酶工程基本原理.ppt

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1、酶工程,主要参考书:1 酶工程，郭 勇 主编，高等学校轻工专业试用教材，中国轻工业出版社；2 酶工程，罗贵 主编，化学工业出版社；3 蛋白质分子结构，阎隆飞主编，清华大学出版社；4 应用酶学导论，禹邦超编著，华中师范大学出版社；5 酶学，邹国林主编，武汉大学出版社；6 酶在食品加工中的应用，E李雁群译，中国轻工业出版社；,妆俏预吃拿锗茫咕生剁您棋功织尉方治拆豺枉缕颇蘸掣遇橱轰袱神柜厨铣酶工程基本原理酶工程基本原理,CH 1 绪 论,CH 1.1 酶的基本概念 1 酶是蛋白质 2 酶具有催化活性 3 酶催化反应具有专一性和高效性CH 1.2 酶工程及其主要研究内容CH 1.3 酶的历史沿革,奋听

2、智宏阜猾勘悬走吼腹惫孩赋婶岩让芳篇晃删挞联仕补优戍昨撬铁阀独酶工程基本原理酶工程基本原理,酶的特性,一.酶与一般催化剂的共性 1.用量少，催化效率高 2.不改变化学反应的平衡点 3.可降低反应的活化能二.酶与一般催化剂的区别酶的特性 1.高效性 2.专一性 结构专一性（相对专一性/绝对专一性）（特异性）立体异构专一性(几何异构/旋光异构)3.不稳定性（要求温和的反应条件）4.可调控性,入龋讯啮促攒坯济钨炮录丸额赖曰琉咒扎戍阮灿绅了事朱蹋意究诧尧谢组酶工程基本原理酶工程基本原理,CH 1.1 酶的基本概念,1 酶是蛋白质 酶的化学本质是蛋白质，这一点是被生物化学所证明了的，研究酶的化学本质，可用

3、研究蛋白质的方法进行研究；一般情况下，一个结构完整的酶包括蛋白质和非蛋白质两部分，蛋白质部分称为辅基酶蛋白，非蛋白质部分称为辅助因子，辅基酶蛋白和辅助因子构成一个全酶。辅助因子的化学本质因不同的酶而不同，它可以是小分子量的有机化合物，也可以是无机矿物质离子。,犁蘑孜荔灵个疲寻捐德八疫炕太靠蛔赌揉禽略摇嘱艇菊稍巧针晋羽茹薪毛酶工程基本原理酶工程基本原理,2 酶具有催化活性酶是一种生物催化剂，在催化活性上与无机催化剂类似，酶在催化反应时，其本身不发生化学改变，只是催化反应的进行，此外，酶在催化反应时，仅改变反应速度，并不改变反应的平衡。酶催化反应的动力学机理是降低反应的活化能。酶与一般催化剂的共性

4、 1.用量少，催化效率高 2.不改变化学反应的平衡点 3.可降低反应的活化能,本颂铺栋罗溪潭柿宇裁胁孩匈待蛰眺兰颊爽账棒鳞炙尉首谈游雕侧牲奖疙酶工程基本原理酶工程基本原理,竹饲垣申于谨诬泵秧济运冰堤模曼答授诗瘟涝争竞刀城苫从绎有墟菏溶荐酶工程基本原理酶工程基本原理,3 酶催化反应具有专一性和高效性酶作为生物催化剂，其催化反应的专一性远远超过无机催化剂，根据酶的专一化程度，可分为绝对专一性和相对专一性。绝对专一性是指一种酶只能催化一种底物进行一种反应，底物的分子结构、空间构型及构象的不同都表现出专一性。酶与一般催化剂的区别酶的特性 1.高效性 2.专一性 结构专一性（相对专一性/绝对专一性）（特

5、异性）立体异构专一性(几何异构/旋光异构)3.不稳定性（要求温和的反应条件）4.可调控性,男巩著切块笼抽霄京坎阎纂贪护滁战伤屋做零僳胆况坤章惭宫缠那漓烧寥酶工程基本原理酶工程基本原理,相对专一性是指一种能够催化一类结构相似的物质进行相同类型的反应，主要是对某一化学键的专一性。例如：胰蛋白酶(Trypsin EC 3.4.31.4)催化含有赖氨酸或精氨酸羰基的肽键的水解反应，凡是具有含赖氨酸或精氨酸羰基酰胺键的底物都能被此酶催化水解。,旬拒隘郧舍枚瘤另凸充陨残匡地泡箔蜂焊齐标吝以娠觅众材裸那绸贡崩隐酶工程基本原理酶工程基本原理,CH 1.2 酶工程及其主要研究内容,1 生物工程（Biotechn

6、ology）：又叫生物工艺学，是20世纪70年代开始提出的一个高新技术名词，是指以遗传工程技术为先导的将生物技术与化学工艺、工程相结合并产业化应用的技术领域。包括四大分支领域：遗传工程、细胞工程、发酵工程和酶工程。2 酶工程（Enzyme Engineering）：是酶学研究与其应用工程结合形成的一门新的技术领域；是酶学、微生物学的基本原理与化学工程技术有机结合、相互渗透形成的边缘学科。包括上游工程和下游工程：前者包括酶的产生和酶制剂制备；后者主要包括酶固定化技术、酶修饰技术和生物反应器。（1）上游技术：（2）下游技术：,惰治砧庇渺联扼善众姿孩蜒槐漂古艇氖错闷髓精冤钙颇拒啃荤朝运哥隔极酶工程基

7、本原理酶工程基本原理,CH 1.3 酶的历史沿革1 酶学研究简史,1 酶的发现:尽管我国早在4000多年前就朴素地应用了酶,但真正对酶的认识还是1833年Payen 和 Person 首先从酒精发酵物中提取到一种活性物质,发现能够促进淀粉分解(发现了淀粉酶);2 酶(Enzyme)的提出:继Payen 和Person之后,德国的Kuhne进一步深入研究了酶,并提出Enzyme这个名词;enzyme 是希腊文,原意是指“在酵母中”我们翻译成酶,日本译成酵素.3 酶学(Enzymology)奠基:在Kuhne 之后,Buchner兄弟从事了从破碎酵母细胞提取酶的研究,获得了能转化糖产生乙醇的粗酶.

8、此后便开始了从酶的提取、酶的性质、酶催化反应等开始了酶的研究。形成了初步的新兴学科。,售窘掏宠聘冶梳辞愉域弦咯瞬国码球林愧晴拎古吗淫扶望远盅腑构扔弓婚酶工程基本原理酶工程基本原理,在酶催化理论方面：1 1894年，E.Fisher提出酶与底物作用的锁钥学说2 1913 年，Michaelis Menton提出了快速平衡学说，建立了AN酶促反应模型，推导出了酶促反应动力学 方程米氏方程。3 1925年，Briggs和Handane，建立了恒态学说，并 对米氏方程的修正。4 1958年，Koshland提出了诱导契合学说,嚷变食胡菇环蒲艺揭萨氢饰佛垛岂为向栈祥臻精蛋篮阎纵研贴丽嗽捻霸棵酶工程基本原

9、理酶工程基本原理,在酶蛋白化学的研究方面1 1926年，Sumner首次获得了脲酶结晶，证实了酶的 化学本质是蛋白质21年后获得了诺贝尔奖。2 1963年搞清了牛胰核糖核酸酶A的一级结构；3 1965年报道了鸡卵清溶菌酶的三维结构；4 1969年首次利用单一氨基酸人工合成核糖核酸酶获 得成功5 1982年Cech小组发现了rRNA具有催化功能，第一 次动摇了酶是蛋白质的概念。（Ribozyme）但蛋白质化学研究与其催化原理及其酶蛋白功能研究始终是互相促进、相互渗透的。,挪玲曝握丘莆菩谗字挑案狂拢欠涵挽涕榷询啄曰镇诀静觅猩研炯胸乖仔际酶工程基本原理酶工程基本原理,CH 1.3 酶的历史沿革2 酶

10、工程的发展历程,1 酶工程研究的奠基：以工业化酶制剂生产为主要内容的酶工程雏形阶段（50年代）；2 酶固定化技术和细胞固定化技术研究始于60年代；3 70年代基因工程崛起，将酶工程技术研究引向深入并赋予了新的内涵；4 1971年第一次国际酶工程会议的召开，标志了酶工程学科和完善的技术体系的形成；5 80年代实现了克隆酶的突破；（Wager将青霉素酰化酶基因克隆到Ecoli菌株 质粒上，获得了高效表达）6 80年代形成了酶固定化技术、细胞固定化技术研究等酶工程的研究热点，并广泛产业化应用.开始了转基因技术和酶化学修饰技术；7 90年代形成了以遗传工程为先导的酶工程技术分支生物酶工程（包括酶基因克

11、隆表达和基因修饰）,裁蠕晤灾盏疮寸俭缺县椎舞晋婴辐莆徐憋橡扔皖屁声脖悼丹翠达瑞绢振俊酶工程基本原理酶工程基本原理,CH 1.1 酶的结构和功能CH 1.2 酶催化反应的动力学CH 1.3 酶的分类和命名CH 1.4 酶活力概念及活力测定,CH 2 酶学基本原理,密筒蜡清回摹铭湛援蔑婉陕边乡扮驮酿莲急锻烛道豢蛮约限修扣酌电匡淘酶工程基本原理酶工程基本原理,CH 2.1 酶的结构和功能(.酶催化功能的结构基础),1.1 酶的活性中心构成酶活性中心的氨基酸在一级结构上,呈分散状态，这些氨基酸是通过酶蛋白的二、三、四级结构使得其在空间上彼此集中，构成一个特定的与酶活性表达有关区域，这个特定区域即酶的活

12、性中心(active center)，换句话说，酶的活性中心是酶分子上的与底物结合并催化反应的特定基团或特定区域。酶活性中心包括两部分，其一是底物结合部位，其二是催化部位。例如溶菌酶:由129个AA构成,而构成活性中心的AA有:Glu35,Asp52,Try62,Asp101(Gly101)构成.,寅幂彭版注荫探插凤彦蜘宛马带鼻抄敦美蓄廓沪熟涎俞角朴包情篙朵帅素酶工程基本原理酶工程基本原理,1.2酶作用高效性机理-影响酶高效性的因素 1.邻近定向效应 2.应变效应 3.亲核催化/亲电催化（共价催化）4.酸碱催化 5.微环境的影响 邻近效应 是指A和B两个底物分子结合在酶分子的结合部位上，两分子

13、的反应基团相互靠近，从而降低了两分子进入过渡态所需要的能量，或说增加了两分子反应基团的发生反应的空间机率。定向效应 A、B两个分子进入过渡态，两分子的反应基团需要按一定的方向重叠或交叉，这一方向稍有偏离，反应就难以进行或增加很大能量才能进行，这种酶活性部位赋予底物的这一方向性即定向效应。,撮侮羽筹染揍佳糜是无伎值揽蓝账滥滋钨蹲驾狞岩妮只粹幼无搓险菊莉援酶工程基本原理酶工程基本原理,1.3 别构酶 酶分子表现其活性是以完整的结构为基础的，某些酶除其活性部位外，还有一个别构部位影响酶的活性，这些酶又称为别构酶或变构酶。别构酶多为代谢 代谢调节酶，由别构部位的变构改变酶的活性，别构部位的变构也是通过

14、与一个配体结合来实现的，但其与酶的活性部位不同，别构部位结合的配体不是底物，而是一个调节酶活性的效应物。,再皖昔咯船德檬碎经捶穷瓤魁匈告杠侧洒援哦茧棉蔫宦邑富瓦屁着麻抽颐酶工程基本原理酶工程基本原理,友豁虚掖弱噪晋掩耸哇砒悠从韵髓翟垣牺锰弄烃笋完庭秋耻备邀婶袒涯酿酶工程基本原理酶工程基本原理,CH 2.1 酶的结构和功能(2.酶催化专一性基本学说),2.1 锁钥学说(lock and key theory)1894年，E.Fisher提出酶与底物作用的锁钥学说，以解释酶与底物之间的专一性问题，其基本含义是：酶与底物分子或底物分子的一部分之间，在结构上有严格的互补对应关系，当底物与酶结合时就象钥

15、匙和锁那样契合对应。.2 诱导契合学说(induced-fit hypothesis)1958年，Koshland提出了诱导契合学说，其主要内涵是：当酶与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于与底物分子结合或催化的变化，酶与底物在此基础上互补契合，以发挥酶的催化功能。,藻谁绣悦厘瘤励产允容以挡颁幢殊蓝鲸应虚屹牟椿培交谴懈娄兔刃椽蠕啼酶工程基本原理酶工程基本原理,锁 钥 学 说,涎宦侥捧守京蜡毖辅蓟疽房絮先距驾乌置佩据驾咕理峪偷畏蜂追见扑痊宁酶工程基本原理酶工程基本原理,诱导契合学说,诲茧粪治踢揍惑轧梆拾鸳楼慑弊饿辈锤贬茅艇购乓凸炙舱羚侣车汉短善柬酶工程基本原理酶工程基本原理,

16、丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋内的微环境（疏水性、电荷性质）决定了丝氨酸蛋白酶的底物专一性,平琢惑听闺志传舜拂孟脖荚揽爵填肯疚讥严兹书击裔姬希父始迸兹贮念喝酶工程基本原理酶工程基本原理,胰凝乳蛋白酶：口袋较大，主要由疏水氨基酸残基围成，开口较大（由两个Gly组成），因此需要底物有一个疏水基团（芳香环Phe、Tyr、Trp及大的非极性侧链）定位。裂解芳香族氨基酸羧基侧的肽键胰蛋白酶：口袋较大，底部有Asp，利于 Lys.、Arg结合，裂解碱性氨基酸残基羧基侧的肽键 弹性蛋白酶：口袋较浅，开口较小（由Val，Thr组成）只能让Ala等小分进入，裂解小的中性氨

17、基酸残基羧基侧的肽键,捞舟熊裤栅屑悠虽敖翅犬学流才泞震尿那外喊市架骆弥胃壮妥泄甚遏掐扶酶工程基本原理酶工程基本原理,定暑奥添走器婶笺郸韩乔赘矩宇池瓣蓬嗣橡节初卑渡吮寞溢绑圭城氯卖推酶工程基本原理酶工程基本原理,酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser-His-Asp催化三联体（电荷中继网）。电荷中继网：Ser195His57Asp102氢键体系。通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。没有底物时，Ser195His57Asp102形成一个氢键体系，His57是去质子化状态，Asp102的COO-通过氢键定位并固定His57。结合底物时：His57从Ser195接受一个质子，增加

18、了Ser195羟基氧原子对底物的亲核攻击性，Asp102的COO-稳定过度态中His57的正电荷形式。,滁息雍谆摈鲍写倾老然卞戴哺巷怕绒角畔胀讼亨鹅裴寥惶搂觉用洋周茂厢酶工程基本原理酶工程基本原理,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制第一阶段：酰化Ser195-OH 中的氧攻击肽键的羰基碳（共价催化），酶的His57咪唑H+与底物中的-NH形成氢键（酸碱催化），形成四联体过渡态（Ser195O-、底物的羰基C、底物的-NH、His的咪唑H+），肽键断裂，氨基产物释放，底物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。第二阶段：脱酰电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-攻击连在Ser195上底物的羰基C原

19、子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，底物中的酸成分从Ser195上释放。,寄锨湿矽鞋懊凭灸新纽右簧虐失钮矮油冒婴纬艘焊友嫌闹协蠕想陈有菱犁酶工程基本原理酶工程基本原理,酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶 1.胰凝乳蛋白酶结构,碎宽耕占剔班宽殆糟槛坦芜区好盔荡盾媚彬滓缸泵艺净谎溺琼巳颁负苏躁酶工程基本原理酶工程基本原理,酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶2.胰凝乳蛋白酶的电荷接力网,念溺藉婴丸坍钙肖掐搀榔嚷榨靠摄肄使窑避罩韧邦丛焚圆题芒精矾屑局郡酶工程基本原理酶工程基本原理,四.酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶 2.胰凝乳蛋白酶的催化过程,A.酶与底物结合，形成米氏复合物（ES）

20、,B.形成四联体过度态中间物,豫蔓抨左残葫快浩议浪桩掇枣阳演弗昌驭撤铂鸽升稳推郧磷碟辨禹察摘城酶工程基本原理酶工程基本原理,酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶,坏移硬稼碳共谋游笆灼篙蝇毡饭饭藩朔桃爬匿愁荫恬广宰行脆篙界骡唉了酶工程基本原理酶工程基本原理,酶催化机理实例胰凝乳蛋白酶,E.形成包括水分子的四联体过度中间物,F.羰基产物形成，酶游离,疮煤旅者怨侥悉括胀劫箩症抱胳宇踏壳驮钧乖僧邱筋一寂斡田叭吠骨懂溪酶工程基本原理酶工程基本原理,CH2.2 酶催化反应的动力学（.酶催化反应的初速度）,即帕病诞啤颠榴衫撅撬盈谓叫戮砷祖闷掷叠棺厕怂鸳甄译涕蹈寻练坝祁撵酶工程基本原理酶工程基本原理,2.1 Micha

21、elis-Menten迅速平衡学说 及Henri-Michaelis-Mentwen方程 单底物酶促反应模型:k1 kp E+SESE+P-k1 迅速平衡学说对上述反应模型有两点假定：酶与底物结合形成酶底物复合物的速度很快。整个反应速度取决于酶底物复合物释放出游离酶和形成产物的反应速度。,CH2.2 酶催化反应的动力学（2.底物浓度对反应速度的影响）,傲筏咏改洽糠陆亢沏榴钡识齐郁邹备刁林遇抑橇帆易水义逐哭戊塌漏谰旷酶工程基本原理酶工程基本原理,反应速度 v=kpES.(1)Ks=ES/ES(Ks是ES的分解常数).(2)ES=ES/Ks.(3)如果我们设反应体系中酶的总浓度为E0,当反应达到平

22、衡以后,酶分子以下列两种形式存在：E0=E+ES.(4)将3式分别和1式4式加以整理便得：v=KpES/Ks.(5)E0=E+ES/Ks.(6),CH2.2 酶催化反应的动力学（3.Henri-Michaelis-Mentwen方程）,赚迟翼窟洋衡庇峻寸惫滩蚁窜御凌豆趾垫茅互骄淄咖委峭综滑缝贺枚账俯酶工程基本原理酶工程基本原理,将5式除以6式得：KpES/Ks KpS/Ks v/E0=.(7)E+ES/Ks 1+S/Ks将两边都乘以1/Kp S/Ks v/KpE0=.(8)1+S/Ks v=KpES 只有当E0全部转变成ES时，反应才能达到最大反应速度。Vm=KpE0.(9),文曳凤刀暂佑氦示

23、序择诵倪浑矩胃沽蔑趁韵溢损团郊特蛊命罗陡掖制略逻酶工程基本原理酶工程基本原理,将9式和8式整理得：S/Ks S v/Vm=.(10)1+S/Ks Ks+S VmS v=.(11)Ks+S这就是Hemri-Michaelis-Menten方程。也就是我们所说的米氏方程。,吭踩占澜隘讹犀箭抽韭魏宇署勉潘寒睛阻辜戍装志美骆育笺帆蝇识桐镶握酶工程基本原理酶工程基本原理,我们总结一下，利用迅速平衡学说进行米氏方程的推导有以下三点基本假设：在反应模型中，不考虑 ESE+P 的逆反应，然而，对于大多数酶促反应来说，反应是可逆的，要忽略这一逆反应，只有在反应的起始，产物时才成立。S大大高于E值，在反应过程中，

24、底物的消耗可忽略不计。ES解离成E+S的速度显著快于ES形成E+P的速度，即ESE+P的反应不影响E+SES的平衡。,英落笛完慈举贾嚼胯颜抵止厄耽浦导榔廖隅让挂情图歇忧踏掖谰渤殴夸乖酶工程基本原理酶工程基本原理,CH2.2 酶催化反应的动力学4 恒态学说及对米氏方程的修正,事实上迅速平衡学说对很多反应不太适宜，为此，1925年，Briggs和Handane对米氏方程进行了修正，提出了恒态学说。其基本内涵是：在初速度测定过程中，底物浓度随反应时间而降低，产物相应增高；而中间复合物ES可在相当一段时间内保持浓度的恒定状态。Briggs和Handane对米氏方程的修正，保留了迅速平衡学说的前两点假设

25、，因此，反应模型仍为：k1 kp E+SESE+P-k1,獭丸累蘑慢郧纺触忆军舷纂晨敏去歹傣夏舰望贮方搁若盟镜撤级滨施第廊酶工程基本原理酶工程基本原理,底物的消耗速度为K1ES，底物的消耗用于ES的形成，ES已经形成，就会按-K1ES的速度解离成E+S，同时ES按KpES的速度形成E+P。v=KpES.(1)E0=E+ES.,.(2)v/E0=KpES/E+ES.(3)v/Vm=ES/E+ES.(4),户扶叼论短稼装捏玻喘耀脸转泪噶钟互眠歹芝吱悠禹紧诉仿仟税绳栅灵理酶工程基本原理酶工程基本原理,恒态学说认为:K1ES=K-1ES+KpES=(K-1+Kp)ES.(5)ES=K1ES/(K-1+

26、Kp).(6)定义:(K-1+Kp)/K1=Km.(7)ES=SE/Km.(8),藐鉴损伟厂烽工槐弦坝第粘纠鲍主瘸失袁闷割裕谎增遮惕忽误鼠勋锹羞腐酶工程基本原理酶工程基本原理,将(8)式代入(4)式得：SE/Km v/Vm=S/(Km+S).(9)E+SE/Km VmS v=.(10)Km+S(10)式即为修正的单底物酶促反应动力学方程，为了纪念Michaelis-Menten创造性工作，这个方程也称为Michaelis-Menten方程，简称米氏方程。式中Vm为最大反应速度，Km为米氏常数。,慢疮幢四疾涩饺凰咳来抒岭坤荒旭胺协缠嘘糜瞅侵乖徘循智骸苗啪桐蛹铺酶工程基本原理酶工程基本原理,CH2

27、.2 酶催化反应的动力学5 Lineweaver-Burk双倒数方程及Km的测定,将米氏方程取倒数可得以下方程:Km 11/V=.+1/Vmax Vmax S利用此方程作图即可计算出酶的Km和Vmax。在设计测定以上参数的试验时，需注意S的取值范围，一般应该在Km值两侧设定S值，经验数值是0.33-2.0Km范围为宜。,漱通邯挟旱扰灿圭捉感颐曾炯峡钓联粹否釜绍店昼语炽榜坯躁约畴忘枷奥酶工程基本原理酶工程基本原理,CH2.2 酶催化反应的动力学6关于米氏方程意义的讨论,反应速度v是底物浓度S的函数，其几何意义是一条双曲线。当S远远大于KmSKm时：VVm；在测定酶活力时，必需提供足够大的底物浓度

28、；反之，当SKm时，VVmS/Km，因为在一定条件下，对于一个酶来说，Vm/Km是一个常数，所以，反应速度V与底物浓度S成直线关系，在酶法分析中，利用酶测定底物浓度时，应提供足够大的酶浓度，使得产物与底物浓度成直线关系，以根据产物的形成来测定底物浓度。,VmS v=Km+S当V1/2Vm时，Km SKm是酶促反应的动力学常数，其等于当达到最大速度一半时的底物浓度。Km值是酶的一个特征性常数，它不受酶量，酶的纯度的影响，当pH、温度、介质的离子强度等不变时，Km值不变。它是酶与底物亲和力的标志，Km值越大，标志要使反应速度达到最大反应速度一半时，必须提供的底物浓度越大，即酶与底物的亲和力越小；反

29、之亦反。,因为Vm=KpE0，所以，当底物浓度足够大时，最大反应速度Vm与酶量成正相关，因此Vm是随酶量而变化的常数。催化反应的Vm应换算成酶的催化常数Kcat，Kcat是每摩尔酶每分钟催化转化底物的摩尔数或产生产物的摩尔数。,遥蓟擎甜峙办秽删藤蜡属序窃缴睫崖脐敛吕诲鸵广剐章毫吭饭妄甘衰炕木酶工程基本原理酶工程基本原理,影响酶促反应的因素,一.底物浓度S1.酶促反应速度V与底物浓度S的关系,傣陋汛藐壤久海脾楷汽跪貌梳灿陡牺葱迭贬思长呕旧脓旭悼邓母阑廉爹嚷酶工程基本原理酶工程基本原理,敲硅幼轴篮硬降逊丁徒瓷肄罪崎涸董辣听疯兜邮择抢猿敛篆缚汞秘息俺硫酶工程基本原理酶工程基本原理,影响酶促反应的因素

30、,二.酶浓度 E,存委酿财蜒类蘑侈置涧脾诈赵秘桩羔挨惋畦素地尖灾晌默鞭颐极朽耕咎类酶工程基本原理酶工程基本原理,CH2.2 酶催化反应的动力学 pH对反应速度的影响,戚寡顾衙坚蜡嫂嫂叁二夯督笔郑矢剿傍底磺错模寡沿江胸榔囱被螟渺妙苔酶工程基本原理酶工程基本原理,pH对酶活力的影响主要表现在以下几个方面：pH的改变影响酶的空间构象，从而引起酶活力的改变。pH影响酶活性中心催化基团的解离，影响酶与底物的亲合力或催化活性。pH影响底物的解离状态，改变底物的可给性。,菲怀玖少镇措打乞皿赔迂组删肯逼申辑匡毫蚕寐门逾舌误恰悟曝牢皮织埔酶工程基本原理酶工程基本原理,CH2.2 酶催化反应的动力学 温度对反应速

31、度的影响,禁典榨写勇梅鞭率达甫轩叫域沉战坚急扼论疯洗蔫绊诡陇宿容蛊熔穴痔蛔酶工程基本原理酶工程基本原理,温度对酶活力的影响，主要表现在两个方面，一方面温度的改变影响着酶的稳定性，在低温条件下，主要表现为可逆行失活，随温度的恢复酶活力也得到恢复；在高温条件下，表现为不可逆行失活。另一方面，温度直接影响酶促反应的进行，根据Arrhenius方程：k=Ae-Ea/RT 可以看出，速度常数k与绝对温度T成正比。,咐谬缅犬笑赣簇怔算桶休笔齐篱息趴嚣队皋罚核封剩嘛炮靖榔妥讥棱拣眷酶工程基本原理酶工程基本原理,影响酶促反应的因素,五.激活剂对酶促反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。无机离子或

32、简单有机化合物对酶的激活。,煎释焊炒随正潭访浴瞅丛休蛙绑配灌粉坎辕腹憋汁量雷民甭吭情寓洼沟它酶工程基本原理酶工程基本原理,1、无机离子的激活作用（1）金属离子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe 2+、Ca2+（2）阴离子：cl-、Br-、PO43-（3）氢离子不同的离子激活不同的酶。不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与K+、Mg+与Ca+之间常常拮抗，但Mg+与Zn+常可替代。激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，150mM,聂捅榔亭匿恿晾嫌甲贡始云肛拱瓜躺称堕唤蜡铱蹄哪迭呼挎炔捣卓诛蹲肖酶工程基本原理酶工程基本原理,2、简单有机分子的激活作用还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽

33、）能激活某些活性中心含有SH的酶。金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑制作用。3、蛋白酶对酶原的激活,疤亥丁耿定剂拼语鹿恿贷婿葫嚣阶缀尼摔胆泄擅怯与书颅觉怂驭柿系附俗酶工程基本原理酶工程基本原理,抑制剂对酶促反应速度的影响变性作用(denaturation)：抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或丧失但并不引起酶蛋白变性变性剂没有选择性抑制剂有不同程度的选择性,宛券构抽押匈瞻帜坐仇稳污持沤睹技皮葡杰移桅的破江伦联落骄昌赤完韧酶工程基本原理酶工程基本原理,研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：（1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开（2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代

34、谢控制发酵（3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础,忠宾忍绷掂层慌编蛊阎缘酗烁谅票数赁昆救摹篇蛛受搬掌晾榨奇檀嘎边销酶工程基本原理酶工程基本原理,（二）抑制作用的类型1、不可逆的抑制作用抑制剂与酶活性中心（外）的必需基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使 酶复活。2、可逆的抑制作用 抑制剂与酶蛋白非共价键结合，可以用透折、超滤等物理方法除去抑制剂而使 酶复活。,皑很筑碱绎邦工乏哥腊涂迸瘁蒋钒罪迹献九贴弛芦卞眠隘祷观羔斌呕拾茹酶工程基本原理酶工程基本原理,（1）竞争性抑制（Competit

35、ive inhibition）抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。,丙二酸、戊二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制,噎牡黑田蓖超吟久粪单扳舍些磐疑击卒呼负狼两洪浓勋陌除白睡娘腊捕仲酶工程基本原理酶工程基本原理,（2）非竞争性抑制底物和抑制剂可以同时与酶结合，但是，中间的三元复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，其结构可能与底物无关。不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用,某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+,钒氮释

36、调哄卿硫靛喝肘浇忧勃颗曳降睫桥斟沥氨碳做梯肃虞夯呼哄闭宠玻酶工程基本原理酶工程基本原理,（3）、反竞争性抑制酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+SES+I ESI P常见于多底物的酶促反应中,磕侩荤显昨吮勤莲跨瞬结芝库吹唆指粹淤趋均恿柿签晦击独豺抒晾控芍穴酶工程基本原理酶工程基本原理,（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别1、通过透析、超滤、凝胶过滤等2、通过V-E速度曲线3、通过可逆抑制剂的动力学曲线可以区分三种可逆抑制作用,稚蝉填盘跨弧百戮客躁腾犯安贩盆伎呢堪逼胀裤站青祟萤矾骚玖鬼右杉折酶工程基本原理酶工程基本原理,1、竞争性抑制：,相对活力：,抑制分数：,动力学方程：,（Ki为

37、EI的解离常数）,抑制程度决定于I、S、Km和Ki,聋萌讣箕潘竣黍柿寐臼瓢松袱缘那些尉盂泛蓉谐炔寺四狄奔障补害覆喀卢酶工程基本原理酶工程基本原理,竞争性可逆抑制图示,墓楔摇妈享押漆溉股苦黍卉壁后乐表丁杀目拖考普叹范锌离选架职狈拓蕉酶工程基本原理酶工程基本原理,Vmax不变Km变大，而且随I浓度的增大而增大,杉孤驻抖伍赡判悟居楚恳逗很将睬哥拖颇纯开眷虐亦涕祭扬姿瞳迭沉甩独酶工程基本原理酶工程基本原理,竞争性抑制作用小结：（1）Vmax不变，Km变大。（2）抑制程度决定于I、S、Km和KiA.抑制程度与I成正比，与S成反比 I一定，增加S，可减少抑制程度。S一定，增加I，可增加抑制程度。B.在一定

38、I和S下，Ki越大，抑制作用越小，Km值愈大，抑制程度愈大。,企搔漳危迭芍坐孔灾绣悄胃褪巩攻兰沙叁鞭养庆恕巡疮菩连荷尾雌夹第烯酶工程基本原理酶工程基本原理,2、非竞争性抑制,相对活力：,抑制分数：,抑制程度决定于I和Ki，与底物的Km和S无关,动力学方程：,评噪酒乒万店髓勒建奇然钡寥榆娇悬百列豪习职九稽牧卒顶宝禄尖晋镊杖酶工程基本原理酶工程基本原理,非竞争性可逆抑制图示,希粗菠吁挑荒诲真坤博捣篆塔嘎晃戊樟厢粉烽裂躇网蕉辜厌墓秤秉应延鹊酶工程基本原理酶工程基本原理,Km不变，Vmax降至Vmax/（1+I/Ki）,脖唯荐箕磺咸赞仗栽勺剁怔蛋氛纂胜国吉干报卤诬骸巨昔秉宦壕鬼寨替疤酶工程基本原理酶工

39、程基本原理,非竞争性抑制小结：（1）Km不变，Vmax降至Vmax/（1+I/Ki）（2）抑制程度决定于I和Ki，与底物的Km和S无关：抑制程度与I成正比 在一定I 下，Ki越大，抑制作用越小,午果斤合恼袋熬谁显溪厢误恕移皿夸痘右锨鉴稍洛辜鉴淀警征失卓痪竹败酶工程基本原理酶工程基本原理,3、反竞争性抑制,相对活力：,抑制分数：,动力学方程：,抑制程度决定于Km、Ki、S、I,菲袖涟九跪鹿梗膳所亨牡细软纳怠株彭硼觅名曼乍燎腰挑龋强贷戎驰慎旱酶工程基本原理酶工程基本原理,Km及Vmax都变小,俞糖渺元两赣汇洗衷头岿傅素滚皿接啼惰松悯紫呛醋术熙嫂罚漾孟挑啤戎酶工程基本原理酶工程基本原理,反竞争性抑制

40、小结：（1）Km及Vmax都变小(2)抑制程度决定于Km、Ki、S、I抑制程度既与I成正比，又与S成正比在一定的S、I下，Ki越大，抑制程度越小；Km越大，抑制程度越小。,纵兄扭脑差候绝传岳蒂狗解拥怀藤烬寓蝗为炬开泵嘻钦抠锥摇芥浆司谓烟酶工程基本原理酶工程基本原理,表小结：三种可逆抑制作用的酶促反应速度V与Km值,煤致赦巾峙腑更憎射蝎醛傣苏耻昆专褐有岸葬喊和铣穆搁摔缅哑钉狮茹亏酶工程基本原理酶工程基本原理,赐龙崭抨医受钉篱数础狮会焊啥维蒸泽泄门箕庭汛撬俊篇筐蕾匹风蒜瓤辨酶工程基本原理酶工程基本原理,鹃毯腐缓爽黑龚稠臆瘦桐陆缄虫特咳癌杨酮掀熏到靳溪黍悬逝昂既稚秤偏酶工程基本原理酶工程基本原理,一

41、般每一种酶有两个名称：一个是它的习惯名称，其习惯名一般是根据它的催化底物来命名的。淀粉酶(Diastase)，蛋白(Protiase)，果胶酶(Pectinase)等。另一个是其系统名称，国际生物化学协会(International Union of Biochemistry)酶学委员会(Enzyme Commission)。于1961年该委员会正式提出了酶的系统命名方案。将底物和催化的反应同时考虑，进行命名，如：-1，4葡萄糖水解酶；对于双底物的将两底物用冒号分开：如：ATP:己糖磷酸转移酶；对可逆反应的，一般正反应和负反应用同一个名称，主要考虑催化的主要方向，或根据首先证明的催化反应来确定

42、。如乳酸脱氢酶。,CH 2.3 酶的分类和命名1 酶的命名原则,膘泽觅滋仕悔磷莽珊郁冗尺臻猴溪锌狰偷勇今渤隘拒证佃玲婆置透珍疆淘酶工程基本原理酶工程基本原理,CH 2.3 酶的分类和命名2 酶的分类原则,1984年出台了一套目前为普遍接受的酶分类体系；根据酶催化反应的类型将酶分成大类，即：氧化还原酶.（1）转移酶.（2）水解酶.（3）裂合酶.（4）异构酶.（5）合成酶.（6）酶的分类编号原则是采用四码编号方法，第一码代表大类中的哪一类，第二码代表大类中的亚类，第三码表示亚类中的小类，第四码表示小类中不同酶的排序号；四位号码之间用圆点（）分开。,竖诵液坊栅讶束唤洗耍尸斡致密累镊锰萌痔敷钳我圃天周

43、原拎右樊畔显医酶工程基本原理酶工程基本原理,例如：水解酶类3.1 是作用于酯键的亚类 3.1.1水解羧酸酯键 3.1.2硫醇酯键.3.1.7二磷酸单酯 3.2 作用于糖基化合物 3.2.1 水解糖苷键 3.3 作用于醚键 3.4 作用于肽键,尝畜鸟棠论嚏亢巴海么俯颧诬筷回怖塔硫蛛嘿窿力捅誓伎植型峻犁大瞒瞅酶工程基本原理酶工程基本原理,CH 2.4 酶活力概念及活力测定 1.酶活力概念,酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应速度。酶的活力越大，反应速度越高。我们知道，酶催化反应速度，用单位时间内底物的减少量或产物的增加量表示：ds dp v=dt dt酶学委员会(EC)对酶活力单位作了统一规定，

44、酶活力单位定义为：在特定条件下（酶的最适反应条件），每min 催化1mol底物转化成产物（或产生1mol产物）的酶量即为一个酶活力单位（U）；这个单位又称为国际单位（）。,啮粘馏纠绊列径智舌岁棠马屈疙葬常惶稗妊卡蛔窜鼓饵董耀舀钳莲人视览酶工程基本原理酶工程基本原理,近些年来，提出了一个更大的酶活力单位，即Katal，一个Katal单位是在一秒钟内，转化一摩尔底物的酶量。Katal=6107U 酶的活力单位和质量单位虽然都是酶量多少的标志，两者之间无法彼此对应，为此，人们引用了酶比活力这个概念。即每mg酶制剂所含的酶活力。酶比活力酶活力（）mg酶制剂,颇才询猛昔洗捎钾帧蔓审拇人碌四敌宰妹椿票盐励

45、税掘裂蕴卢贯茵文嘶夏酶工程基本原理酶工程基本原理,魏姬柄锣良弹仑奶簇媳逻搽届墓谋糜摔度一形狈鞍专购浇华内冤秆谭链逗酶工程基本原理酶工程基本原理,CH 2.4 酶活力概念及活力测定 2.酶活力测定原则,酶活力的测定方法多种多样，总的要求是快速、简便、准确。无论用什么方法，都包括以下几个要点 提供最适底物：由于酶的底物专一性，测定酶活力时，提供的底物必须是最适底物，当同时有几种底物时，以Km值最小的为最适底物。测定时酶量适当。酶量太小：酶量太大：确定反应时间适宜。太 长：太 短：反应条件应是最适反应条件，主要包括反应温度、pH值和基质的离子环境。,倘铬缚犀回默猴浅懈申妖兜荫秆喻梨蛾皂豆勿藉谢铺淤湃是虞逆骸泵椿姑酶工程基本原理酶工程基本原理,