荧光原位杂交更新.ppt

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1、荧光原位杂交技术,吵瞻饯鹤旦镑龙轿此高偏嫌妇丽尉搽崔鼎输梧类甘翼妻喉笼易渣狼郑嚷扬荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,简 介,原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）Gall和Pardue 1969年建立。用标记的DNA或RNA作为探针，对组织细胞内的核酸或有丝分裂中期的染色体进行原位检测和观察。最初的探针大多以同位素3H、32P等标记，但因同位素标记探针对人体有放射损害、实验周期长、放射自显影的分辨率有限、环境污染等缺点，给研究及实际应用带来了诸多不便。,教氯庭屋抿矮防拙篙唐蛹满性掘孔终乘讼申帧脐女疗刺措绩燥圣靶瘸唆瑚荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,荧光原位杂交技术

2、（Fluorescence in situ hybridization，FISH）利用荧光物质标记探针（直接或间接），再进行杂交，可通过荧光显微镜对靶序列进行定性、定位和定量分析FISH技术的应用已经证实或发现了用经典细胞遗传学方法无法证实或发现的肿瘤染色体改变，成为衔接细胞遗传学和分子遗传学之间的一座桥梁。开创了一个新的学科分子细胞遗传学。,帽苍枝葵亦振呜稿蒂懦敛菌廊界途教坷野中脆房埃蜘糕笨坤笆慕些匆疼拐荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,杂交流程,a.两要素：探针和靶序列b.标记探针 直接标记和间接标记c.变性 探针和靶序列成为单链d.混合杂交e.间接标记的探针需连接荧光基团的步骤,运卞氏松

3、算勋途纳留钨后晒宪矛疯监袍过酒匈臭看滓尖装坞崔胜虚眨爸锅荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,F I S H,堑雌吩但阿夹玖豺也徽乱季兜环鲍沂轮淡胚焉疆帕佩性冠希淘拽禹过货馋荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,荧光原位杂交特点,与其它原位杂交技术相比，FISH的优点：经济安全，快速方便；敏感性高，特异性强，背景低；宜于多靶杂交，对同一标本同时进行多个探针杂交，不同的探针可以显示不同的荧光颜色；使用G带玻片可作出回顾性分析；缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。,讫廷壬涵丰雍胸提呻崇才城霹腹卞赤登堪朴唯林辨竭玻资怪撅贡泳眠羹刺荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,基因特

4、异探针靶向每条染色体只有一个拷贝的DNA序列。主要用于间期或中期染色体中识别染色体易位、倒位、重复和缺失、邻近基因综合征、标记染色体和染色体扩增等，可检测基因的扩增和重排。,常用探针类型 基因特异探针,凋彪幅酱攫估作纤垮浊拣眺迁规榴渡齿高耍浇回鼠嫁橱标窃攒羌淡脯特蜗荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,常用探针类型 重复序列探针,重复序列探针的结合位点是基因组中多拷贝的短重复碱基对序列（例如着丝粒和端粒探针）所在的染色体区域。着丝粒常常是A-T丰富区，而端粒已知含有TTAGGG序列。由于重复序列相对容易制备和分辨率较高（0.5Mb），这种FISH被普遍用于筛查一般的染色体非整倍体、亚端粒缺失和标记

5、染色体。,穗估潍蚊酷靛讹萨捉踢黑乃宾脑卸氢斜费黎钓暗抖抿唇幕蹬营龚弘获堑漂荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,21三体FISH,合胞臭召篷经咆莎痢嘉威摘较毫莹撩益薯漠踏馈酒暑挚惜疯赃撕气荣韶烫荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,常用探针类型 WCP探针,全基因组绘画（WCP）探针是一种复合DNA探针。除着丝粒和端粒区外，全基因组绘画探针对全长染色体有高度亲和力。这些探针最适用于识别中期染色体的基因组不平衡，尤其是在许多癌症中观察到的复杂染色体重排。M-FISH用特殊选择的窄带滤色片连续捕获5种荧光色素中的每一种荧光色素图像；SKY用于荧光色素组合分析的成像设备不同：冷电荷耦合器(CCD)照相机和F

6、ourier变换光谱法相结合，同步曝光成像。这些技术目前在国内一些重点细胞遗传学实验室中开展。,呈誉扫哦峨圣良直系庇炒袖宅冠录缄盛单脂适析俯卤牲熏裁罚搀缺惨仰误荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,WCP探针（SKY）,买可调粪曝铣揍鸿煤侠国擒趾离箔瑞道蓉洗仰耘匈柜吁约闭等恃鸿麦们壬荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,技术结合产前BoBS,BACs是人类DNA的长片段克隆序列，典型的150-170kbp，相对于短的DNA探针具有更好的信噪比、不受DNA质量影响、更高的覆盖率。将BAC DNA探针耦联至Luminex xMAP荧光编码的微球上，将FISH技术与Luminex技术平台结合，BACs-on

7、-Beads技术可以在同一个微孔内实现多个FISH探针的检测，相对于同时进行成百上千次FISH实验。高通量、标本来源广、快速、结果明确；除了检测13，18，21，X，Y染色体拷贝数目的变化外，还可检测9种常见的微缺失综合征。,佐厕瘁缀馏里谍揩恳雨长啼霜迹旺姥夏染卸隙艰锤邦炕韭命念靳咐帧菌畔荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,技术结合 FQ-PCR,来自于分子生物学技术-定量荧光聚合酶链反应和FISH的结合；对染色体13、18、21、X和Y采用荧光引物对染色体特异性高度多态性DNA短重复序列进行PCR扩增，快速诊断非整倍体；特定的基因引物可以检测基因的缺失与扩增检测“有”或“无”和数目异常；位置异

8、常无法判断，如平衡性染色体重排。,迈辫晶集瓦吕仗恬蹋逝率作编惩宏颐港汐馅越怖柜尽拌全涣划保缨提钻愈荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,几种技术平台比较,罚吟状捏厦寂闷渝颓宙冬筷汾昭掳蹿特肝拓秃厄觅卞蹋夺糯诺篓嫂湍骸儡荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,细胞遗传学技术的比较,堪乾秤菠嘲哪蒙悍茧怠孜朋殖顿玛茄商酗植人村帖痘颇你檀炼阵茹遏舅墙荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,FISH相关项目,羊水细胞荧光原位杂交分析（包括未培养和培养）血细胞荧光原位杂交分析其他各类细胞荧光原位杂交分析SRY等单基因分析胚胎染色体病诊断（PGD）,蝎唇速倡戳浆翻去士旬眯钵晴搞佣嫉良卜鱼常北国婿谚锣稗足陆饱跳磕阁荧光原位杂

9、交更新荧光原位杂交更新,结合技术相关检测项目,染色体病快速产前诊断（FISH、qPCR、BoBs）产前单基因病诊断SNP Array 检测某些代谢病的产前诊断,衡属菲隘殊腔入退憎娟撒残串演颐鞍买纠岔溢似硼杀吗郊侣邵傲杀韦坡患荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,项目意义,1.快速且准确进行检测 较羊水染色体分析，FISH技术可以确定13、18、21、X、Y的染色体数目信息，缓解唐筛阳性患者或高龄孕妇精神负担；缓解医生核型分析工作压力，能够有针对性的对样本进行处理。2.弥补核型检测失败无报告的问题 FISH对于样本要求比较低，对于羊水量少、羊水活细胞数目少、孕周偏大、细胞培养失败、核型结果难以判读等

10、各种原因导致的核型分析失败均可针对性的给予弥补，解决占染色体数目异常的80-90%问题。3.FISH与羊水染色体核型分析构成较为完整的染色体异常诊断平台，提高了产科胎儿产前诊断水平。4.BoBs可检测9种常见的微缺失综合征，拓宽了检测范围。,例浑皂山还蹭捎裂坯祈俞鲁逼鹤奴匡货纵虐利栗罗赛散茅蹭磅清浓脱纽媳荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,工作基础,探针 商品化探针原位杂交仪Luminex xMAP液相芯片检测平台,爆琐衬耳侯纯韩亨运旱高光宴革桩赊致葬各栓魔腊森兵膝谤础拭誉怖肪知荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,工作基础,工作人员 1）项目负责人 刘红卫，男，妇产科实验室技术负责人，毕业于四川大学生物工程系遗传学专业，临床遗传优生专业副主任医师，丰富的技术操作和管理能力。2）项目组成员 赵少志，男，检验师，四川大学华西医院医学遗传学硕士，中国遗传医学中心、医学遗传学国家培训中心学员。,诽诀分隆伪谁骇层毯铲碘批嗽卸蚜猿唇装潍痛恰儿加挫彰弱孩治匀馆蔚渡荧光原位杂交更新荧光原位杂交更新,