酶工程3酶的分离纯化.ppt

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1、第三章 酶的分离纯化,败硝狈茧吟缴椭懒蹦摩复蹬翼婶梗躺帚裸况怨剩这塘琅今豆生宽钠捕热祁酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,酶分离纯化的目的,酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需的纯度。,釉柞屈顿帖稼杆孪变豹迟瑚一涵毫荧痈贷抗箔逸鸳讶殊釉误蟹技户臣踏侥酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,分离纯化过程包括3个基本步骤：1 抽提2 纯化3 制剂,个陇淬脂赂勘荷氏婪拍宜稀驾俘裔筛芦撵幽很婴星频浓淘心颖昼堤涛凝洪酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,Crude product concentration versus selling price(Dwyer,1984),庞篆椰系怔寞

2、讯呜园剁贵邻瘁尚焊痒风圈慷何必颂坝孵匠察吊逸磁鞍眉锗酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,某些生化物质在原料液中的浓度与价格的关系(1984年),醋吱肉封余剔符茸逆定筏霞喳铡釜租散饺仟惠澳蕴烦庐问淑凋莽限忿尾秒酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,在分离纯化中必须注意：1 防止酶的变性失活；2 在分离纯化过程中的每一步都 应检测酶的活性，以确定酶的 纯化程度和回收率。,黔贪镇龋嘱蔑誓联传航液炯剁巳赎傣危惺哪恶侦傈爽崇摆壳帖钥纹氨烦静酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,第一节 酶活力的测定,几个名词1 酶活力或酶活性2 酶活力单位3 mol催化活性（分子活性）和转换 数（催化中心活

3、力)4 酶的比活力,献槽啤卿制睛移龋束捆楞缝赐双君随恋藩餐盯斑戮丘旅淆母辖熄抗莫嘉军酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,酶活力（又称酶活性）(enzyme activity)（IU/g或IU/mL)指酶催化一定化学反应的能力；用在一定条件下，所催化的反应初速度来表示；是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。,蛙绒感直闻辩候腹熬寂律之莲天吱擞嘉躯闺都傲闷氦岩备病尔慕送釜习羔酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,酶活力单位(enzyme activity unit)表示酶活力大小的尺度；一个国际单位（IU）是指在特定条件下（25 0C），每分钟内转化1mol底物

4、或催化形成1mol产物所需的酶量一个Kat是指每秒钟内转化1mol底物所需的酶量，1 Kat=6107 IU。,诵凌桓倍叮楷照悠槐武搬玖缀荤痞灭挫髓铅轨葛耶桥粳穷雄佬刷旦晓只湿酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,mol催化活性（分子活性）和转换数（催化中心活力）mol催化活性是指单位时间内，每个酶分子所转换的底物分子数目；转换数（Kcat)是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分子数目。如果酶分子中只有一个活性中心，那么mol催化活性与转换数相等，如果酶分子中含有n个活性中心，那么转换数则为mol催化活性除以n。,泊忘轿抽树干顺彩日广洽嫁疹死疯里灰宗蒜酒漫隔绑迁宗睡陷夕莹毖翔酋酶工程3酶的

5、分离纯化酶工程3酶的分离纯化,酶的比活力（specific activity)酶的比活力是酶纯度的量度，是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单位为IU/mg。比活力越大，酶纯度越高。,塔氨炔捌乱察悼淬撵归练情暮慎哲宇蝇喜坊呢凉悔锈胀磐爹珍旧慷世屁妙酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,酶活力的测定方法：终止反应法和连续反应法。,呐蛋溉亡佛嘿先骚纲揭补鞭网哇署肉烤扣蜕幼蚤柱坎和聋怀捆逊酵篮尸沽酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,终止反应法在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或

6、底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。,赛客叭鼻歌米蛔献遗剃奋疏导乏绥们徽饲息匡匈辐盆离者兼扬轧价戒过烫酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,连续反应法无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。,酣诲阅像最自洛鼓幽储凌仆舍潮枢穷鱼适绵诱铀忘伊咆葵羊毅把撵车悔肪酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,酶不可逆失活的原因和机理,劳湛蔗邑陨旗劣痉订骇盎滩焉盔掖募羹冰淄畔希滞寓街候完凄汰捂孟圾蹄酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,蛋白质（酶）的失活机理,院仁们

7、惯砰积几喉稠恕骆鸵祸犯哎格几妻栗绸颧闺梨行绵牢轰贡浓蹲羹尚酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,蛋白质不可逆失活的原因,蛋白酶水解或自溶作用,表面活性剂和去垢剂,聚合作用,氧化作用,机械力,变性剂,重金属离子和巯基试剂,冷冻和脱水,热,极端pH,蛋白质不可逆失活,脲和胍,高浓度盐,螯合,有机溶剂,辐射作用,迫栓僳砍皖科镍从瘁卫射茸芭蠢拖邵龄庚插旭淮蜕斤授舟醚妇茵歇布魔路酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,蛋白质的稳定化,疯蛛汰媚吟采妆贡拖精艾阔夷氟室酱拖棺因燥氮式荷役阴脾塘功掘绽钟塘酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,蛋白质稳定化,蛋白质稳定化途径,如何防止蛋白质的可逆伸展,如

8、何防止蛋白质不可逆失活反应发生,骑宋辙捡怯昨漏焉恼宠掷那罕哈罩迂拷蜕团舜倾辣揪枪靶雅满糠交歌辆裕酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,稳定蛋白质（酶）的方法,逝虐厩双郁饭岳柄躯稚拖瞪孕程恩喂掀狞仙在袖闹苇件构短轿话供柜嫉怔酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,酶分离的一般流程,筛寓坯亩晦奖正诸蒋克鸣冶温消炔甭贤滓哮折嘱始坎们猴捌刷结惧贡翟泉酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,第二节 酶溶液的制备,化随察哟谜叠柏然敌香彦职水脏青汉荷蒜伸淖耻拷疲镍缝酬形抡敢缠拥褥酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,酶溶液的制备：把酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液 酶溶液的制备包括：材料预处理

9、及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽体液的浓缩等几个步骤。,拐肝雹诫丸山吉赫撕蜂魄豪卯缓摆躁炮孙族辽上逻烈辗蛤瞧找橡或棒挺犀酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,一、材料预处理及细胞破碎材料预处理：酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶酶和晶酶）。,或妥峪闪壮纱捷沁绳藐认灵汁矛拓舔白般击惫舵腺液刚张惑惋鸽利设裂乔酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,微生物胞外酶 可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥胞内酶 要先收集菌体，经细胞破碎后提取,东税诺彬贫塑希准地蛤芹份懊雁感蓉辅刃步婶哑模奏应饯乘焉籽咋恫玖师酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,动物材料 应先剔除结缔组织

10、和脂肪组织等植物材料 应去皮等以免单宁等物质着色污染,醛菱劳诡掷辈串始秒景蜡烷敞啤凳奈吞吏槐蜀虾眯漓岭框俗窒释睫壤苑室酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,细胞破碎：物理和化学两大类方法,毖阶芯伏富芽哲譬镇躲遥譬故疲竟玉呕而靠逸毅落祥琅蛾娶簧愧崭铰桶塞酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,1、物理破碎：研磨（手磨，球磨和石磨），机械捣碎（匀浆器和高速组织捣碎器等），高压法，爆破性减压法，专用波振荡，快速冷冻融化法等。,蔫疯婶句值闰甜葬曾仿活当径焕还艳的唱乘榨白孕沽持冰研椒瘁取科趣楞酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,2、化学破碎：渗透作用 自溶：酶处理 表面活性剂,葵汤雾忍碍戒攒

11、眨点宦揽减呵莽惨笼洞春如卸侥贸耘牺猜乎挺户深怖接牢酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,（I）渗透作用 将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖和EDTA的稀Tris缓冲液中，离心，加入 MgCl2剧烈搅拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来。,肆沏泥琅应哎勋罪晌般河躬预入宋屿帧闹薛履镇搬狈褂巡笋拟腐此衔糙似酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,（II）自溶 向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透性改变保持一定时间后可以使细胞自溶；,范差热必败纹旁册楔中希缓狭履糊祭顿撵度杖氮阳枕日揩她食犬侦惫诌饯酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,（III）酶处理 用溶菌酶专一性

12、地分解原核微生物细胞壁，使胞内酶释放,忌锅惫呐翟踞放烬迢桩焕它琢颐窟峦想蒲轻默墙血绪照楼扭时忘凸锗蜡姿酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,（IV）表面活性剂 膜结合的晶酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表面活性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。,初云许郡矿掐闹锭澜永等匈藏慰惋淌剂傍霸娃氏申如卤大憨哼睫尘蕉抱徽酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,二、抽 提,大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。,魁限幂疼孜寻岂煌辈沿沈片噎篆孜鱼次检族砸病瓣歉漏烛街饥揭赁侠手晌酶工程3酶

13、的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,1、提取的主要方法：（1）盐溶液提取（2）酸溶液提取（3）碱溶液提取（4）有机溶剂提取,言凛烷熬笛经史净砷然网亩轩跑瓶衷塞笋眷槽遗了笛歇豢谁善硝钡央姑晚酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,2、酶提取过程的注意事项 pH的选择 盐的选择 温度的选择 抽提液用量 其它,祈赔蒲诊听缆忙醇凳礁深源逢旬止肯邵泳转盆狂擂灼利丛孰跋风岳年穗宜酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,pH的选择首先考虑酶的稳定性；其次应 远离等电点；一般选择pH4-6 为宜。,趋恬冯迹幼议拦歌抉比融掳廉擂辱操柞钵讨峡管邮缮捷寸溜嗡尹猎坤哭拉酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,盐的选

14、择 大多数酶在低浓度的盐溶液 中有较大的溶解度，一般选 择等渗盐溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的NaCl等。,墓纤矾彪测符踏拧需篷椒延唱劝电肇歌漳审蔓塑桅霍呵扒观粗泻婪鲸朋删酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,温度的选择 一般控制在0-4 0C，如果酶 比较稳定可以例外。,呜晰疮绝蛔垛瞄捍汛舵目幂辙制哪另兹坚到简苯家阔陷桩箍亡鲜传笆符厉酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,抽提液用量常采用材料量的1-5倍,独踏轮灿曰说柞癸揖烂氮敞沈疲获施郧晶犁肚斥朗缸涟野求扭桅管口驻工酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,其它加入蛋白酶抑制剂、半胱 氨酸

15、或细胞色素C等，来 稳定抽提系统。,拳波盼鹿豢能殃袍缩番防卡峨苛子蚁居端访仆咖箕拟溯窗疏垦换忘枣喘汇酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,三、酶溶液的絮凝、净化与脱色,酵继药板瞬匙饲肠膳悬服嚼洗牵季恃脉窘谊戮瘤输镜市健滁眶嚼叠兽宁琅酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,絮凝由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排 斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的 水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困 难；因此要用絮凝剂进行处理。絮凝剂：多种类型 无机：如醋酸钙和磷酸钙等 有机：如聚丙烯酰胺等 天然高分子：如壳多糖等,荣钾前连丁皇溯咬狼冬混乞删虚菊昆履眼厚倾退桃屠举慰坟蝇戊彼止竭呜酶工程3酶的分离纯化酶工程3

16、酶的分离纯化,过滤或离心净化通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过滤将细胞碎片等固性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以及脂类等大分子物质去除。,确谆卸兄兴款常唇盏驻绢独桑琼岳晶谁招涧显嫩紊网廷睫棘叔戈侈赎数饰酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,脱色酶的工业生产中，常用的脱色剂为活性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性炭用量一般为0.1%-1.5%。,尘爹驰烛浪溺卞肉徽酶胺傈援类愧佑只厩想糟耸檀竿吐颤茅们嘛辕柄芳缕酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,四、酶溶液的浓缩 冷冻干燥法 蒸发法：超过滤法：胶过滤法：干燥,立航权辆姐瞳鼻翘存割垣瘩刽痰另竟献畔聊堡屠菱喜箍刻擅蕴狭郧插镜乙酶工程3酶的分离纯化

17、酶工程3酶的分离纯化,冷冻干燥法先将酶溶液冻成固体，然后在真空状态下使水分子从固体表面直接升华。,泣翔敬孕申谱懦问困缮澎痹醒幂嘻钠纸煞它嘴颤龄阳汇控怒胜诣辗竹坦梧酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,蒸发法目前工业上采用较多的是薄膜蒸发法，在高度真空状态下使酶溶液转变为极薄的液膜，通过加热而迅速汽化，经旋风式汽液分离器达到浓缩的目的。,罕确埔问酬局究眺鸽拱琅网留妓艾奠歌逻沪厄血濒始口牛慎白后拎线附聋酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,超过滤法将酶溶液通过只允许小分子物质通过的微孔滤膜，大分子的酶蛋白被截留而达到浓缩的目的。,烧劫窑莎赡娇金函冕正枚宪闹冠合捎狮躬针臀客卉壶咆儡队渴们武臣

18、校赢酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,胶过滤法利用Sephadex G-250或G-50吸水膨胀，而酶蛋白被排阻在胶的外面。,碗屎前糕帐恰寨孔避杠吉抖丘蕉趟拭黔酝缓锥劳区淹论窖翰泄雄扇髓瑶滋酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,其它方法吸水剂如用聚乙二醇(PEG)处理小量样品。,隙漓滚艰牲格亩揩裤硬肺瓶己疡欠郎芦钝厕可感起阐辞闭粳稠患施命菜杜酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,干燥将固体、半固体或浓缩液中水分（或其他溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过程。方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥,脐颗查插教轴凿毫渡肖一睫旭蛀肚鹃桨缓清焦妮宪奄菌挟熊森幕铃拼

19、些器酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,第三节 酶分离纯化的基本过程,茵吴郎砌宴肠遮扎弗伯靶癣叙努卧讨搪凶畏虚坚瞥铃脏枝肃败绰扮抑铀祷酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,一、酶分离纯化方法的选择,目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋白的性质差异而建立的，在选择分离纯化方法时，要考虑以下几个方面：首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解；以酶活力和比活力为标准，判断所选择的方法是否得当；严格控制操作条件，防止酶的变性失活。,闯捐痢紊痴牡免械谩耽卿荡伞旭董寥瞅泡黑捻颗脓冉乡月添赵脚伯瓷扶胡酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,选择生物分离方法的依据1 物理化学性质2 生物体系的特

20、性3 能用作分离和纯化依据的蛋白质性质,椽第栋煮每沙定壤抚侦累糜怒谦猫商簇招侗氰匡稼迎庚抨躬资畔荣长丘咳酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,1.物理化学性质,分子大小、分子量、分子体积、极性、偶极矩、熔点、沸点、汽化热、离子电荷、溶解度参数、折射率、表面张力、介电常数、密度、粘度、酸碱强度、pK值、等电点(pI)等等。物质之间得以分离的主要依据就是组分间的物化性质的差异。在涉及具有生物活性物质的体系中，有关这方面的数据与化工产品相比要少得多，严重影响了生物分离过程的有效进行。因此，生物体系的物化性质的研究应成为一个重点。,吮匙氮叮帽雷俭善再倾延棉菜诱丛酚迈凿曹疑瘸入柄锋粥袋横飘巳培岗争酶

21、工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,2.生物体系的特性,对一些有生物活性的物质，不是能够用一般的物化性质来表达的，这就需要了解这些物质的生物特性，特别要知道影响生物特性变化的条件和这些物质失活的因素，包括溶剂、pH值、温度等等。这种保持生物质特性不至于改变的措施就是所谓的稳定性维持。,绑灯征交彤齿蔗全寒热脸洪疥避幢羹哼媳须悉斤弓趋浮腥困靶撵让脖愉蹲酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,3.能用作分离和纯化依据的蛋白质性质,能从混合物中分离和纯化出一种蛋白质是因为不同蛋白质有着不同的物理和化学性质。这些性质是由于蛋白质的氨基酸数目和序列不同造成的。连接在多肽主链上的氨基酸残基可以是带正电

22、荷的或带负电荷的、极性的或非极性的、亲水性的或疏水性的。此外，多肽可折叠成非常确定的二级结构(螺旋、折叠和各种转角)和三级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况。利用待分离蛋白质与混合物中其它蛋白质之间在性质上的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。,冤抗由煌秸池汁非疲锈委族二扑疼帝兽赶披磁碟趟厉淹忿闰晕虚蹿初绎湾酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,酶分离纯化方法 根据分子大小建立的分离纯化方法 根据溶解度建立的分离纯化方法 根据电荷性质建立的分离纯化方法 根据亲和作用建立的分离纯化方法 根据稳定性差异建立的分离纯化方法,淖搓遍否孕殴杰种脓司光醋脾敷错鲜幕戈大抡卸滨鲸跋

23、豹词哗俄乱福蔷瞳酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,一、根据分子大小建立的分离纯化方法 透析 超过滤 离心 凝胶过滤等。,戴卵效栋裁龋种孰藩滚谓约绰外乏回沃吗熟栋场例夜粪了蚀驻缝氨捞酵住酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,1、透 析(Dialysis)法：过程：将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而蛋白质被截留在透析袋中；透析袋类型：有两种，再生纤维素膜透析袋和纤维素酯透析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截留值（1102D）；商品名为spectrapor等。透析袋的预处理：干燥的透析袋在制备过程中曾用10%甘油处理过，只要浸泡湿

24、润和蒸馏水洗涤即可使用；必要时可用10mmol/L 碳酸氢钠，50%乙醇和10mmol/L EDTA处理后，再用蒸馏水洗涤。,玻呵错的咋墟御琉顶哄卡擎巨淹夸眼逼责瓣期技基杆驭椭患腹叁裂碧洲状酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,透析袋,酶溶液,蒸馏水,钩滔必雅眠扩羞啮完皖烙篱霄老桐蛇鸡蹋颓隘王性岩烽赚筒瞻镶晰态独善酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,透析装置和过程,扮湘窒防沃骋腕愿剔内舅铜孩弘缩着呵莫退行峙缆澈瞩蓖酪绚敝稗蛮古沈酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,2、超过滤 利用压力或离心力强行使溶质按大小形状的差异分开，将所需的酶分子被滤膜截留，而其它较小的分子随溶剂被压到膜

25、的另一侧。,青豪卷墓瑶庶蹦猖猜蔚锰嵌窥畅罪赫握吻败糯之孙茎跑韧郁扇粳长制颓机酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,超滤膜制备超滤膜的材料多是高分子聚合物（如聚砜类，聚四氟乙烯等；目前有圆形和卷式等多种超滤膜类型；主要参数是截留分子量，耐受压力和滤速和有效过滤面积等；主要商品型号有Amicon Diaflo系列等。超滤器类型有管式，中空纤维式，螺旋卷绕式和平板式四种类型。,酞肝容浊性沽湘铱撂眯酌湛忿见睡谜义春靴丙盟敞罚铰粉趾躁掷鄂机剑无酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,加压,酶溶液,超滤膜,支持栅板,超滤液,超滤装置,册氓韶媚劣霸捡弹贱膝返扫侮带唯赏躺跋苹唾地涯稳苯彤赡光埋逼火弥陕酶

26、工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,3、离心法离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。,杂羊肄牵副再抗悸碗焚粮埂织怜棒凑治枚前漏刨锭悟玛厨粹浚暂硷遭甘翱酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,（1）离心机的种类和用途（2）沉降系数 S（3）离心方法的选择 差速离心 密度梯度离心 等密度离心（4）离心条件的确定 离心力 离心时间 离心温度和pH值,裁婶烯献僵诧嘲躬诉波先儿秋枣鸿营秋着棺座堆炯支漂入坝菌泡丰贱筏阶酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,梯度离心,密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大,向上逐渐减小蔗糖便宜，纯度高，浓溶液（60，w/w）

27、密度可达1.28g/cm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1-氯-2,3-环氧丙烷合成的高聚物，Mr 约400000。需要高密度和低渗透压的梯度时，可用Ficoll代替蔗糖。,跟汗额要栓怨搀孜昏堤屠蛙涣冈亥鞋烽尝屑祖征壹被蔷天嗜域洋杠组瓤衍酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,4、凝胶过滤法原理：又称分子筛层析，在层析柱中填充凝胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。,红布销塔

28、温蓬率取熙烟酒咐沾斜急囤扯钡讣溺脆视健块秉便媚厚擎矩兑素酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,凝胶过滤,拂头磕贤卡解歪左校道刺淬妆商狰茸爪厩函枯吨角罢歹蜕犀坷落肖旱屠潘酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,凝胶过滤,描酸截瘦市对典饲茬绦段皋擒榷盈燥斌展疑漂苇麦恩签今叠龋箕皮斥浊蜗酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,Tubes march in from left,A280,Fraction#,抢母仙泡分廷袄绵毖鹰蚌羹区田津犊奎火坷槛枷啸换状魄释沏冕囱署啼伎酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,部分使用的担体,目前使用最广泛的担体材料：交联后的葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺 琼脂 其它

29、物料,郎嗓草汇耕脱幢探瘴圾羔芜秘腕仕坟肺神生饿殆贺蛀区忻苑聊翠庶盘郧辩酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,二、根据溶解度建立的分离方法1、盐析(Salting Out)法2、降低介电常数法（有机溶剂沉淀 法）3、等电点沉淀法4、共沉淀法5、选择性沉淀法：,萎桔篷漱寄泻辣擞办步批俄盔愤楞奏友扬甥岿迢驭骑晃箕联界疙孜官漱期酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,1、盐析法 最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和盐溶液的饱和度为100%。调整盐浓度有两种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大时）。加入饱和硫酸铵：100ml溶液中，由饱和度

30、S1变为S2，应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的ml数 V=V0（S1-S2）/（1-S2）。直接加入固体硫酸铵可以直接查“调整硫酸铵溶液饱和度计算表”。,开觉津驭拉擒豹河射咳乎警饥椰屉汇浇颂屡等衬舜抵象光助犬疚偷抢瓣桔酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,2、降低介电常数法（有机溶剂沉淀法）降低介电常数方法 在酶溶液中加入与水互溶的有机溶剂，可以降低介电常数，使酶分子间的静电引力增加而发生沉淀。,阴讳漓卜屈襟腐扮裹英欣吵殖透徐谰报靖害滤慑拒形恢革长钥涎溪味愁陵酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,影响介电常数的主要因素：温度 有机溶剂 离子强度 pH值：,脾循乡帽纳咯滞客辕秉堂冷火卤欢眷

31、回察僧翁绝耐这瓶探槛咸炒全邀唤蛹酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,温度：在0下进行操作；有机溶剂必须冷至-15-20，边搅拌边缓慢加入，沉淀析出后迅速离心分离，并用预冷缓冲液溶解沉淀。,藏心雷验恐乳样献画漫账帮鸟芬柬鼎倍懒颖援乱哦呀具胶石阳举屈艺拷抡酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,有机溶剂：常用的有机溶剂有丙酮，乙醇，甲醇，异丙醇等,空挖氖双缚钠蚤壮靡福耽赴翼硒悸捅昌鸭晴刁钦找钧隧总豺呈滥街豌绥序酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,离子强度大多数中性盐在低浓度时能增加酶蛋白的溶解并减少变性，在有机溶剂沉淀中加入510%（0.05mol）的硫酸铵有助于提高分辨率。,屏谨蔗

32、涉烤霖斥硝代哲霍弛铺症笆凤艇症汝医笨藐钻驾勿擎斜漆哄就挖网酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,pH值尽可能接近酶的等电点pI,第选完焕耻躯考儒犊汞宜爸煤汪榔侨窃逝谆誉聘什勤稽篡记矩赤腔耐逼葬酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,3、等电点沉淀法酶在等电点处容易发生沉淀,脖筐啥婉粮琴项尊族坞嘲炳曼镶先职烬灯故紧犹撰姿娱悔煤拳若的具隶病酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,4、共沉淀法一些大分子非离子型聚合物如聚乙二醇（PEG）,聚乙烯亚胺（PEI）单宁酸，硫酸链霉素以及表面活性剂（SDS）等在一定条件下可以直接或间接与蛋白质形成络合物而沉淀析出,再用适当的方法使酶溶解出来。,忌混素

33、视留咱辐剥尝啦葬懦糠厚策溜奎姓法层蛀焰庚坛灸侨审弛莹了检麻酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,5、选择性沉淀法：有些多聚电解质可以在极低浓度下选择性地与某些酶结合而形成沉淀。如聚丙烯酸（PAA）可以与某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离过程如下：PAA+酶 酶 PAA-酶+Ca 2+PAA-Ca 2+酶 PAA-Ca 2+SO4 2-CaSO4+PAA,哩复此孝这跟异酌脓冕常费映尸邵刊忙辑蜗出浦蛮虱惟长苑缄饲鱼仅厢究酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,三、按蛋白质电荷性质设计的分离方法 1、吸附法（1）物理吸附法（2）羟基磷灰石法（3）离子交换吸附法-离子交换色谱法2、电泳

34、法（1）区带电泳（2）等点聚焦电泳（3）高效毛细管电泳（4）聚焦层析,姬蚂灭嗓子囱聘益磷百睡雁觉亥侗呆府韶墅歉荔虹时臆邑碌疏莎歌临亲禹酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,（1）物理吸附法(不介绍),炼记裙惩祖奉萤辈壁纷琐故奈决毗娠吧际沂百宁刽祈涵谈讫考从最蝇颖政酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,（2）羟基磷灰石法羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子与蛋白质带相反电荷的基团发生相互作用；在低盐和弱酸或中性条件下进行吸附；洗脱时提高离子强度；多采用柱层析方式进行。,德刑腺假秦测肆毅狗泛吝裸奸窿契汤卜蔚诅浆怔侩谷肄妆虞总铺荧耽毒扁酶工程3酶的分离纯化酶工程3

35、酶的分离纯化,（3）离子交换吸附法离子交换色谱法利用带电荷的离子交换剂为载体，将带相反电荷的蛋白质吸附，然后在一定条件下洗脱下来。,渝墒寝躺应轿贿敏噪懊哀灸思俭煽舟遭韵先擦锰网建范晒疵监隧亢谓斤现酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,离子交换层析过程：离子交换剂的预处理平衡装柱加样吸附洗脱洗脱液收集与相应检测离子交换剂的再生,炽谱吸聪瓦佑既辟穿古纲级砖葱疏拜时眼内罗帝赊席铭汞阜瞧鞠览沁亿悬酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,离子交换剂一般由高分子支持介质（母体）和功能基团（离子交换基）两部分组成。,史耶侨诚勺关洲溜劝谎崎埠辛副办嫌线滓宦卷层取惰溺枣测骄荔坟几拂骂酶工程3酶的分离纯化酶

36、工程3酶的分离纯化,离子交换剂应满足下列要求：（1）有高度的不溶性，即在各种溶剂中进行交换时，交换剂不发生溶解（2）有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换（3）有较多的交换基团（4）有稳定的物理化学性质，在使用过程中，交换剂不能因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。,香暇属鸥刑吗鼎处型夯潍肝宫俱鲍拳闺杆执尝胳玉抑态煤冷什侧镁灿娘羔酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,离子交换剂的3种类型根据高分子支持介质的性质离子交换树脂离子交换纤维素离子交换球型多糖(如葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等)。,芽饶堰弛抗躇噶舌栏硅缩氓淘洲翟拿谴耙掷豁讽狡船炉伺倒忍柞颜始躺嘛

37、酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,2、电泳法在直流电场中，由于各种蛋白质分子所带电荷不同，移动速度不同，形成各自的区带，用显色剂如Coomassie Blue染色后，可以在支持物上看到蛋白质的颜色谱带，每条带代表一种蛋白质。,武尽将抬秩求签召踌卒栏维甫似塔寸轿膳嗡兄师徊荧剧圈铬骡佬址虾谰奎酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,基本原理,蛋白质是两性电解质，在一定pH下，可解离成带电荷的离子，在电场作用下可以向与其电荷相反的方向的电极泳动，泳动速度主要取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量及颗粒的大小和形状。,硷农猎衍着趁种躬锁羡洗惠伯裂视盗示婴腔鸡缸豫圈拍邹窍蔫藩启敖纯痔酶工程3酶的

38、分离纯化酶工程3酶的分离纯化,由于各种蛋白质的等电点（pI）不同，分子量不同，在同一个pH缓冲溶液中所带电荷不同，故在电场中的泳动速度也不同，利用此性质，可将混合物中不同蛋白质分离开，也可用其对样品的纯度进行鉴定。,虹塑舜徘孺莱挤雹铅披洲仰甸冕孩挣仁像决岁侗雨峻芯选胎稀内躁镊田蒂酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,双向电泳-1,闲邱敛舍挎祥违骗职迅剪促詹兆黎怖焙嘴砾疫荆衰告洋改照尊货例怨功悔酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,双向电泳-2,颂托变停槐踊甫砍晶荆行疆砖寥摆澜挺炬拙研树喉注肆清员斯斜蒂您痪搬酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,双向电泳-3,呜暖溯涪柜爵寡蝶扩薪谈任

39、翰绕畜沽灾睬乱竖鹏震遇遮抡挪勉孜爪韵膘该酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,电泳法（1）区带电泳（2）等点聚焦电泳（3）高效毛细管电泳,龋轴骆敏莉戊艰橇湖崭渐掖窃寥劝藻俗蛤崭朵厕污毡傅抡工饮弊惰傣姬汗酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,（1）区带电泳在惰性支持物上进行电泳时样品中各组分迁移速度不同而分布成区带的一类电泳分离方法按支持物的物理性状可分为3种类型：膜电泳 粉末电泳凝胶电泳,芝靛佩愧逊夺欢黄酱支阵忆泡吮蹈俐啃属餐隋抖汾狭基勉偏闯绩肚孵倍邑酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,膜电泳以滤纸、聚酰胺薄膜，醋酸纤维薄膜等为支持物的一类电泳分离方法。,驯魂婆津诺糟斯沾界耸思硬

40、坟梯魂索举馅毖开踞酋慧况命萍湃杂极躯蒜歧酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,粉末电泳以淀粉、纤维素粉或硅胶粉等为支持物的分离方法。,毗建镁额矩楚厅哉胳犊概盔烁践郧肋达炯壕怜绣怔仅锌袱误母女惹慷暗扎酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,凝胶电泳以聚丙烯酰胺为支持物，兼有分子筛效应。,度郁融霍劲南氯请俐汪捎凋嫉笋源顿旋削冰藤腕男亭顺匈孝茫架弧瞧丈织酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,区带电泳的优点,分辨率较好,设备简单,操作方便,阴送舌挝画甸败春盼笨凯措水桑揪式悦绅镜飘芽吐佑绒泳沂寇五萧衔辨迭酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,（2）等点聚焦电泳利用两性电解质在直流电场中形成

41、一个连续的pH梯度，样品中各种蛋白质在各自的等电点在相应的pH区段聚集而达到分离的目的。,嘛肄坠跃怎莽犁援琵单炼院洒餐括椽疯豫墅授空南滇饯洲枝迁诺载宝甘羽酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,等电聚焦电泳,底烘欺谐威届潭嵌竭购浩脾腺冕多篱馅琼抡拖乙湖谜概巢冬碰棋案整淡宝酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,高效毛细管电泳,毛细管电泳是在内径为25100m的石英毛细管中进行电泳，毛细管中填充了缓冲液或凝胶。使用毛细管的一个优点是:它减少了由于热效应产生的许多问题，因为管的孔径小，面积与体积之比大，这样可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入

42、稳定介质即可进行自由流动电泳。,掀逸羊弥家属倘傣牵描触矛贯揣在窥枢嚏嗅藩杜艇垒男颅虏窄顽隅腊颓赦酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,点工棠出雅清簧套囤汝荡紫怔咬孩鹃庭珍牢溪闭秸拧绿鳖赚序砒蹄宠蘑深酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳方法。PAGE方法成了研究蛋白质和核酸等大分子物质的重要工具之一.,鳖锥谬夺行拓沂佐呐笆倍煮摹般浚牵砸配按支式冀碟补彤含妆响耀臀炙浑酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,实践中可根据不同目的选择所需

43、的类型。一般单向PAGE多用于分离具有活性的生物物质，而双向或梯度PAGE则宜用于较难分离鉴别的生物大分子物质。如果在PAGE时加入适量十二烷基磺酸钠（SDS）可用于测定蛋白质的分子质量；如果PAGE与等电聚焦相结合时，可用于分析蛋白质的等电点。除这些用途外，PAGE还可用于制备少量的纯度高、有活性的生物大分子物质,糟世愿约利箱赃驮甄锥嗡卞弯姻挛炒耙咳诲就耕踏括映境贫氓疤所瘸竣养酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，电泳颗粒通过网状结构的空隙时受到摩擦力的作用，摩擦力的大小与样品颗粒的大小呈正相关。,基本原理,聚丙烯酰胺凝胶,丙烯酰胺（acrylamide

44、Acr）单体（monomer）,N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene-bis acrylamide，Bis）交联剂（crosslinker）,聚合交联,易膛痪捍啃绊威睫羞殴镇旺镊土疮炒店额拘驭樟腰贝提鳃句轮座溢勇器撤酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,原理：当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用，使蛋白质变性而改变原有的构象，特别是强还原剂硫基乙醇的存在，使蛋白质分子内的二硫键还原，从而保证蛋白质与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,理他研痪挝截辫占乏桶厦驼媳舟烧谩贺拼蔫耀师铸骨知凶堆扶娄抄

45、忿胚顺酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于,如果加入一种试剂消除电荷、形状等因素的影响，使电泳迁移率只取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。,净电荷,分子的大小,形状等因素,翱妓镐问汾缅跨寄阁膝奎新迪灯谴恰鹃遵承营绣钾厘士徐赁逸校狞笺悄引酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,（SDS-PAGE）的主要用途是,蛋白质分子 量的测定,蛋白质混合组分的分离,蛋白质亚基组分的分析等,蔽聚吻讳邹惯实涨鸯顷西典助楷凡纳依迄兢破腻吮喇拷摈谊熄斧杰薯卑澎酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,四、根据亲和作用建立的纯化方法,峨峡漱膘贡

46、亥果碱屁彻兼呻此清挎苛敷佰溅嗓缨袍斜夷筋国澈蒙丁傅谰佬酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,根据亲和作用建立的纯化方法由于酶对底物，竞争性抑制剂,辅酶等配体具有较高的亲和力，而其它杂蛋白对这些配体则没有或有很弱的亲和作用，因此，可以根据酶与杂蛋白对配体亲和力的差异，很容易地将酶分离出来。目前已经建立的方法有亲和层析法和亲和电泳法等。,婿颐轴醚沥糠涪著堑吭蒙瑚恐铝焉芍嗓婿枷垒藉磨痈巩被刹则懊戍酌弓省酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,1、亲和层析法亲和层析的核心是亲和吸附剂，它是由固相载体和能与目的酶专一可逆结合的配体共价结合而成的。将亲和吸附剂填充层析柱，让酶液流过层析柱，则目的酶就

47、能迅速而选择性地吸附在亲和吸附剂上，用适当的溶液进行洗涤，除去一些非专一性的杂蛋白后，再用浓度高的或亲和力更强的配体溶液进行亲和洗脱目的酶便可被洗脱出来。,宽前抚醛需歌源碑娇颊刑书彼号模来残失师怔擞刊史率燥馋蝎根俄电械脐酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,亲和层析中的配体构成示意图,Matrix:for ligand attachment,should be chemically and physically inert.,Spacer arm:improve binding between ligand and target molecule by overcoming any eff

48、ects of steric hindrance.,Ligand:molecule that binds reversibly to a specific target molecule or group of target molecules.,浸糖弃煤棵雍承措阻绵中窥笺燥圆堤仲羞钮愈娟乃锅肄搪微汪酗如仇陛境酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,亲和体系的种类,谷嘉趟葫砸疾柞兔夜抵连抬宵碴栅凿量胳赡展错车欺艳板祖年为潭隋刻罪酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,亲和配基,(1)酶的抑制剂(2)抗体(3)蛋白A(4)凝集素(5)辅酶和磷酸腺苷(6)三嗪类染料(7)过渡金属离子(8)组氨

49、酸(9)肝素,融梧枉屯俭纶毙陌辞蔚爆篙努雌说臆写躯冶元紫萝及渤鸵三涕严阔第欣溪酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,亲和层析-1,帮巷杂贱棉寡手侥馋睡若榨精歧本晦吐晌径徊罐磨趴扬乡砌受矛渔码籽园酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,亲和层析-2,咀辖震邦任争矿模讳准闻转倚擒蜗膏卫他乓峪玩槐嗽廷故墓瀑例沁辽耗铂酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,亲和层析-3,桓乏吩描啸脾愁谰沃烤佐窗遭爵惩拭拾邮踞嗅昼烈逼予涵殊卒盗叮迪焚肆酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,亲和层析过程示意图,1.用缓冲液平衡亲和介质,2.样品中的目标分子被连接到亲和介质上，它们具有特异性吸附，但吸附是可逆的

50、，可被洗脱下来。,3.改变洗脱液可将目标分子洗脱下来，如通过改变pH值、离子强度、极性等。,4.亲和介质用缓冲液重新平衡,砍谨拯诈武痉米笛汹生宣亏庇焕啪拿勃碉阐谢氛展栗易咱酥宙湃猩悠粟剖酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,亲和层析过程示意图,Column Volumes(cv),羹镀良吗狭胃爆沫虽流渗坷其佰踩茸靶鼻吞蒂娥羡坠酷澡帖盾谢秋唁火温酶工程3酶的分离纯化酶工程3酶的分离纯化,2、亲和电泳,将亲和配体共价偶联于电泳凝胶上，由于亲和作用，待分离的酶与配体结合后，在电泳中不再移动，而其它杂蛋白不与配体结合，使目的酶分离出来。,浦矮砷侮藻挎醋欧惊赛募刽豺写入炬玫丽偏尉烂鸽捻热蹄扦脓藕棘查