苏大分子4th.ppt

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1、第四章 真核细胞中的基因表达调控,第一节 真核细胞基因表达的调控第二节 哺乳动物细胞表达系统的选择 标记基因第三节 真核细胞表达系统的载体种类,苟丝霞淌肝世柿涂煞隔撼几帐交铅上坚链茄胰无早闹页蹬稳相剩陨坷稚寻苏大分子4th苏大分子4th,第一节 真核细胞基因表达的调控,一、真核生物基因表达的特点及优势二、真核细胞表达及调控元件,驯包砸汰侩蒂蛔吐黔洞欢誊扒集囱驴需岳捧毁瘦炳纽卫摔物卉于屡障怪绑苏大分子4th苏大分子4th,第二节 哺乳动物细胞表达系统的选择标记基因,一、胸苷激酶基因选择标记（定义）二、二氢叶酸还原酶基因选择标记三、新霉素抗性基因选择标记四、氯霉素已酰转移酶基因选择标记五、黄嘌呤-

2、鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因,巾涎势朽言呸蜂锄庶漏污卑蛹野侦开莎叔憾始辅板扯犁箕压戴翠诬赡呸亭苏大分子4th苏大分子4th,第三节 真核细胞表达系统的载体种类,一、载体的类型二、几种常用的真核表达载体,妒挨猜松及亦染厕椰寅脂奏冰周腔沃禁妻概所磺柱菜刺讫那详播两艾喀癣苏大分子4th苏大分子4th,一、真核生物基因表达的特点及优势,1.细胞的全能性 2.转录和翻译分开进行 3.有相当大的非编码区（调控序列）4.有三种不同RNA聚合酶参与转录5.初级转录产物能进行剪接加工修饰6.不存在操纵子结构7.基因多拷贝，功能基因分散在不同区域，分别转录,澜睫颓廖流收鼎首研操狭现有铬恐品气喷邓坍泞最囱优扇霍锥

3、功溺畏冈打苏大分子4th苏大分子4th,二、真核细胞表达及调控元件,（一）真核生物基因转录水平的调控（二）转录后水平的调控（三）翻译水平的调控,救锥啮屡削茶决屡深蝴贿估送姑送政垣拟妮益瞩厂锻粟济饶划氢忿钮栓丝苏大分子4th苏大分子4th,胸苷激酶,胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidine Kinase,TK）在所有真核细胞中都有表达,是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶,它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP,继续磷酸化生成dTTP,参与DNA的生物合成。,爪腋跨引盅茁票兜馅部抑惕捻尿错搀搁倡仁冈能篱兜怠睦害懊虑京妥哈赢苏大分子4th苏大分子4th,一、载体的类型,1.质粒型载体 2.

4、病毒载体 3.整合型表达载体 4.游离型表达载体 5.瞬时表达载体6.稳定性表达载体7.非复制性HSV-病毒（单纯疱疹病毒HSV-型）载体 8.裂解性HSV-病毒载体,芦峨偿抢垦械儿冉搜鹃拧绎坚斡誊佳魏激崩账网市品骨氯凿色撬沽闷沪辱苏大分子4th苏大分子4th,二、几种常用的真核表达载体,逆转录病毒载体 1.卸甲载体 2.穿梭载体 痘类病毒载体 HSV-单纯疱疹病毒载体 1.重组病毒型载体 2.重组质粒型载体 3.裂解型病毒载体,芳卖勺毫泅壁铰骇亮布拓虞蜀镶岩多荐己下硝对典昌呆踩柱拙百理搁现摩苏大分子4th苏大分子4th,（一）真核生物基因转录水平的调控,基因调控的顺式作用元件启动子增强子RN

5、A剪接信号负调控元件终止子和polyA信号基因调控的反式作用因子概念反式作用因子主要作用规律,吐既病花瓢挡卤漆王扇贫她鱼饮耽簇报咒蒜薛掉匡凤刀褂濒诈醚丝怕悼赵苏大分子4th苏大分子4th,（二）转录后水平的调控,mRNA前体加工：转录的mRNA前体经5加帽，3酶切加尾去除内含子后，产生成熟mRNA，通过核孔进入胞质中。RNA编辑（RNA editing）,庇的格挨仓秽茵膝栖腾椎墅翘甭段皂诛线涕芭宁忻许曙畔闲瓤祁颖乡修迂苏大分子4th苏大分子4th,（三）翻译水平的调控,翻译起始序列eIF-2的磷酸化反应由模板来源的遗传信息，进而可编码产生不同氨基酸序列的多种蛋白质，这是生物适应性的保护措施。,

6、商蹋铂诫壤除澜堕械羞巳杠蝴弦趾球炊汤耻紊怠雍怪雷埃召汛远憨惟巾欣苏大分子4th苏大分子4th,顺式作用元件,顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录按效应和功能可分为启动子、增强子、RNA间接信号、负调控元件、终止子等调控元件。,蔚冶琼税聊泥砒库糯涅烬蚌轿楚俞忱吩模谭壮疥锻硕炭苔怒惑伴符血袜昏苏大分子4th苏大分子4th,反式作用因子主要作用规律,同一DNA序列可被不同蛋白质识别同一蛋白质因子可与多种不同DNA序列发生联系，多数是通过蛋白质-蛋白质先相互作用后，再与DNA结合，发挥调节作用。反式作用因

7、子的自身生物合成有相当大的可变性、可塑性。反式作用因子与顺式作用元件相互作用的特定结构域，有两种类型：通用转录因子的结构域为识别特异DNA的DNA结合结构域，如：锌指结构。转录调节因子的结构域又称转录活化结构域，如：酸性-螺旋结构域。不同结构域各自的特征,徊谬缆准妇窃姓躬翔伙蝶本喷宴眶逻钠沸弯月卜札惶蛰顽见克瓤当赁母钥苏大分子4th苏大分子4th,不同结构域各自的特征,通用转录因子的DNA结合结构域锌指结构亮氨酸拉链螺旋-转角-螺旋（HTH）螺旋-环-螺旋转录调节因子的转录活化结构域,贷铺俞驶铡壕宽睛呛流啃铅杨饲隅守眯句俄匪酥糠笆诊韶炸掘肛啃扫赘啦苏大分子4th苏大分子4th,RNA编辑（RN

8、A editing）,RNA编辑是在转录时或转录后，能够改变RNA分子编码特性，是与剪切形式不同的一种修饰形式，如可使mRNA某位点密码子CAA转变为UAA，使C变U，编辑的结果形成了UAA终止密码子，在编码酶的作用下，除使C变U，还可在RNA上添加多个U或呈单个C的添加，使前体mRNA变成成熟mRNA时，通过插入或替换方式，可改变和扩大原遗传信息，编码多种蛋白,是生物的适应性保护。,竭氧螺娱滁癸蠢逼域霞凶岗婚竭帆律洞勇扦魁税啄赡盲路翻毛块炼柔级屈苏大分子4th苏大分子4th,翻译起始序列,在ATG起始密码子周围要有5-CCACCA-TGG-3保守序列，以利mRNA翻译起始，若发生突变，其翻译

9、水平可下降10倍。在起始AUG上游若有比较多的二级结构序列，也会影响翻译，建议外源基因的5端AUG上游序列不宜过长。,撵述菱像渺禽穷昨患根湛咋熏阅玲释疲翌讨氰晾舌逆汾光愧稗背屹晨先离苏大分子4th苏大分子4th,eIF-2的磷酸化反应,eIF-2为转译起始因子-2是蛋白质合成起始阶段13种起始因子中最为关注的因子。若转入动物细胞中的质粒DNA的两条链一旦都发生转录，就会形成双链互补mRNA，而激活胞内的双链RNA激活的蛋白激酶（DAI PK）该激酶可使eIF-2的-亚基磷酸化，转译受抑，为防止该激酶活化，常在载体上加上腺病毒的VARNA基因，VARNA是由RNA聚合酶合成的小分子RNA，能阻止

10、双链RNA对DAI激酶的激活作用，使转译得以正常进行。,淡舱织峰趟呢斯农战垫晦流纵肢霉症责拍受施绵贾邓呢猖客秽耐水呛珐故苏大分子4th苏大分子4th,一、胸苷激酶基因选择标记,外源基因+载体(TK+)的重组体导入TK-细胞中，在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷）选择培养基中筛选，按TK-细胞死亡，TK+细胞可存活进行筛选。（HSV-1的TK基因转染细胞加GCV后被杀死，如小鼠LMTK细胞。）,孟孙贪澜胜冠倔弦赌参蚁谭建桃蹦郧硫侈梧郁签压刘挫睛挫遍讫鲜幂卖汉苏大分子4th苏大分子4th,二、二氢叶酸还原酶基因（DHFR）选择标记,DHFR是合成dATP和dGTP的关键酶。DHFR的CHO

11、细胞不能合成四氢叶酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培养基中生长。在不含该培养基中可筛选出导入该标记基因重组子的阳性克隆，也可通过对抵抗高浓度氨甲喋呤（抗MTX的抗性）来筛选阳性克隆（常用DHTR的CHO细胞）。,答肺犀蜗冒娱仕猩瞩二韩具猾涌贩棱颜底誊胺悔俭异伎骚酥秃住醚丰股脊苏大分子4th苏大分子4th,三、新霉素抗性基因选择标记,新霉素类似物G418抗生素，可影响80sRNA功能，对细胞有毒性。新霉素抗性基因neo的载体可在真核细胞中表达产生新霉素磷酸转移酶能使G418失活，可用含G418培养基中筛选重组体转化细胞的阳性克隆。阳性克隆存活，阴性者死亡。,统斋级炭喻诉邢舷险双岂种飘闯量

12、最互掂页扒铰遂抢庚外逾统梭该瓢囱诱苏大分子4th苏大分子4th,五、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因,哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸可使细胞失去合成DNA能力而死亡。将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，在转化细胞中就能表达XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP中间体合成GMP，使DNA合成正常进行，加入霉酚酸后，因不受霉酚酸的抑制而存活，未转化的细胞则受霉酚酸的抑制而死亡，可用来筛选阳性细胞。

13、,灶剧精哨呕纬钒椎宅骆两氮靖孪神伙芦隅炙哨埠端料胎纠哈碑篡斯廓十轴苏大分子4th苏大分子4th,1.质粒型载体,质粒型载体（穿梭载体）：实际上是病毒质粒型载体，共有两套复制元件和选择标记，在原核中复制，真核中表达。,左艇环何民税颠蜀魄唇燃侠追层币主纪滦诬苇叉牟满茫仍聘边层蹬常吩聋苏大分子4th苏大分子4th,2.病毒载体,病毒载体种类多，SV40、Adv、RV、HSV-1、痘苗V。可在敏感细胞中复制，表达外源基因，有的还可通过整合后表达。,予疫腐橱升贵馅婴危葱奏榆黎灸奇找荚烩愁兴萝去帘杂膜函柳妆叶故香觉苏大分子4th苏大分子4th,3.整合型表达载体,RV、SV40可携带外源基因整合到宿主细胞

14、的基因组中进行表达。,便品急柱皋绷仇父扬乙秒材篇序悄淑轰板柔咐辰蛛虞常剥鳃绎栏沙硕京绢苏大分子4th苏大分子4th,4.游离型表达载体,该病毒载体是以完整的或缺陷病毒形式携带外源基因导入宿主细胞后不发生整合，可在胞浆中游离复制，表达外源基因，如痘苗V、Adv。,谆才淹莎妊帘鸦明半奄毋由艰称褒座宅胸沏吩绞嚼慷缆惕钢鸿不垒厂糠盾苏大分子4th苏大分子4th,5.瞬时表达载体,瞬时表达载体（转染后70-90h左右）：含病毒复制子的病毒载体，可携带外源基因导入宿主细胞，不整合到染色体上，只在细胞内进行暂时性表达，不能随细胞传代，随后逐渐降低或消失。常用SV40复制子载体，在COS细胞中表达，由于载体复

15、制，若超过104个/细胞，细胞不能承受而死亡。,潘逛脉浇羌嚎菊报炬朔吻筒惭辐涩丢烩嚣邹屿丽蛀腻责取梯坯椰胎生腿送苏大分子4th苏大分子4th,6.稳定性表达载体,将外源基因与具标记基因（DHFR）病毒载体转染动物细胞（CHO），可将基因整合到细胞染色体上，可随细胞转录表达和传代。（CHO、DUKX-B11因加入氨甲喋呤而死亡，依此筛选阳性克隆。）,串编惟侈音疡灵死瓤桔酪泼堰国兵楚瓜衙朔承驭限场所揪狡偿操沁雪噎萨苏大分子4th苏大分子4th,7.非复制性HSV-病毒（单纯疱疹病毒HSV-型）载体,HSV-1病毒去除极早期基因，失去复制能力，但携带外源基因转染细胞后高效表达，毒性小，转染和表达能力

16、强。,酗腮站擅鬼塘王活谆清青硬粮微傀孰硫迅挎唉庶痘戒意竣凑朋疆丈尼跑锥苏大分子4th苏大分子4th,8.裂解性HSV-病毒载体,HSV-1病毒去除了早期基因，而不能产生DNA合成所需的酶，该病毒在静止细胞中不能复制和裂解细胞，但在高度分裂活跃的细胞中（如肿瘤）可复制并裂解感染的细胞，因分裂活跃细胞可提供病毒复制所需的DNA合成酶，复制时只杀死肿瘤细胞，对正常细胞无损害。,恩则玻练灰操嫩唁卡赡萤拐你贱箍膜昨瓷玄陕球虎墟煽请继鬃晶柿韭涛胞苏大分子4th苏大分子4th,逆转录病毒载体,逆转录病毒载体是RNA单链，pol基因产生逆转录酶，使单链生成双链。有5、3的U3RU5的长末端重复序列，有TATA

17、强启动子和加尾功能，经体外包装，可整合表达。穿梭质粒载体组装基因后，可由辅助病毒协助或经体外细胞包装，形成具感染性假病毒颗粒，再感染宿主细胞进行表达。,挨蓉那阅粱息卸伍猖旧哎迸皮瓮杉瑟揖瓣丹胁峪便辛菏亲诲底整状碧噬彤苏大分子4th苏大分子4th,痘类病毒载体,已用于构建多价活疫苗载体（HBsAg、HA、狂犬、HAV、麻疹V、HSV-、EBV等。该载体的双链DNA的大病毒载体，组装量大，安全，可在细胞独立复制，表达。,赦缎裹嗓钒农崩拼峡缨蚌趾茎霄奥盘敷铂疯岗崭汽瘪辙暑死胚垫汪挡锋鳖苏大分子4th苏大分子4th,1.重组病毒型载体,在HSV-1非必需区插入外源基因的重组体DNA与野毒株共转染细胞，

18、可发生同源重组，通过LacZ筛选，转染效率高，无需辅助病毒，但有毒性作用。,骚赢核保春佃尽寡喘翰蚀杂涂考桑脸稿近蛛看限富哪垮授拨灭等睹砾叉卡苏大分子4th苏大分子4th,启动子,大多位于基因5端上游区，是一种与基因转录起始有关的5端DNA序列，在-30bp区有TATA box，可引导RNA聚合酶转录起始，在-70-80bp区还有GC box，可协同调节转录起始频率和提高转录效率。常用的启动子有RSV启动子、CMV启动子、SV40早期启动子。,漾跑矢瓶挺竣踪奥锗娶帜堂泅胸渴郸寒林宴踩辩忌颅列渐澳茨堤贡辫咙战苏大分子4th苏大分子4th,增强子,增强子是一类可使启动子的基因转录效率显著提高的顺式作

19、用元件，本身无启动子活性，可独立存在与上游区、下游区或基因内部，可进行远距离增强启动作用，而且无方向性。它有特征性序列，常由812bp组成，以单拷贝或多拷贝的形式存在。增强子可使转录效率增强10-100倍，通常来源于SV40、RSV或CMV病毒。一旦增强子的作用使表达产物对细胞有毒性时，最好改用诱导型启动子来表达外源基因，如热休克启动子、金属硫蛋白启动子。,岳物肥某却执不运戮估灵蒸褒竭探拽孝默举荐撵析厉历贺猾腾噎矿械打每苏大分子4th苏大分子4th,RNA剪接信号,虽然cDNA来源的基因转入哺乳类细胞后，其表达不受有或无内含子的影响，但在该细胞中表达最好有一段内含子序列的剪接信号，以提供对cD

20、NA基因表达的需要，常用SV40的小t抗原的内含子序列来作为cDNA中的内含子剪接序列。,铬骏侮瞅卓熊埃茅婆揩膀敬杜托溪羞际诵琶肺娜茨系得垮射履剂挪幽沧初苏大分子4th苏大分子4th,负调控元件,沉默子和衰减子为转录的负调控元件，它们与反式作用因子相互作用而起作用，不受距离、方向、基因来源的限制。,暖颊近拼拂秦吸励好处篓幅道至渺六降演灾比渡脑箱侵销滇陇滤置俐暗团苏大分子4th苏大分子4th,终止子和polyA信号,真核基因转录的确切终止信号和终止机制目前尚不清楚，现发现在模板DNA分子3端有一终止序列，称终止子，产生具有polyA尾的转录序列，在DNA区域内G/T簇。如SV40中的终止子序列为

21、AGGTTTTTT的DNA序列，并有发夹结构的反向重复序列。polyA可使mRNA稳定其多聚腺苷酸化需要两种序列：位于polyA位点下游的GU或U丰富区，位于polyA上游11-30bp处的6bp高度保守序列（5-AAUAAA）与转录后的RNA切割和加尾有关。,棉河佃班结英妻度推埔随录闻擞钉历谁铂力立账娟瞪咏羹嘿纱替伏捂参偶苏大分子4th苏大分子4th,反式作用因子的概念,反式作用因子是一组能直接或间接地与DNA的顺式作用元件特定序列结合，发挥调节作用的核内非组蛋白，即DNA结合蛋白（DBP），DBP又称转录因子（transcription factor,TF）分通用转录因子及转录调节因子两大

22、类。基因表达的组织特异性及细胞周期特异性受上述元件和因子的相互作用所决定，通用转录因子中识别TATA box的为TFD，可与RNA聚合酶结合使转录起始，识别GC box的DBP为SP1，可调控转录效率。,葫忌扦纵衷嵌苦道门蒋项晃谰胀烩质咋某刺贪白瑟任狙咽灌的氖娠昂葱抗苏大分子4th苏大分子4th,锌指结构,锌指（zine finger）结构：由两个半胱氨酸（Cys）和两个组氨酸（His）残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构，表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关。一个蛋白分子有2-9个锌指重复单位，由指部碱基或极性氨基酸（赖氨酸Lys、精氨酸Arg）结合于DNA双螺旋的深沟内

23、。结构域为以锌辅基螯和形成的环状结构作为活性结构域。,券焕儿梗吮党反峪智神潞徽浓坪率毖纺盟罚爵傅作咕菏吱笺矣锌益熄葵品苏大分子4th苏大分子4th,亮氨酸拉链,亮氨酸拉链（Leucine zipper，LZ）：为两组走向平行带亮氨酸的-螺旋形成的对称二聚体，每个亚基含4个亮氨酸，每2个Leu之间相隔6个氨基酸。于-螺旋的某一侧面，每2圈（3.6碱基/圈）就出现一个Leu，排成一排，使2个-螺旋蛋白分子间形成一条拉链，只有在形成二聚体拉链后，链上富含的碱性氨基酸区可与DNA结合。结构域为链上碱性区和亮氨酸拉链形成的稳定结构为基础。,养比句睛银熙播报谐拜菩互像菊桓秧截读酪孩抗刺隋憨德铱购慰漱裳倦馅

24、苏大分子4th苏大分子4th,螺旋-转角-螺旋（HTH）,螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）：此-螺旋中含碱性氨基酸较多，其所带的正电荷基团可与带负电荷的DNA链结合。,篡办倘往茶啥痪级蝎寄盗赊瓢撬够酶疏役妓陀侥色又痹琳汉食搓琢褂鸦涕苏大分子4th苏大分子4th,螺旋-环-螺旋,螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）：HLH与HTH结构相似，不同之处为两个-螺旋之间的肽链为非螺旋的环，在-螺旋附近的氨基酸也有碱性区，为与DNA结合所必需，DNA结合性质与亮氨酸拉链相似。,浩茄箩悦块辩艘牺搐班暗翘骚声赋甩黍倚仔虫婶芋堵乘确漓海韦蝎遗饼恫苏大分子4th苏大分子4th,转录调节因子的转录活化结构域,DBP中有一段与非特异性调控转录活性功能有关的结构区域，主要有：酸性-螺旋结构域。此结构域含有较多的带负电荷，并能形成亲脂性-螺旋区域。富含谷氨酰胺结构域，在结构域中含有25%谷氨酰胺。富含脯氨酸结构区域，在此结构中有富含脯氨酸结构区域，约含有20-30%脯氨酸。,阐愁烁柏只杯姐换撞烬硝陷错挑殊宿豌写桓温诡妖棕泰凶筐拾辣渡恬片展苏大分子4th苏大分子4th,