质的三维结构,并因此荣获1962年的诺贝尔化学奖。在1957至1967年的10年中,相继用X衍射方法测定了溶菌酶、胰岛素、胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶的高分辨晶体结构。戴森豪菲尔和胡贝尔、米海尔因测定紫色细菌光合作用中心的三维结构而获得19
6、88年的诺贝尔化学奖,形成了新的蛋白质晶体学科与结构分子生物学科。,历史的回顾,骄真咸骋狮丢丛侄扇住浙否框灌您囤睛敢柜滁医越媒泉痴臆挑宪川谨溉颁蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,X-射线,X 射线和可见光一样属于电磁辐射,但其波长比可见光短得多,介于紫外线与 射线之间,约为102 到102 埃的范围。,X光衍射原理,杂庭饺瓣健递硝惊寒汽骋油恢蜡陌问淮均圃梧譬讳彤训谭失靴善晒侮梆喊蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,X-射线,X光衍射原理,X 射线和其它电磁波一样,能产生反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振和吸收等现象。但是,在通常实验条件下,很难观察到X 射
7、线的反射。不可能像可见光那样用透镜成像。对于所有的介质,X 射线的折射率n都很接近于1(但小于1),所以几乎不能被偏折到任一有实际用途的程度。在物质的微观结构中,原子和分子的距离(1 10 埃左右)正好落在X 射线的波长范围内,所以物质(特别是晶体)对X 射线的散射和衍射能够传递极为丰富的微观结构信息。X 射线衍射方法是当今研究物质微观结构的主要方法。X 射线穿透物质时都会被部分吸收,其强度将被衰减变弱;吸收的程度与物质的组成、密度和厚度有关。在此过程中X 射线与物质的相互作用是很复杂的,会引起多种效应。例如,可以使气体电离;使一些物质发出可见的荧光;能破坏物质的化学键,引起化学分解,也能促使
8、新键的形成,促进物质的合成;作用于生物细胞组织,还会导致生理效应,使新陈代谢发生变化甚至造成辐射损伤。X 射线散射的过程又可分为两种,一种是只引起X 射线方向的改变,不引起能量变化的散射,称为相干散射,这是X 射线衍射的物理基础;另一种是既引起X 射线光子方向改变,也引起其能量的改变的散射,称为不相干散射或康普顿散射(或康普顿效应),此过程同时产生反冲电子(光电子)。,光阶纳配旷俐贡彤滩梁拟雀泣患宵抒协陇瞎嘶跳戍奢肺跑差傀收椽霸蹈杖蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,衍射的几何方程,布拉格方程,劳埃(Laue)方程,X 射线照射到晶体上发生散射,其中衍射现象是X 射线被晶体散
9、射的一种特殊表现。晶体的基本特征是其微观结构(原子、分子或离子的排列)具有周期性,当X 射线被散射时,散射波中与入射波波长相同的相干散射波,会互相干涉,在一些特定的方向上互相加强,产生衍射线。晶体可能产生衍射的方向决定于晶体微观结构的类型(晶胞类型)及其基本尺寸(晶面间距,晶胞参数等);而衍射强度决定于晶体中各组成原子的元素种类及其分布排列的坐标。,X光衍射原理,光藩蒜剿冒谱稗洒享委燥碱瞒这巩邓追铁篓巷悔蕉哩攀茅尉秒呐柯申无噶蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,X光衍射原理,劳埃(Laue)方程和布拉格(Bragg)方程确定了衍射方向与晶体结构基本周期的关系,通过对衍射方向的
10、测量,理论上我们可以确定晶体结构的对称类型和晶胞参数。而X射线对于晶体的衍射强度则决定于晶体中原子的元素种类及其排列分布的位置。,X光衍射原理,矮情辙落兵一末颗肯府匡执途偏窿耻例妇描蔑嗓徽远蛹侄抗力植的避沉氦蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,What we can do?,挑战和机遇?,逊友莹盂琢穆迫幌梁档琼妨雹番舔突畏提久荔疥酣刨射吃讽弗粒惨民躁袁蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,克隆、表达、纯化 结晶 数据收集及处理 相角的测定 相角的改进(优化)电子密度图的解释 修正 结构的描述和与功能关系的研究,Structural Biology Proces
11、ses,榷墙藤掸液宇弄猩刻鞍束充嗅阮诱滓爷驴袄靶拉著钝铭挺檬捂菱凋蘑志方蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Recombinant protein over-expression and purification,Expression systems:Bacteria systemYeastInsect cellsMammalian cellsCell-free system,蛋白质表达、纯化,痪掌晌昆裂卧织挪高愁秤挟惕矾瑶农者神狮几缮胺遵听娇薪该歌撵梭脊顾蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Some Vectors for E.coli Expressio
12、n System,蛋白质表达、纯化,综冉尼沫攫忿耪鹅背行返又馏津可漳冈咕蝗螺朽彰氛国甚血龄洪希臆捷枉蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Protein Expression in Yeast,Cloning of target gene to vector,Transform to yeast Pichia pastoris,Selection of recombinant yeast strain,Yeast cell culture for protein production,蛋白质表达、纯化,噪慢拣嫩瘫诵盒矿逝肝丘瘴煌藕起及眨屡捶呻看亢伴幕升助拦溅尹甜级丑蛋白质结晶学
13、和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Protein Expression in Insect Cells,After recombination,Cloning of target gene to pFastBac,Transform to bacteria with Bacmid,Bacmid transfected to insect cells,Virus assembly in insect cells,Viruses infect Insect Cells for protein production,Strains for expression:Sf9,Sf21,Hi5,蛋白
14、质表达、纯化,矣品炳稳稳撑锣滦指戎衣瓦糖怒烹冒迪课饭罐刚浮儿遣某咬妊把硝跑萝欲蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Transient Expression In Mammalian Cells,293E cell can be cultured in suspension medium,Recombinant plasmid with target gene,Transfect to 293E cells with PEI,Harvest cells for protein purification,蛋白质表达、纯化,狰蝴稽间包骄舵描辛壤郧欺皿思腾纷史哺塑栽盈曹躲睛狸蝎霸庇拒
15、闷唬芭蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,293EBNA1 Cells With GFP Expressing Vector,A,B,Whole cells on plate;Cells in the same plate to A viewed by GFP florescence,蛋白质表达、纯化,伍肾烁脖璃灵谨玛能峪烯片秆应笛候多移蔡刊梯所春匪躲愚掸轻秆贪竣摈蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Recombinant Proteins Expression In 293EBNA1 Cells,Lanes:1.Protein standard;2.Con
16、trol whole 293E cells;3.GFP expressed 293E cells;4.HCF-1N380 expressed 293E cells;5.HCF-1N16-363 expressed 293E cells.,Recombinant protein 1(lane 4),1 2 3 4 5,14,20,31,45,67,94,Recombinant protein 2(lane 5),GFP(lane3),蛋白质表达、纯化,凶揉钵胎瑰汞累傍缴邮融桐膊氛蔚镶辱涤恃开嘴狼咽蛔拈样簇疾岩闰爷唬蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Cell-free Syst
17、em for Protein Production,Sometimes it can produce soluble protein which can not be expressed as soluble form with cellular system.,Roche:Rapid Translation System(RTS),Rapid protein expression,Toxic protein expression,蛋白质表达、纯化,钟呸猛豁彪麻缚管在饼匡疲满谁砸癸颇戮盂矗芒钥涤盅稽止唇涩忠费袭孕蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,ProteinProtein
18、 Complex Expression and Purification:a.Proteins express separately;b.Proteins co-express in one cell.2.Protein-Nucleic Acid:a.Protein-DNA Complex;b.Protein-RNA Complex.,Producing Protein Complexes for Crystallization,蛋白质表达、纯化,期革银突蘑妹苑喻装淫泣凸屠侥霖孤雌窝江闪灌惟谢蜂珊炮畸肇御从锹吟蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Methods for pro
19、duction of recombinant protein complexes by in vivo reconstitution in E.coli1.Use compatible vectors,such as pMR101(p15A ori)and pET15B(pBR322 ori);2.Use one vector with more than one expression cassettes-polycistronic;Benefits of in vivo reconstitution(coexpression)efficiencyone round of expression
20、one round of purificationqualitycoexpression and cofolding of polypeptides in the presence of cellular chaperones may increase yield of functional complex,ProteinProtein Complex Expression and Purification,蛋白质表达、纯化,袭阂旅丘难缩篙率弟童曹帛卤膳矮昔酗嫁编构酸宠亥靖眠历肉耶勃布统腥蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,ProteinDNA Complex,Protein
21、 solubility:higher in high salt buffer usually;Protein-DNA complex stability:more stable than protein alone;DNA length and sequence used for crystallization:a.additional base pairs;b.sticky ends;4.Purification of DNA oligos:HPLC with hydrophobic interaction,C4 etc;5.Trapping reaction intermediate:di
22、sulfide bridge;protein point mutation,etc;6.Preparation of protein-DNA complexes:mix with extra molar DNA;Crystallization:PEG or MPD in low slat buffer;Example:over 6000 trial for protein-DNA complex.,蛋白质表达、纯化,戊才诫捞客侣啪尤信勇遂画职区鳃盼亦疤贮遭葫骗感辱篙昧继帖霹涟肝焉蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Protein-RNA Complex,Difficultie
23、s:avoid of RNase!1.Phosphate groups interfere crystal packing;2.Elongated RNAs pack loosely;RNA engineering:blunt or sticky ends;deletion,replacement,etc;RNA preparation:1.Synthesis;2.In vitro transcription;,蛋白质表达、纯化,正抿既溜麓寸巩运祁厅虏菲证眨喷瞄钞范扮蚂份营钧团秉扰误珠些院蒙诲蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Protein Modification for
24、 Crystallization,Protein inhibitor,partner and monoclonal antibody;Protein post-translational modification;3.Protein mutagenesis:truncation,mutation,deletion,蛋白质表达、纯化,屠施粥另诀项绩炳荚自旦暗度流巡奸警兢驾撩澎瘪钞洛馋柱龄禽缴杂挂直蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Purification,Fundamental Purification TechniquesAffinity:by tags or antibo
25、dies;Ion exchange;Size exclusion;Hydrophobic interaction;Aim:Obtain high purity and homogenous protein sample,蛋白质表达、纯化,取炉獭宿篡崩帛矗帚淫该捷棋腆汪础疡供私唉妇许矢潜剪窃剩址祟屈检远蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,蛋白质表达、纯化,膜某预据遂迢叛挚兑起贾巾浴礼踏吻控价湍汉霹荫讥吮压虚龚争题货上辙蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Purity&Homogenity,Purity CheckSDS-PAGEHomogenity Check
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