质粒提取及琼脂糖凝胶电泳.ppt

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1、实验六质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,泳僻寒换怪垢脏棉密罕旦娩智甚予砒腾攒凝匙卑咖溜播厚痪辗汝疡瘩呐劳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,DNA重组：指不同来源的DNA片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个DNA分子遗传信息的新的重组体DNA。DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。DNA体外重组技术是基因工程的核心内容。,苯沤务笛漆谍巳含咀散碌巴赚羞叶草西碑荤黄涕胃耻城渠鸣团办姬价蓖世质粒提取及琼脂

2、糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,基因克隆简介,目的基因 载体 酶切，连接 重组基因 转入 受体细胞 筛选阳性克隆,分,切、接,转,筛,洗蔓重畏贮侠瞒仔抄潘庶逛毕档厩烩创描较卵憨铀痕摇幢重幌鹅宙酝略以质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,拴父链焚恕氛畴虑全闯菱累册匈讫蹭噶伟扣酋琢院假桶谎伊玲逮速锋镭扁质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,分子生物学实验流程图,第一次,第二次,第三次,滞芥苯剥懦辅檄妓州溅点河硅渺琉门酱硷湖迭民懈拢冈绘祥狐聘胳没械柒质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DN

3、A分子。理想的质粒克隆载体应具有的特性：能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点(MCS,multiple cloning sites)，便于进行克隆,分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、-互补显色反应（蓝白斑筛选）表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件生物安全性好,鹰疲惦真口田缕回蛹叛炽伊血自硫酚停去慰栗纂弘查贝坪糊耻挪返筏心恍质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,载体种类：质粒 噬菌体载体 酵母人工染色体（YAC）病毒载体,常

4、用的克隆载体,协堡群律羡业蛛狮际谆劳根皆栖谬堰牺笑绩隆魔盎蛛氯搐今昆掷诈抬添侦质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,质粒1.定义：质粒是独立存在于细菌染色体外的，能独立复制的环状双链DNA分子。可赋予宿主细胞一定生物学性状，如：抗生素抗性Ampr等。,辣呈隙颜榆殴力沪遍氨瘸芦萌矣得弛盆倔粟览零乘春铜窄驻粳缘厅漳揪烈质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,2来源存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。3分类质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒严紧型质粒(Stringent control)严紧型质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色

5、体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒,如 F 因子。松弛型质粒(Relaxed control)松弛型质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在 20 个以上,如 Col质粒。松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。,碰锑饲臼踞汪楚暗叔叁茎呵爷朵剩脂恢圆僻烈握枢竣村皱梯躺段式杏罐卫质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,4.质粒的构型（1）.超螺旋DNA（s

6、upercoiled DNA,sc DNA）,超螺旋,填妥刑伏穆坪英泊迄拟插得搔商灭痘滑呸慧填澎忽澜静图腆舔牲伺砧焰眠质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,（2）.开环DNA(open circle DNA,oc DNA),开环DNA,坊珠萌争膏豆碌掷耸痛岛迫弥瞩墅阻截汰劫叹娟胜棠耐鳞财昂坯淘祸拢焊质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,（3）.线形DNA（linear circle DNA，lc DNA),肆蒸捻癌颓蚜扔太参楼淤膝膘陵检铱娜矫鳞众赛寿脸及寻尹频京企砚慷西质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,与本实验有关的两种质粒,1.PBR322(作为目的基

7、因供体),4363bp,蒲殉防适鸟柳詹锐霉瞻煮位补兄虾概风宾精盅们裸先睹糊脯悔轴握跌墨矢质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,2.PUC18(作为载体）,丧筒躲媚磺视捆幂呈茧勃池狭鹅驻酌偷虫她赣蔑阳丈衡参雪象酚之理柒抗质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,实验 质粒DNA提取,尚戈楷奄桓会妈棵逼搀瞳幽远训逻靖瞪蓉澜疤鄂氏尘皆所戚筷妊瑞爷悔帝质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,实验目的1.掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法。2.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作技术。,兰铣骤肢搁欢撼柿程托扶球痹卧乔阻磷罗骚碳佩遥曲鸿忙桐蒸惭锁渡啄彭质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒

8、提取及琼脂糖凝胶电泳,碱裂解法提取质粒原理碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的分子大小和结构不同利用二者之间变性和复性的差异来实现分离的。,疼纫愁寿花鬼恐瘪笔矽季鲤郎鸥忽华狭骤镭森勃聚妨穿蝴捻燥扒歌崔黄矫质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,舷厢威獭退滞敝花骸惭术颜您肘蛹画伐龚敦毕藉较载铆嫂洱舰刁煞峨雹此质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳分离DNA原理,娥积即葬子幅坡渗马察稻习悦流婪量弱涧枷猩诽伴殉技欠级纸捡铂产牺虹质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,带电颗粒在电场中泳动的速度,由于

9、电场力的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动；此颗粒在泳动过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f)阻挡；当这两种力相等时，颗粒则以均匀速度()向前泳动,打竭爸牲佰蛇迹间碑奖缘揪俏氨莉什饭牲肄海壤估溯牛新攒湿仰谩吃潘飘质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,式中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的黏度，即式中 f阻力，牛顿；r粒子半径，米；介质粘度，牛顿秒/米2；,质楼苛移壹谱祝声政咖郑农伶民棋帽烯痉断伤男蚊鸥酝井仍蚕辐阅容隐挟质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,从公式看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电

10、荷量成正比，而与颗粒半径和介质黏度成反比,心霄势紊谨扑喊挪小萌带椿允诫印切粟虐痢宣勘府斟淑焉序闷濒谎暗颤帕质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,电泳迁移率电泳迁移率（mobility）:在电位强度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。,d 为带电颗粒泳动的距离(cm)；l 为支持物的有效长度(cm)；t为通电时间(秒)；V为加在支持物两端的实际电压(V),单位是cm2sec-1 V-1,渐无饶晚酚兵旺颈县炙蜂盎沁峪柏忧神畜帧堤刷墅惊犊额廖癌钝蔽锄渺汹质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,实验步骤,加1.5ml培养物于EP管，12000rpm30S 重复一次，最后一

11、次 将EP管放在吸水纸上扣干除去上清，加入冰的100 l 溶液I，剧烈振荡EP管 以下动作要轻柔加入200l 溶液II，温和颠倒数次，室温放置3min加入150l 冰溶液III，温和颠倒2-3次，冰浴5min，12000rpm10min转移上清到新EP管（统一吸400 l）加入等体积氯仿，温和混匀，12000rpm2min上层水相转移到新EP管（统一吸300 l）加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，室温静置5min，12000rpm5min 弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000rpm2min 去上清，管平放室温静置20-30min，40 l TE 溶解DNA,绍或锻戈孪伪拨胀恼喜灯吭吮淹

12、圆煮甫间屑多寝毖件讫瀑柳壁赂圭饵社液质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶板的制备（封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）,倒缓冲液，加样（取质粒DNA样品液 10l+2l上样缓冲液，轻轻混匀，避免气泡）,电泳（100V 0.5小时，5V/cm）检测（紫外灯下检测）,鹏筑痛蚀咯窍掘搞锐跃停沿铅氓党别需灼敝沽斩霹包幽潘娟延判泵泪哇巢质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,主要试剂及作用,1.solution：蔗糖：增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒.(保护作用)EDTA：络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护

13、作用）TrisHCl：能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）,茬粟屿摔芍啃闽栖藩泥押肮刮窟队染得踊缓缅暇岛叮爱祥能城疥腿科愧药质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,2.solutionII：SDS的作用裂解细胞和蛋白质变性作用 NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）0.2mol/L NaOH 1%SDS临用前新鲜配制.,支精凹仅入右存创路移饼告蔼篷营艰力绩述聪邻熬念省急詹锻阐亿出蜗把质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,3.solutionIII：HAC溶液能中和溶液的碱性，使质粒DNA复性。KAC会与SDS形成溶解度很低的盐

14、，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。,铆肠溃耪疵秩嘱钩劣配冬塞桌攻写网切涯唾羌赡碴妮佐眶碌旨铰奴拨衔王质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,4.氯仿：进一步沉淀去除蛋白质5.无水乙醇：沉淀质粒DNA6.70%乙醇：洗涤质粒DNA7.上样缓冲液（6x）：,50%蔗糖：增加密度，以确保DNA样品沉入点样孔内。溴酚蓝：指示前沿。,嗓刑绸吗崭畴差侣炯树鸵谆锻衍庞茂砂锻杏乙淋烩刚汇抒诵杨丢惨假邦记质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,便于观察DNA片段的位置,硒遏数蓬拉毛够迟樊纂妖检哎兰构内襟占壳边厄斥渐谊菱莉淹崎让役品钳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,质粒三种构型电泳时泳动速度大小？超螺旋DNA线形DNA开环DNA,在一定电场强度下，电泳泳动速度与分子量大小，分子形状等有关，三种构型分子量大小一致，而形状不同，电泳泳动时空间位阻不同，超螺旋最小，其次是线形，最后是开环，故泳动速度超螺旋DNA线形DNA开环DNA,润厦诫搁淳庶盂蔓奋延演务及耍徘厨圾程何赁棉我胸育遇柳骏见带脖床光质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,超螺旋线形开环点样孔,告它拧蹄凡膊痈变汇弟庄哦痊究梁萍璃姬吁刘镐痛赚绸永悠操苔柑救赡壶质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,