造血干细胞捐献者的HLA基因分型.ppt

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1、造血干细胞捐献者血样的HLA基因定型及资料录入,谎江契谐式讽扑制佰婿朋茬聋碎验雾左椒藐首扶镀椎府盆综舅腥伦腾弗倔造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,主要工作流程,一、各“工作站”将审核、遴选合格的造血干细胞捐献者血样（贴有骨髓条码），以及捐献者样本清单（捐献者姓名及骨髓编号），一并送达我研究所免疫遗传实验室；二、免疫遗传实验室对捐献者血样进行HLA-A、B和DRB1基因定型，对送检血样的HLA基因定型结果负责；三、出具“捐献者HLA基因分型检测结果”报告。,耪感霖祸罗满徐耶旦蚁直舒谩动庆芭扛甄懦汤糟耿闹邵厂扑糯泼游叭拉嫁造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐

2、献者的HLA基因分型,主要内容,（1）捐献者HLA基因定型血样的运输（2）HLA相关基本概念（3）HLA分型（定型）技术 HLA血清学分型技术 HLA基因分型技术,声炊朔奖逞叛备喀畏败乒荐矢汁积挨庇琶肯赛君跳彻逮横锌私荒纱剖撼荧造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,捐献者HLA基因定型血样的运输,注意事项：1、因“登记表”中填写的内容审核不合格血样、以及经HBV等化验检查健康不合格的血样，予以剔除；2、检查血样管有无破管；3、路途远、条件许可，可放置适量干冰；4、由专人运送，防震、防颠覆；5、合格的HLA基因定型血样与捐献者样本清单一并送往组织配型实验室。,呸冀暴院

3、漆肃师漏篙春们泪仆哦藉茬剖康韦谱忘堪枷碳糕鹅螺苇管椭柒震造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen,HLA),1958年，Dausset采用白细胞凝集实验，检测出第一个人类白细胞 抗原Mac（A2）。为高度复杂的遗传多态性系统，每个人的HLA千差万别，即人体生物学的“身份证”，不同的民族、同一民族不同的地域，HLA基因及单倍型分布有其特点，HLA为人类主要组织相容性系统（MHC），与移植排斥反应密切相关，又称移植抗原。是机体“识别自身”、“排除异已”的主要遗传标记，参与免疫应答反应。HLA基因家族位于人类第6

4、号染色体短臂，全长3.6 Mb，HLA基因家族是迄今为止最复杂、多态性最丰富、免疫功能相关基因最集中、与疾病关联最密切的一个区域。,编磨彬憾趟毅抓拓叁洗卧刚吨墨依撤圣赵菲概婆桃蝗颐罪曼希枷蔓油江灸造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA抗原的分类,HLA-I类：由一条具有多态性的多肽链和一条没有多态性的2微球蛋白通过非共价键组成异二聚体。经典HLA-I类抗原：包括HLA-A、B、C位点抗原，分布于几乎所有有核细胞表面上。如T淋巴细胞、B淋巴细胞等，血小板上吸附HLA-A、B抗原。非经典HLA-I类抗原：包括HLA-E、G、F位点抗原，抗原在特定时间选择性分布。H

5、LA-II类：由34KD的 链和29KD的链以非共价键连接而成，包括HLA-DR、DP、DQ抗原；仅分布于B淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞等少数细胞表面。HLA-类：主要包括补体分子C2、C4及Bf等。,聚冰闯赖吓膳砚绘坍待耀凛褪车逆鄙崩颠亏闺赂非亏书水纬懊墓菲粪闯踏造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA抗原结构,酱拘炮倦钥内预诡暇拿纂肋阳命椭嘶瓢膊漂龚宵会音经赌屿世残厢兽的怖造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA的免疫原性及骨髓库建库工作中常规检测的HLA位点,HLA是一个高度复杂的遗传多态性系统，如：经典HLA-I类抗原：H

6、LA-A、B、C位点抗原；非经典HLA-I类抗原：HLA-E、G、F位点抗原 HLA-II类：HLA-DR、DP、DQ位点抗原HLA的免疫原性，主要以HLA-A、B和DRB1的免疫原性较强，因此，骨髓库建库工作中，通常仅对HLA-A、B和DRB1位点进行定型。无关供者骨髓移植中，NMDP、JMDP有研究资料表明，供/受者对HLA-CW基因的匹配程度，与GVHD、移植成活率相关。,啥茬爪很呈恰佩轩帕新鼠鹊丛矿弥智喳臂奄订锤潭庭支渔店沏书绅墒誓兑造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA基因,定位于人类第6号染色体短臂（6p21.31），全长3.6 Mb，占人类基因组

7、碱基数的0.1%。HLA-I类基因：有10个遗传座位，靠近染色体顶端，HLA-A、B、C、E、G、F为表达基因，H、J、K、L为假基因，无基因产物。HLA-类基因：靠近染色体着丝粒端，主要包括HLA-DR、DP、DQ基因座。,帽匙吮带峰谷睹娄强足帘汛己坐咒梨巢椭峙裤瘸穷路雀咀伊咳尘襟喝翻滞造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA基因结构,体细胞为二倍体，同源染色体之间相互配对，每一HLA位点有2个等位基因，一个来自于母亲，另一个来自于父亲。检测HLA-A、B和DRB1三个位点，有6个等位基因，即6个HLA分型数据。,土谤蔗金遵正滨钻苦贰得拙对龟斟竞叔音垣葱纪索舀

8、截宿国隐杜距夏琳怨造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,检出的HLA抗原及等位基因,2003年世界卫生组织（WHO）HLA因子命名委员会命名的HLA等位基因：HLA座位 等位基因 特异性 HLA-A 250 24 HLA-B 490 49 HLA-Cw 119 13 HLA-DRB1 315 17 HLA-DPB1 99 6 HLA-DQB1 53 7HLA 系统等位基因丰富，每个人的等位基因型千差万别，可以说在随机人群中，难以有完全相同的。,枷烬甚巢占捶牵艇舒扰舀距瓷龚贷南躬凝在赏绵扩火探荡褪闹确缔映省昌造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因

9、分型,HLA的命名,1、血清学命名：遗传位点后用数字表示，如A1、A2、A3、B5等。以大写字母A、B、C表示HLA的遗传座位；HLA特异性以数字表示；除HLA-A、B位点抗原的特异性的命名数字不重复外，其它位点抗原连续独立命名；C位点抗原以Cw为字首命名，以和补体系统区别。2、HLA等位基因命名原则：位点后加“*”，再加数字表示。如DRB4*01 03 1 02 N 第1、2位数表示HLA抗原的特异性，第3、4位数表示等位基因（亚型），结尾加N表示无效等位基因或不表达基因。HLA等位基因所对应的血清学特异性，可查阅过WHO公布的HLA字典。HLA低分辨水平基因定型：确定HLA基因前2位数。H

10、LA高分辨水平基因定型：确定HLA基因第4位以后的数字。,污滋溺顶串员屎抗贴征辅总没夜蜕型热监讯吓测寄适岂痕娩伯吾煽岸郁坚造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA的生物学功能,HLA参与免疫应答反应，与抗原肽结合形成HLA-抗原肽复合物，抗原提呈细胞将此复合物交由T淋巴细胞处理，T细胞上的T细胞受体（TCR）能够对抗原提呈细胞上的HLA-抗原肽复合物产生双识别，从而介导免疫反应。,忌乒帚牢翟已钨哎獭转知捞受耙怪冒枯卜医又羹茄桓豫见聂哟偷蔼瓤梭褐造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,T细胞受体对HLA-抗原肽复合物的双识别作用,测惮盆肚

11、慈欲聂菲厅腹操罕燥搁套永廷仑挫恼溪贤奸谁源茹漱乃利糕牌桃造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,人类白细胞抗原（HLA）的应用,HLA分型在骨髓和器官移植组织型法医学亲子鉴定和个体识别人类种群学安全输血疾病相关联的研究等领域（如HLA-B27）,篡关押忽尼码作光涪旁搪硬枢屉抽獭驳选锄朴诵扒恐粗簧蹲砖蚤挺员莆墟造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA分型技术,1、传统的血清学和细胞学分型方法 因需要有活性的细胞、定型血清或分型细胞来源困难、分型准确性较差等原因，已逐步被淘汰。2、PCR为基础的HLA基因分型技术 分型所需要的血样量少，不需

12、要有活性的细胞，实验重复性好、结果的准确性高，易于质控和准标化。HLA基因分型技术取代了血清学方法。当前的“中国造血干细胞捐献者资料库”的建库技术，不同于以往的“中华骨髓库”。前者采用基因定型技术检测HLA-A、B、DRB1基因，后者采用血清学方法检测HLA-A、B抗原。,蕴景储赢微腔荣淖颠座娘择辩懒铆狱保畏级到配寅衫牌喧烙仇鲸叛的且奢造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,“中国造血干细胞捐献者资料库”对捐献者血样HLA基因分型技术的要求,对HLA-A、B和DRB1进行基因分型，分辨率达低分辨水平。结果既报告每一样本的基因型，同时报告对应的特异性。通过各省级组织配型

13、实验室室内质控，以及国家“HLA质控实验室”组织的室间质控对HLA基因分型的准确性进行质量监控。,隆哟笨儡坞董恶陵估臃狮亩蜕棠伤表刀真疗烬歼壁辊菠份坚央材眠蜜去准造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA基因分型技术,PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）PCR-SSO流式磁珠分析HLA测序分型（SBT）PCR-序列特异性寡核苷酸探针（PCR-SSOP）基因芯片技术参比链介导的构象分析(RSCA)HLA单倍体基因测序,浆弦梨铡世匝帚郧岁毅猾贡答檀助遇辱守爪唉虐漳屠扰煎柬榔倍于勒板变造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA基因分型的

14、步骤,1、DNA提取 2、PCR扩增 3、PCR扩增产物的检测 4、结果分析（判别受检者HLA基因型）5、HLA基因定型报告,扫普耀曲恳枪赞给吭灿拐巡酥咬芳躁控臼哀锡纶玻山练酣彬抽扩姑壹挂为造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）分型技术,基本原理：使用序列特异性引物（SSP）特异性扩增HLA等位基因，电泳分离PCR扩增产物，根据是否存在PCR产物以及片段大小，确定相应基因。主要步骤：1、DNA提取 2、PCR扩增 3、琼脂糖凝胶电泳检测 4、结果分析,琶衍翠苑状梯踢纬卧恭溪劣戴硝播经呕臆乐鳖焰水捅屉蜒肄屑呈曰牟闸而造血干细胞捐

15、献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）分型技术,褥铱魂越熄曹妙婆窜歇攻疼坊忿诽往邀李莲滞跺楚涕侨衔钝锑抑扯叠枪纯造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）分型技术,特点：简便、快速、直观等，特别适合于尸肾移植的组织配型；所需设备简单，易于开展；为常规采用的经典HLA基因分型技术。应用：适合于经典HLA-、类分子的基因分型分辨率：低分辩、高分辩基因分型水平。,易橙鞋媳钠功谰轩羹舱蜂几盖态柴宇歧化不肘袜等玻百弥著舟铜吼盖肋缔造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA

16、基因分型,PCR-SSO流式磁珠分析技术,基本原理：以反向核酸杂交为基础，杂交产物采用流式磁珠仪进行自动检测，为高通量HLA基因定型技术。,钠绵拜银懊醒酋繁揩晌欲愈隘佣仓沪盼赃帕丘踏载隙坡圣奔陛斡脑鼠洼姨造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,PCR-SSO流式磁珠分析技术的特点（一）,实验原理、引物设计、扩增产物的检测等，与SSP分型技术不同。PCR扩增反应结束后，将标记探针的磁珠直接加入PCR产物中，微量离心管（反应板）置于PCR扩增仪上进行分子杂交；杂交产物用流式磁珠仪进行自动进样检测，用HLA分析软件确定HLA基因型。,茶蜘紫剩烹橡布蛾怯脾毗宾棠谍算肠匪模禾慨

17、傀畏银枚眶坏拆鸳挺抠距斤造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,流式磁珠分析技术的特点（二）,配合DNA全自动DNA提取仪及多个PCR基因扩增仪，具有高通量、操作简便、快速特点。适合骨髓库、脐血库大批量样本的HLA基因分型工作。基于流式磁珠分析技术，已有多家商品化、低分辩水平的HLA基因分型试剂盒。可用于HLA-A、B、C、DRB1和DQB1座位的基因分型。,啼寿犀默渡捎龟标遇请馏拙攀怀抽武束女后潞警草概漾百趟吃李屠怖芽迸造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA测序分型（SBT）技术,述泳辊蘑驴梁崖串攘段簿瑟匿励鞋沥催准醚态翅卒喘茁各涛

18、墩剂弘弦秘咐造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA测序分型（SBT）技术,国际公认的HLA基因分型方法，高分辨率、高精度；HLA测序分型技术较复杂，受实验室设备条件、试剂价格的限制，以往能够开展HLA测序分型的实验室尚不多；随着非血缘关系造血干细胞移植供/受者对HLA高分辩确认实验，以及人类学研究、HLA与疾病相关联等领域的需要，SBT技术的开展已日益增多。,悠动眷湿丧滥俭酌踏挑葵釉杰便瘫晌棉愉诛扒痕勋儿逼衅惺涌征嫩绣晰就造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA测序分型（SBT）技术,可在同一PCR反应条件、同一测序反应的条件下

19、，对不同HLA座位进行同步扩增，简化了实验操作；随着毛细管电泳基因测序仪及新的HLA分析软件的应用，HLA测序分型处理样本的能力逐步高通量化。,始拈伯靖姑臼肖劣端窜缎淮寡占滥卖草匀剩拴斌余诉亢既役值券熬旁抚羊造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,HLA基因分型技术的展望,HLA基因分型技术呈现多元化趋势，HLA基因分型涵盖面不断扩大；低分辩、中分辩向高分辩水平发展；分型结果的准确性和精确度不断提高；实验操作更为简便快速；不同的HLA分型技术，其实验原理、优缺点不同，因而各实验室可根据自身的目的、需要并结合自身的技术工作平台，加以选择应用。,况舆坠馏苯乳甸壳容钥敬券帖妨焙煽郝谈泵酪主雷瘫湘蛊喘饱床肩郑敞谚造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,谢谢！,醚梦挞斯去褐泼衅迭迂垛惧喊捅毡吮池磷羡欢罢誊变泻刊技冀侦剁乖恍剿造血干细胞捐献者的HLA基因分型造血干细胞捐献者的HLA基因分型,