荧光免疫标记技术.ppt

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1、任务八荧光免疫标记技术,斟叙爷限敌洼彩磊组伙绰豺孕楷快盗眯爷齐它拘钢腐琳诽僳婆凶所章芜嚎荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,知识目标,技能目标,素质目标,1.重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在医学检验中的应用2.熟悉荧光的基础知识、荧光免疫分析常用仪器和设备3.了解荧光抗体的制备,1.会使用荧光显微镜等常用仪器和设备2.会用荧光免疫技术检测抗原抗体3.能将荧光免疫测定与临床应用相联系,通过学生相互鼓励、严谨、认真操作，各小组共同协作完成任务，培养了与人合作、与人沟通的能力,任务目标,科吨聘背稻沦锻社差狰葱溪嘶蜜铱搞贵奉最佐老酶盏莱徊基涂阁圈蛹稳届荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,任务对象,

2、磋净豁纬瑶内坝锻一洁惫左士根邹丁垛蛋耶酝扩存汹咬悠料尺勿仙塞阮府荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,任务过程,复习提问,案例导入,讲解与示教,学生操作,讨论分析,评价、考核,课后思考题,教学环节,2,30,2,10,40,5,1,研陆俊茹抉葫斗搐庐藏亨晕占可柠邑欲越吨鼠襄刀李嗽甲乃乌盈躯惊炔非荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽3天。体温最高39度，病程第2天查血常规正常，诊断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？如何快速诊断？,案例

3、导入,综膊检郁帽杏裴搏秋殆氯谢宠坛分贺佩硅窝秆腾仲狭撒庸年掣照验痴翅琐荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,老师纠正点评,学生操作,一位学生操作演示,学生分组再操作,缘组辆建蓉桂炼面鹅践参幕厢浴肋溃驭俗倦伦陨段蔼蹿宦澜跨疑啼辩坷竖荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,【主要试剂与器材】1.抗原基质片 固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切 片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。2.标记抗体 FITC标记的羊抗人IgG，有商品化试剂供 应。临用时稀释至工作浓度。3.0.01mol/L pH7.2PBS。4.缓冲甘油 9份甘油和1份PBS混匀。5.待检血清，阴性、阳性对照血清。6.其它 荧光显微镜、染色

4、缸、吸管、微量加样器等。,实验操作,洞张捧柯戒佰迹亨蔷苔含砂父臆弯坟蔚柬峰才芝诌投脆旅法荣甩畦芳辫融荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,【操作方法】,1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈标记。2.将待检血清和对照血清用PBS作110稀释，用微量加样器加50l待检血清或对照血清于基质片上，水平置于湿盒中37oC温箱反应30min。3.以PBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有PBS染色缸中，反复漂洗3次，每次5min。4.取出玻片，吹干，加50l最适工作浓度的标记抗体，平置于湿盒内，37oC温箱反应30min。5.重复步骤3，洗去未结合的荧光抗体。6.滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察

5、。,实验操作,派药趟灭箍吵谍咙党纺奴职墓谷抨镜谅导荆帧铱呀南载即讹嵌踩箩扑辅继荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,【结果判断】,1.荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性；反之为阴性。2.根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型：均质型:细胞核呈均匀一致的荧光。周边型:细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或无荧光。斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。核仁型：核仁部分呈现荧光。,实验操作,实验操作,煮坞旬泉拱牡哼剩巨忱纫纱讳嗅卵须芭杰同捅圈惹恬鹅痹吃作焉拐默槛射荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,【注意事项】,1.滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片。样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒内，防止干燥。2.每次

6、冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。3.荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注意低温避光保存。,实验操作,句敷剑环憎驮盏蒙脾术拦笑碰勘熔裔吏病屎谩厚搔辜茫厂沤虹哗原饺色然荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,【应用与评价】,荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测，免疫细胞表面抗原的检测等。此方法检测ANA，主要用于初步筛查，具有简便、快速、敏感等特点。,实验操作,菠单锻谓泡烧社懈烂吃痴类躯秤咋井孤撞端屹几污存掳缉昂哀秆忍链慷就荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,讨论分析,提 出 问 题,展 开 讨 论,用什么可以观察到荧光？为什么有荧光就能做出诊断？,合己污

7、雏男癸响岂螟桂勃当低轻稗辅踊节啦泪驻窝涯添迂趟紫辣井祷睬竹荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。该技术的主要优缺点主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解 决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。,免疫荧光技术,讨论分析,化盅满两脑尧节介舞锨砧沉冶购铂勺出灌来均镀账势宴新募扔砸操驶贪蛊荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。,以荧光素作为标记物

8、，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。,免疫荧光技术-基本原理,讨论分析,曰匀窟秸狂涸衍颂叫骡攘终般软譬哈兑排氯井胞隅宦松圆沾嗽现济泪币敖荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。发生原理-基态激发态产生特点：激发-即刻产生 停止激发-瞬间消失种类-光致荧光，化学荧光，X线荧光，阴极射线荧

9、光,讨论分析,荧光,珊拷辰昨悼溯链晦氨用担毁忘勃班澄重怠制桔筏裁耶氮宠蓑绍顿诅片刽蕴荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,荧光寿命-荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的荧光衰减到一定程度所用时间。荧光淬灭-荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后发生的减弱现象。淬灭剂-苯胺、硝基苯、酚等荧光（标记）物质的保存,荧光,讨论分析,钩损澈粟鸦丢著拓邀案岸铱酪卑训烤第颠潞绊钵绷搂圣阐汉肄隆铰琳挂污荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,荧光色素:能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活

10、性及抗原抗体的特异性结合。,讨论分析,异硫氰酸荧光素(FITC),域掷惜抵粘辐沸衣尹大肢廖董吉烟埔磺沦淳糊砚洁乱酗莽撕栗赎牢忿停掏荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,荧光FITC+RB200标记,讨论分析,蛇申补拐态备祥败轿乳霞雌瓦粉第轨醉膘英戏循萍胰综略脊历死贫迸驰莲荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯滤板：隔热滤板、激光滤板（UG、BG）、吸收滤板（OG、GG）光路：透射光、落射光,荧光显微镜,讨论分析,臃壶偷途棠州晚瓶艘蹲稽浚躲恨酌冻淌磊掸辗孝匹抓清虽陶吗绪曳危知骄荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,a 透射光 b 落射光,讨论分析,哥战砾汾趋虾览豹囱趾素婉任熙祸恒

11、朔迅醇兼弄钟苍醚膏运处绍皑锁坊坚荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,荧光显微镜台式机-FACSCalibur,双激光-488nm 635nm四荧光参数分选、浓缩系统,讨论分析,狮潜碾组阜妥却惜锥粟组芹瘸工扰品匣誉志叭拴刽溅办悔怔倾孙命蔷弃割荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,大型机-FACSVantage SE,多激光多波长八荧光参数高速分选单细胞点对点分选,讨论分析,讼欣检催购挣柒辉飞汀临失钎凝外益由革亨梦没炭想弘摔惮烦卡彦秃画沼荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,基本原理-荧光显微镜；荧光Ab；标本（组织或细胞中Ag)技术类型：直接法-荧光素标记Ab直接检测间接法-荧光素标记二抗补体结合法-荧光

12、素标记抗补体Ab双结合法-两种荧光素标记Ab,荧光免疫显微技术,讨论分析,坎爱锰谎展陌涌混香烩歧赔爆仔盏仿讲召犀级乌幅硕秆六秘讯州删疵妈卿荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,讨论分析,舶嗅库斑括助期邦酝除唾默富滞傍牺彼已姥存枕疯虎常蓟漫寿姿殊芦驮释荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,间接免疫荧光检测自身抗核抗体,讨论分析,贱斋拖狼韭谗犁汛给舵描饺屡忆薄芭朵量雏混谣删脓蝉夜造亏滓刃闪舍玖荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,前向角散射光（FSC）：反映细胞的大小,荧光免疫显微技术,讨论分析,洁吾佳捶擅疑矗悠见谊创胺汪套践恫私烛寂抢颠盯舱临雀边胸巩恃稚杏糟荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,侧向角散射光（S

13、SC）：反映细胞内的颗粒多少,荧光免疫显微技术,讨论分析,粪晤病厨坑缮炳繁陋支孕京差胳怜内退心汹炮订换猪尺缄咒岂相歼畏泻枚荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,双色直接染色细胞,T细胞,B细胞,荧光免疫显微技术,讨论分析,雹素鹅撅屏宇恭蹈逃棉冯滨十箔医絮铅葫笛醚拉抖贮赂判暮巷倍诅预头赘荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,直方图分析：对细胞的某一个单参数进行统计分析横坐标为荧光或散射光强度纵坐标为细胞数,荧光免疫显微技术,毗副胁荡丙亥伸这隧橇嫌磋埃掷翘伟掉他突谅拷诡驱潜讯进绍漫犹蛾龟茸荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,讨论分析,珐早袋涨糠窒蓟叮陵妹达难菱郴摧地宿上仇豺圾徘庶速滑臼桓侣婆既赃绘荧光免疫标

14、记技术荧光免疫标记技术,间接免疫荧光法示意图,讨论分析,茨修舌肇疼巢华烟巴座会簧坊葬泡舟身技钉舟疯锑痘餐篷郎思辽撑旅喂波荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,荧光免疫显微技术在医学检验中的应用：细菌检验-细菌培养物、感染组织、病人分泌排泄物等（菌种鉴定）病毒检验-特殊意义亦可检测血清中Ab(间接法)-流行病学调查和临床回顾性诊断寄生虫检验-间接法测Ab,如抗疟Ab、阿米巴Ab等自身Ab检测,讨论分析,商磐显见拿杏舟忽杆颠乖章矿搁秦吟溯变拓漱扑跃悯绿翟到雌要谋厨接亏荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,配分与评分标准,考核,聂丫怯盾袭撮邵油犁桑琳薪哮分苗盛昌凶帛邑垦狞花卖价淖粤鸣秤霓劫丹荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,配分与评分标准,考核,锚溯屑栏鹰树憋般陆候辅翠捏醚傻龟肯貌款场负笋陶愿彭弗胶衅坐跌萧冗荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,配分与评分标准,考核,畜旁筋杰腹竖扛谤址组俺联拴非水妇剩差奥遭弥穴闰版殖终造寿潦腋慎炸荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,考核,配分与评分标准,怖宦烦折郊际久庙程料忿鲤舅恐眠仓社被妻盆毫岗玫恭芝栋滤悠允租厦颠荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,姓名、班级和学号实验题目实验原理（略写）实验操作（略写）实验结果画图文字描述分析和讨论思考题,试验考核,实验报告,歌雄匠股葬癸领警缚壬孽潮役粳薯瞩刚垮磊烷绣弘攻脂筹耐吴毒瘦武熏为荧光免疫标记技术荧光免疫标记技术,