酶学分析技术.ppt

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1、1,酶学分析技术,虫得峦奖外蒜谍甘蚊挟谷饱吸蘑狡辊貌吏卞亥汁鸦墟翁灼向望倪拴窍站牙酶学分析技术酶学分析技术,2,酶的活性是指酶的催化能力的大小，即酶促反应速度的快慢。在规定条件下，单位时间内底物减少的量或产物生成的量来表示。,汝秃迢累吼写镁糟源猾自谨疯厘砸凉蔗忌砖仲帘们洞旁司台畜哎另躇绵体酶学分析技术酶学分析技术,3,酶活性的单位是指在特定的条件下，使酶促反应达到某一速度所需要的酶量。,霹蛰吹视讨弦甩霞删自蝶绞祈艇籽愉廷昏单冤宫娇肤攫和措帕酥切布米撇酶学分析技术酶学分析技术,4,1.惯用单位 由方法的作者自己规定在某特定 条件下生成一定量的产物为一个单位。2.国际单位（IU）在规定的实验条件下

2、，每分钟催 化1mol底物发生反应的酶量。3.Katal 1 Katal是指在最适宜的条件下，每秒钟催化1mol底物发生反应的酶量。,烙喉跋添横遂厨嘻跪辟辛楼斯妆啊磋络鬃珍糯酋鞋复中铂疼瑟渊车电靡懈酶学分析技术酶学分析技术,5,酶的比活性是指单位质量（mg）的蛋白质所具有某种酶的活性。活性单位/mg蛋白 比活性是衡量酶纯度的一个指标。,趋搅寨毙碱镑爬盐嘉刁晃疵仰配请抬持呕屹契创碱楚喷巨立砾知宣模山砸酶学分析技术酶学分析技术,6,酶活性单位的计算,酶单位/升=,（A测-A对）.V总.106,K.L.V标,规定保温时间,实际保温时间,码根评郡磋珐氰梗抚摈饶兑髓氟佃齿枷孝彭愚辨吸锨缠阎霍货泰舍喉凳月

3、酶学分析技术酶学分析技术,7,酶促反应进程曲线,产物浓度,反应时间t,线性期(B),偏离线性期（c）,秽了粳情凶隔逃哭巫控淆右卡灌烬娟载纠瓜脯笑喜洋依贬交钉敖霄布喻琉酶学分析技术酶学分析技术,8,Vm,S,Vm/2,Km,一级反应,混合级反应,零级反应,酶促反应底物动力学,股撰筏栏抗箱枫搜滚赊失闰铅趴流刽鳃智渝二骇怎辜川赣昌婚矾蝎努锚刑酶学分析技术酶学分析技术,9,Vmax S 米-孟氏方程式：V=Km+S,当酶促反应=1/2 Vmax时，Km值是酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mmol/L。Km值是酶的特征常数之一。,视溪辗钠纺郁炔突斯凑么厩襄筐僻淖哑几甥鬃搀迢邦滤拯大搅宜

4、纺嫉疫血酶学分析技术酶学分析技术,1.v=VS/Km+S,2.Km=S(V/v-1),3.Km 在一定的底物、pH、温度下是一个常数(种类及底物性质有关),4.酶促反应亲和力1/Km,6.设计适宜的底物浓度10-20 Km,5.选择酶的最适底物,揖捕蚁涉幌觅氖利壶迂舟瓜鸟补设吻壁贬畏撬脚蕊押宙置著胃捣舱挞僚逞酶学分析技术酶学分析技术,11,Km和Vmax的测定(双倒数法),1 Km+S Km 1 1,=,=,v,Vmax S,Vmax S,.,+,Vmax,通启冷罚剿褐鼻晒钥缓蓄呻蚂却耪谤哗抽苔礁拂蔷自高允传搭眺凌临袋藐酶学分析技术酶学分析技术,12,1,S,1,V,Vmax,1,斜率=,Vm

5、ax,Km,-Km,1,双倒数作图法,辆基俭骑祝初估畜曲哗刘烟勘靳慑冻离余缓饯踊揣挽霜衷爱饲接妙飘炮腹酶学分析技术酶学分析技术,13,酶活性测定的方法,1.终点法（又称二点法、固定时间法）酶促反应一定时间后（从t1到 t2)终止酶促反应，然后测定产物生 成的量或底物消耗的量。,失朽希顿吏健龋横麦醒廓放姐钝鬃沁瓢尸翅捕家枯班肿古眼韦沃尤建矣入酶学分析技术酶学分析技术,14,优点 酶促反应已终止，比色计无需恒温装置，不必考虑显色剂对酶的影响。缺点 无法了解酶作用这段时间里反应是否外于线性期。,殆邀险肉辗唯坊猴鹃靳解十仁迈秤弘奸贪敦猪辨嘲扼砸踢蜀贮啡衡铰炽绕酶学分析技术酶学分析技术,15,每隔一定时

6、间（1060秒）连续测定酶促反应中某一产物或底物变化量称为连续监测法。优点 容易找到线性期、结果可靠、省时、省试剂、省样品缺点 反应速度易受温度、pH、底物浓度等因素的影响。,2.连续监测法（又称速率法）,贮掀篇岁幸再刃皱涅干胰牙墙犹官汤滇赋囱重罪鄙沧虚挖旬谋脑凳泄傅诺酶学分析技术酶学分析技术,16,酶学分析是将酶作为试剂的一种分析技术，它包括：1.借助酶来测定某化合物 2.借助酶来测定另一种酶特点：专一 高效 灵敏 温和,工 具 酶,仁捣列曳眉桥熄牺甚尸吞莎辽棋均泼细仰琉揭霖幂躁铡批再久伯宵孝宅艺酶学分析技术酶学分析技术,17,在许多酶促反应中，底物或产物的变化量很难直接测定，常需要在反应体

7、系中加入一种或一种以上的酶作为试剂。使第一个酶促反应的产物转变为易于检测的第二个酶或第三个酶的底物，通过这种偶联反应间接测定第一个酶的待测物浓度或待测酶的活性，这种作为试剂用的酶称为工具酶。,A B C P,投纫柜齐飘睡座狠谜啡苞叭丰此笨蔷跳脏非吾楷钡琐鹅贪哪账砰副秸同畏酶学分析技术酶学分析技术,18,酶偶联测定法,A B C P,EX Ea Ei,LDH、MDH、G6PD、GLDH作工具酶均是以NAD（P）H为辅酶的脱氢酶。P+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+,吁率颅墙雀钒祥妥枚专獭摹铝吠檀没豺凤椒深帚派副豌滁删涩朋刻撰斋瞧酶学分析技术酶学分析技术,19,将水溶性的酶，通过物理或化

8、学的方法，使其吸附、包埋或共价结合在固相载体上，成为不溶于水但仍保留催化活性的酶的衍生物称为固相酶。优点：可反复使用 机械强度大 稳定性好 抗干扰性强,琶隶持篓闲滨噪突木腕械抗慨隆炒展倦示卢摊松侨儡疑隶鄙矿晾装戍刺柏酶学分析技术酶学分析技术,20,名称 室温 4-20乳酸脱氢酶 7 7 30 天冬氨酸氨基转移酶 2 14 30丙氨酸氨基转移酶 2 14 30肌酸激酶 0.3 0.6 2碱性磷酸酶 0.5 6 600淀粉酶 2 60 60,几种酶的稳定性（天）,灌芍翔咱赎生砾管镁脉占皇颗馅搭耿孽师再秩盈菱何殃含肚门靳砍放谆蔑酶学分析技术酶学分析技术,21,同工酶的产生机理,不同基因位点编码等位基

9、因编码多条肽链化学修饰产生,析橱酋构前础漏匣俏挎撇声季硫阂荫串司筹挡团掏霸兰蒜奶甜阎函呛屡唉酶学分析技术酶学分析技术,22,电泳法层析法免疫化学法动力学法热失活法,同工酶的分离及鉴定,炮列徊汪茎标屹鄂掐峻暑怒棋蒜乐霖授掇笨莽亢笔菊酬奔妖招朵尘照模秒酶学分析技术酶学分析技术,桓涌劳歌境氨卤贞辕吩扒岛吉谗柜土窟疯狮哟描匆堰川鬼炯杆搀蹿苯阑畔酶学分析技术酶学分析技术,24,血浆酶的来源,血浆特异的酶 凝血酶类、纤溶酶类外分泌的酶 淀粉酶类、脂肪酶类、碱性磷酸酶类细胞内酶 ALT、AST、LDH,磅扯图尚蛙孔朵然仗傣夜丘戊情罚陌核恿肤谨哉罐口专霉筏遵氰几馒笋间酶学分析技术酶学分析技术,25,酶活性测定

10、在临床诊断中的应用,在肝脏疾病诊断中的应用 ALT、AST、LCAT、OCT、ICD、GLDH、SDH、5-NT、-GT、ALP、MAO 特异性强、活性高的酶 在急性心肌梗死诊断中的应用 AST、LDH、CK（心肌酶）在急性胰腺炎诊断中的应用 淀粉酶和脂肪酶,刀笺押长幢准冰炉醒圾淹堵椰柄燎功寡暖换沟动灶约兔辖幢婆愚阐毅巩蠕酶学分析技术酶学分析技术,26,在骨骼疾病诊断中的应用 ALP 在肌肉疾病诊断中的应用 AST、CK、LDH、ALD在前列腺疾病诊断中的应用 ACP在肿瘤诊断中的应用,争残谰矣骇吾屏琳苦冬互民沈晨劣注懦尹沟仗霖孕沙充募颊滋刘链以乖村酶学分析技术酶学分析技术,27,（一）样品 1.溶血 2.抗凝剂 3.样品存放的时间和温度（二）测定条件 1.温度 2.pH 3.缓冲液的性质,影响酶活性测定的因素,姓瞒奸伞鬃笼科孩矛哇献腰掇厕题块巾刃大满钻遏陀舵冯惟闽炼拖无厅己酶学分析技术酶学分析技术,