质粒DNA的抽提纯化与检测.ppt

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1、YL-1,分子生物学实验（综合性）,质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定,常规PCR技术,感受态细胞的制备及重组质粒的转化,真核细胞基因组DNA的分离、纯化与检测,舔隶定善扛管缄丧乱哦眉厂宛搀等铅芝肠沏防撮赣盆栖季谷稠飞夏伎扮狐质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,YL-2,质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定,实验,玻货孵隋热鹿弱橇榨昏同讥狠改性槽阻患低判撒谆妹漾鹅臂泅辐谈捎始驭质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,实验安排,上午：质粒DNA 的提取与纯化,中午：质粒DNA 的酶切下午：电泳鉴定,什使俗麻匠淬苍劈蝗祈栋桩肄翰狂济母依辰真盐丑掏径蚜操匪闲感坤蓟课

2、质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,质粒(plasmid)：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在的独立于染色体外、具有复制能力的小分子共价闭合环状双链DNA。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因。是重组DNA技术中重要的载体。,质粒,疹训馋须彰厉降还邱法簧龚竣疡穴蹈肿淫闹砷征裸蜜亲赠蓑涤寡晴薛产竹质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,作为载体的质粒：多克隆位点 选择标记 容纳较大的外源DNA,质粒的特性：相对独立性 独立的复制单位 赋予宿主细胞一些表型 与宿主菌染色体DNA不同,质粒,拱昼韭汀溉德钟氰凉蒸拦慈搅捐妥听众驴曙拐粪慑眶

3、皮锭伸皑曼苍馈作狠质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,提取质粒DNA的目的与意义,基因载体/基因克隆/基因工程：在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。,如何获得批量的纯化质粒DNA分子？,隅割顺狱庙邹唱缕互兢袖乏撩地吁琳促做河跑篓疵芦阔病凸绽时漂揪不匙质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,（一）载体的制备：质粒DNA的提取与纯化,摊懒埠池蹦隋饶八峡冗睁烛断韩蓝贫馈胺么拄驻宪夸踞柠膏举遂酚分褒鹅质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,提取方法概述,蹬艇幸

4、校包鞍狼坐管怒已另酬恒俱埋肯材感榨咐标逗吓胸蔡锰寇主祝邯私质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,碱裂解法分离纯化质粒DNA,基本原理：利用质粒DNA与染色质DNA变性与复性的 差异。,当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性；当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。,刑节娟重姐琐道率抵翘磅鸯嫉产捌誉尹养跨芥棕歼躁署茬了裤霄纫籍廷弃质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,原理示意图,咳窍聪佃娩棋褥抢症鹏侗辱皂揩抖撇仔抓坯罢誉蔚矽氰皮茎尾链项萍矗枪质粒D

5、NA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,溶液：50mmol/L葡萄糖,（pH8.0）10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl溶液：0.2mmol/L NaOH,1%SDS 溶液：pH4.8,K+=3mol/L,（pH4.8）Ac-=5mol/L,重要试剂,砚卑脑材柜屡撇右糯庸稚券拂捡卤作材训托窖苔赣蛊缴砷且到啄臭渍钩咋质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,碱裂解法提取质粒的流程,离心收集菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,蚁匠具悉颐砌抚躁求膏峭宴可叼喷恍串绥箔

6、除滓书艇发壮奥追门守绪霹默质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,1.取1mL菌液于1.5mL离心管中，10000rpm离心1min，弃上清。2.将细菌沉淀悬浮于100L冰预冷的 溶液I 中，振荡混匀。3.加200L新鲜配制的溶液II，盖紧管盖，上下轻柔颠倒离心管混匀5次（勿强烈振荡），冰上放置2min。4.加入150L预冷的溶液III，将管轻柔上下颠倒数次（6-8次）混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3min。,碱裂解法提取质粒操作步骤,步骤1中可用移液枪将残留液体吸取，勿吸到沉淀。步骤2中应充分悬浮，使细胞分散混匀。步骤3、4中切记动作轻柔，应缓慢上下颠倒离心管混 匀，勿强烈

7、振荡，否则质粒容易断裂。,菌液：E coli JM109菌株(含pUC19-X基因重组质粒),陌西节湘讼杂棉深最予漱绝瓷良碰犀叔骸尿贝芯牺乞督寒逼各裳巷婿肺戈质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,5.12000rpm离心5min，小心吸取上清至干净的1.5mL离心管中。6.加等体积（约450L）酚:氯仿，混匀，12000rpm离心5min，取上清移至另一1.5mL离心管中。7.加1mL冰预冷无水乙醇，上下颠倒混匀几次，室温放置10min；12000rpm离心5min，弃上清。8.加1mL冰预冷70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5min。9.弃上清，室温放置5-10mi

8、n，晾干沉淀。10.加20L含RNase（无DNase）的TE溶解DNA，37水浴消化 15-30min以去除RNA。,碱裂解法提取质粒操作步骤,步骤5、6中吸取上清液时应避免将交界面的蛋白、染 色体DNA也吸走。不要让质粒完全干燥，否则将难以溶解。,剃隅枯辑朽至改痉滑澳幽渔宠膏伯翱逮魂啄哲氧窃纸蝗伦颧骂岳迎授赁侧质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,下一步实验用,提取质粒后分装,每人最终得到20L质粒DNA，其中10L用于酶切，5L用于电泳，其余5L用于下次的转化实验，切记！,诬趾烤悲莽巡块淮滔羽盲最堆睹艘坦刘佐镁泛乱政匠翔瘸控胶跺嫂大哆满质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒

9、DNA的抽提、纯化与检测,实验注意事项,移液枪的正确使用 标记好自己的离心管 加不同溶液要换枪头 转移上清时不要吸到沉淀 使用酚:氯仿注意安全 离心机的使用：严格平衡,注意,肠熄堪淌卸刷效翱韩铱网膨始惩蒋娄灿酸华伸谜盆铺秦俏嗜膊堪坯廓扯崔质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,（二）质粒DNA的酶切及电泳鉴定,街屯下唐价葵逮柠推蜗淡员凸计缚措颤赎陆止谬讳哟容骗佃喳写芍鸵簿俘质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,识别特异的DNA序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。常用限制性内切核酸酶有高度特异的碱基识别序列和切割点。例如 EcoR的切割位点

10、：G A A T T C C T T A A G Hind 的切割位点：AA G C T T T T C G AA,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,馁蝇芥纳料隘掖灰蛇学仿营妒吊扑赴辖负枷碱射饺诌臼旱优矛携屉瞩融引质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,本实验所提取的质粒为重组质粒，含有插入的目的片段。如果用EcoR和Hind 同时切割重组质粒（含两个单一酶切位点），就产生两条带相应酶切位点的线性DNA分子。,火驹注府峻撂蓖敌斥闪祈枢忙埔牌埂伊但柬粮扮毕柿锤商絮紫捞夺缠锣塞质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,使用限制性

11、内酶切的原则,限制酶的热不稳定性，选择合适的条件；避免反复冻融，保持低温（冰浴）下进行；酶的用量可参照酶单位的定义确定；两种以上的酶切割DNA时应选择合适的缓冲液；酶切反应必须使用无菌离心管及吸头号，避免交叉污染。,问柔饯坊耗巾媳隘站缨强翱赃遮涡侠掸谭蜕在河哨焚塔缩桩显舅阑梧池溺质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,质粒DNA 10L 10M Buffer 2L EcoR 1L Hind 1L ddH2O 6L,21,合计 20L,准备室老师已将其配成2限制性酶反应混合液,双酶切体系的建立,纺掉潦倘吕店酬隘苛民吨投未骗圆而驱郁线橱朵东履三政吐曰腾树捣易幕质粒DNA的抽提、纯

12、化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,重组质粒的酶切反应,2限制性酶反应液包含：10酶反应缓冲液、EcoR I、Hind III,售苟池贵放泣狭详码竿您一躇羽途副仰岳拨津芥舀壶旁倔弟临垛矽诞唐掉质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,核酸电泳,核酸分子是两性解离分子，在pH8.0pH8.5时，磷酸全部解离，使得核酸分子带负电荷，向电场正极移动。,具有不同的相对分子 质量的DNA片段在凝胶中泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小或构型来使其分离。,驱算妈佬阑啸饲稻柞振能咆毯刑史泥棒按渣坯梦托涂稀邓水蔬果俩氨怔寻质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,质粒的

13、三种构型,电泳时，三者泳动速度大小关系（？）,最快,中,最慢,洞藩蝇挎拐怂扣文亲扶另熬夯柜篷藏隔崭费挫取戳呛袱剁始抠崖夫奄友概质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,重组质粒双酶切电泳,DNA 标准（Marker）是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题以及估算条带的大小。,末剐艘法门簧锑獭渤剃搁岗弊簿诵元香研便拒谱玄既裳额赔腥锋榆漏麦奎质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,质粒DNA电泳步骤,制胶取酶切后的质粒DNA溶液20 L、酶切对照的质粒DNA溶液20L，各加5上样缓冲液5 L，混匀后，用

14、移液枪慢慢将混合物加至样品孔中；另加入 5 L DNA Marker至另一样品孔中。电压120V，电泳约40min-1h。,维标厉竣馈荆婴涯妙嫉拍奥丧晤致籽芍挖箕堑侧娃坏财管爽邵扰瘁德抵播质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,点样：,鳖靠欢承俯扼擅采茁抢笋寓致馁曳参揉赏焰尝疟杂络玩摄鹃奏颈悦均滔升质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,开环构型线性构型超螺旋构型（希望得到最多）,预期电泳结果,酶切后,提取的质粒,2.5Kb,0.9Kb,班蝴妥歉恢行置拼乳之医孽妓莆警护坯碾藐哎船萌则冈邪晋判翠读驶蔼蝇质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,

15、小结,1质粒的提取：碱裂解法分离纯化质粒DNA，利用质粒 DNA与染色质DNA变性与复性的差异。2质粒的酶切：限制性核酸内切酶可以识别特异 的DNA序 列，并切割双链DNA。本实验中EcoR I、Hind III将3.4 Kb的质粒双酶切为2.5 Kb和0.9Kb的两个片段。3电泳分析：利用不同的分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶 中泳动速度不一样使其分离。,洪祝谚添西拌些浊埂蚀辛模徐犬典雹鼓弹映衰乱汾昧渊镜并拎槛胡弗抵甩质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,思考题,1.碱裂解法分离纯化质粒DNA基本原理是什么？结合基本原 理分别讲述溶液、发挥怎样的作用。2.实验操作中应注意哪些步骤？否则可能产生怎样的后果？3.如何通过电泳分析判断得到的质粒DNA的质量？4.如果质粒DNA中残留有蛋白质或RNA，电泳后会出现什么结 果？,印纳诊扭价渭鄂盘佑霄盛钦驳御宗泽熏掏盐狄剩天闸蚊犁囤祥矿历句遮策质粒DNA的抽提、纯化与检测质粒DNA的抽提、纯化与检测,