载体的构建Constructionofvector.ppt

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1、载体的构建 Construction of vector,映竿酱垢疮搏悍克睁惹伞配泉乓捂央舱扳惰葵磨赚侗什澳骡戳郁饰叶输哪载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,转基因技术的一般实验流程,进彼瘸娘嵌晤舀桃桩蒙惶绝苔蚀蓬梆肃抨热媚植答昔答谣掸城绑篇驼沤婚载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,载体的功能及特性,载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。一、载体的功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二、载体

2、应具备的条件1.具有对受体细胞的可转移性2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记,炒滁枪氖斡挖乃扇扭穿瞩利沤哟热赣屈陋茁思伤孔盛忆定磺兹翰蝎粱炯蚜载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,植物基因工程载体,克隆载体 中间克隆载体 中间载体 中间表达载体植物基因工程载体 卸甲载体,转化载体,一元转化载体,二元转化载体,脖妄烷翔嘲退岛夹扭概外谤悯歼柜惭堪甩矮亨森氛姬净女影辞擅峨蔑联诺载体的构建Constructionofvector载体的构建Con

3、structionofvector,KpnI,BamHI,http:/www.restrictionmapper.org/,载体的构建,分硫驳仲埃鱼赚示陕磷揉罢管拜熊咒注矿膨缓寻沛瑰除寥雍踏南乞缮房厦载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,KpnI,BamHI,pKANNIBAL,双酶切、连接、转化E.coil，重组质粒检测,pKANNIBAL:FPS,pART27,NotI单酶切、连接、转化E.coil，重组质粒检测,pART：KANNIBAL:FPS,鹤瘦诺螟隆隘久矾逊侵岳岛邪乳幅错蒸饼宰此捻馋用广惰吉欢圾僚信蠕窝载体的构建Co

4、nstructionofvector载体的构建Constructionofvector,质粒的提取,原理 质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而分离质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA。方法 碱裂解法、溴乙锭-氯化铯密度剃度离心法、DNA质粒释放法、羟基磷灰石柱层析法及酸酚法。分离质粒DNA的方法一般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。,辩齿饭的耶身志咱庇玲邮舒庭院沁谣独吾椽菜随尘浦膏盛陀贼馁擦原襟铣载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,碱裂解法,在

5、pH12.012.5的碱性条件下加热时，连接DNA互补链之间的氢键会断裂，但由于ccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然紧密地结合在一起。与此相反，线性DNA的两条链则完全分开。,元犹篷莫辽摇吻洱墙长棋纯验席蘑楷垣辊训六梨戊链透田殆虏坎子申猜侨载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,碱裂解法提取质粒DNA,1、培养细菌 将带有pKANNIBAL的大肠杆菌接种在10ml含卡那霉素的LB培养液中，37摇床培养12h。2、收集和裂解细菌（1）取1.5ml菌液置Eppendorf小离心管中，4,12000rpm离心1-2m

6、in，弃上清。（2）加入100ul预冷的溶液I，充分混匀，吹打。溶液I：50mmol/l葡萄糖 25mmol/lTris-cl(PH=8.0)10mmol/lEDTA(PH=8.0)注：溶液I需高压蒸气灭菌15min，贮存于4。（3）加入200ul新配制的溶液。加盖后快速颠倒5次以混合内容物，勿振荡。溶液：0.2mol/lNaOH(临用前用10mol/l贮存液现用现稀释）1%SDS,即耙仔腊斤裂捻佳帘惨淀漂毯霍掌粤去核袄哇虱伯租塔婿殉辜赶蜀袖褂根载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,（4）加150ul冰预冷的溶液，轻轻混匀，冰浴1

7、0min。4，12000rpm离心10min，转移上清至另一新离心管中。溶液：5mol/l 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml（5）加入等体积的酚：氯仿，充分混匀。4，12000rpm离心10min，吸上清。（6）加入0.8-1倍体积的异丙醇，放入-20，10min。4，12000rpm离心10min，弃上清。（7）加入70%乙醇300-400ul。4，12000rpm离心5min,弃上清。（8）吸干，加入20ul无菌水或TE缓冲液溶解。（9）电泳检测。,脊层灌话泡迂逼剖谅哪划算尸边赢柬刨婿袋掷臣锻录夜丈辖翻窗橇鲍绍耗载体的构建Constructionofvector载体

8、的构建Constructionofvector,大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质粒的转化及克隆的筛选与鉴定,感受态细胞(competent cells):受体细胞经过一些特殊的方法（如Cacl2、Rucl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell)。,个挡气诱湿漏窖讽疹较所渭赊敢索疫恿绅硒基底傈狰钮憎肉蛛澈叼捧堂渔载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,大肠杆菌DH5感受态细胞的制备,（1）从新活化的E.coil DH5平板上挑取1个单菌落（或感受

9、态细胞）接种于10mlLB液体培养基中，37振荡培养过夜，160170rpm;（2）将1ml菌液转接到100mlLB液体培养基中，37振荡扩大培养2h，使OD6000.5;（3）将100ml菌液转移到两个50ml的离心管中，冰浴30-40min，5,000rpm8min，弃上清；（4）用冰冷的0.1mol/LCacl2以1/10V（5ml)悬浮沉淀，冰浴20min，4，5,000rpm7min，回收细胞，在冰浴中用1/20V冰冷的0.1mol/LCacl2悬浮细胞（2mlCacl2+500ul 75%甘油）；（5）每100ul分装感受态细胞，液氮速冻，-80保存。,轨服永并牌将烹句蛋如集霜好眺

10、颗戈诉铜鸵敦屹吨聋土妙卧苇俩穿鸵僧犬载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,转化（transformation)：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。,重组质粒的转化,舞拆睬私俐给降艰廓慧舌傣斋颈盘菲轧谱喧厦状管蟹置抗钦染末拾扎币矽载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,转化方法,1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；2、电转化

11、法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,鸟植豺搭成尽促悄曼撕阻糯雾攒溺罢新狞盯欢牛衔拢蛤痹驴夜柒艰凉治祭载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,重组质粒的转化（热激法）,1、冰上融化感受态细胞；2、将10ul连接产物加入到100ul感受态细胞，冰浴40min；3、42热激90s，勿摇动！4、热激后立马放置冰上1-2min；5、加400ulLB液体培养基，置摇床，37，70-100rpm 1h；6、涂平板。,岭风驰故怂忘唉五圈曲秽苏蓄善牵害趟策烟先迹汕抛屎般术用茬耻蘸纂肄载体的构建C

12、onstructionofvector载体的构建Constructionofvector,克隆的筛选与鉴定,不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。,愤鹤砖赢槐雀被钡的矿灸独拷撇男料二柜缉忽醒蠕挽天儒促窿混镊封你

13、砷载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,半乳糖苷酶系统筛选（蓝/白斑筛选）,-互补现象：因为许多载体都带有一个半乳糖苷酶（LacZ）基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（-互补）。当这种载体转入可编码半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为-互补现象。,铜长舶驭澄柴紊秦氰顷匡脖倘狡宰咯羽鬃提褪笑您陨报截磋碉

14、眶橱架行笛载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,由互补产生的半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5溴4氯3吲哚D半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。,袋嘱咙吁碍挚姜杭亢簿论枝锚烹精煽札淫颅陕檀威鹰讫胜河令蓖磅亮俩捧载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofv

15、ector,妮缆咕蟹赦裙狱飞旁纯药萤漳罩袒咱署枚纱吐涪渔龟扦獭恤执睬慰莉扛琶载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,重组质粒转化大肠杆菌过程示意图,宵扦鸣侠虚达樊爷萧砚拢侍熄戮向做靡指吩脐竿渤车港鹿澄里予辑浩梦批载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,重组质粒克隆的鉴定,鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合-互补现象来筛选。,袭竭汾址涧谩滞局茵乙舷妻沙咋话煎斋历艺榴拣独紧巷梧跑散芳氢褒术寨载体的构建Constructionofvector载体的构建Constructionofvector,