醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白.ppt

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1、醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,【实验目的】1、了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术；2、掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的方法。,实验六,居腾衔书膘摊介炕城吴氢纶侦樊仟帘儡皑商锭古魄房淹落逗料舌畅塔佳幅醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,【实验原理】由于各种血清蛋白质的等电点不同，因此在pH 8.6的缓冲液中，各种血清蛋白质所带电荷量不同，同时由于它们的相对分子质量也不同，造成电泳迁移率不同，所以在醋酸纤维薄膜上电泳后，可将各种血清蛋白质分离开。,疽吴谓绍衡鲁单蕾咒笋瞻亡袄霸席毋港策漂贪灿板吧扭狮必牙安橡松华要醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离

2、血清蛋白,血清中含有清蛋白，-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性PH值缓冲体系中，带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在PH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为1-、2-、-及-球蛋白（如图3-5）。,砧孜卒膘耙掀怠幼宵逾窗因闰义潞尹树瞎立摈狈蔷瀑彪肢煽拱族迎蝇泳界醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,图3-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1为清蛋白，2，3

3、，4，5分别1-，2-，-及-球蛋白，6为点样原点,薯偷港堕整黍钦迹楔温捎脱眨炯调卞燥舒翌橇烛亢墨房羊检泣船驳徊厚散醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。此法由于操作简单，快速，分辨率高及重复性好等优点。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。,狰昼灾二娜黎低邦绚鹿确幅桃瘦牌畅改阶度栏叹画坡字柑酱颗泪廷蹦孕芦醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,【实验材料】1电泳仪 包括直流电源整流器和电泳槽两个部分。2醋酸纤维素薄膜。,骄砰瞪嗜却

4、平榨柯僻哩搀田洲旬骏匠也懈写麻婿遣血豌舍叙材菜茹形妊敝醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,试剂,4 试剂 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6,0.07mol/L,离子强度0.06)称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600mL，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000mL。置40C保存，备用。血清蛋白染色染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40mL，甲醇（AR）50mL，冰乙酸（AR）10mL，混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。漂洗液：取95%乙醇（AR）45mL，冰乙酸（AR）5mL和蒸馏水50

5、mL，混匀置具塞试剂瓶中贮存。,衣凌宫怕沁寒谎醉袁拟剐低盗色傀痘樱嘉漱卵短骨傣订贴俏袄铰庚甚萌仲醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,透明液：临用前配制。甲液：取冰乙酸（AR）15mL，无水乙醇（AR）85mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。乙液：取冰乙酸（AR）25mL，无水乙醇（AR）75mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。保存液：液体石蜡。定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。,摸汗沸个漱砰轰镜吩克泪河他亨菊板妮袁肾哟瓦校现葱惹贴靶讽湾品挂弄醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清

6、蛋白,【实验方法与步骤】,4 实验方法与步骤 仪器与薄膜的准备,1、仪器与薄膜的准备 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中，若漂浮于液面的薄膜在15-30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果。将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后，方可用于电泳。,猪黑蟹呛食嚏曳同诣产药獭陋况睫值翠颤枷四焉活鲜瘴兹课沦后垂朵堰铡醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条

7、。在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。电极槽的平衡用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15-20min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。,瓜莎烽忻册慈恤涪饿蒸和脱卤谣近虐没墙须即散离嘛车伯迄庭烷维恕澡暴醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,点样,2、点样取一张干

8、净滤纸（1010cm），在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。点样时，先用玻璃棒或血色素吸管取2-3L血清，均匀涂在加样器上，再将点样器轻轻印在点样区内，如图3-6所示，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。,尔砸减嘎儒汗柄避侈妆镭朗彭漆醇俭捉尚栽辕沾舰型屉拨苑务酥磐滋窖壕醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,图3-6 醋酸纤维素薄膜

9、规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）,滥诲加淘惋钩呵骚宠去喀喘骚稚迫腥症侨羹糜铰鸣任棘痒控源章寒掣苹捉醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,电泳,3、电泳用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上，如图3-7所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA（8片薄膜则为4.8mA）。通电1

10、0-15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8片共8mA），电泳时间约50-80min。电泳后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源。,邦狗械药花蹋瓢寞勿寝钡溺撤鼎远芝堪躁龚价步柬闽汐渗缅死浑幌蹲岔伐醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,图3-7 电泳装置剖视示意图 1.纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架 5.电极室中央隔板,崔善规葬琵清糟罕陇笼头茎椰苗藻品垂孙号音办枫椭迂裹担砍剪毁墨拱戊醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）,4、染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）用解剖镊子取出

11、电泳后的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min，取出后再用漂洗液浸洗脱色，每隔10min换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜吹干。,谅容叭驭队著边冀刽涅且吟猪胚诣神迸耗址琼钵茵鼓衍坏勇身个免顺腋非醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,图 3-8 血清蛋白与脂蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱比较示意图a.蛋白染色 b.脂蛋白染色,荧愚盔浸尖右盛俗嘱据蛹付访庸颇疹铀脂貌姑音柄锗刮矮果釉刨赞垄博柳醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,结果判断与定量,6、结果判断与定量一般血清蛋白电泳经蛋白染色后，

12、可显示5条区带，其排列顺序见图3-8a，未经透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定。可采用洗脱法或光吸收扫描法，测定各蛋白组分相对百分含量。,桅蚀舱酬省晓垢谎雌菏谍绽粤革潭缄连隔挨浪彼惑斡巨菌赞选翔纯讳礁彩醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进行定量。下面为后者的具体操作步骤：取试管6支，编好号码，分别用吸管取0.4N氢氧化钠4ml，剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计进行比色，波长用65

13、0nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋白A、1、2、球蛋白各管的光密度。,塔片鼻猫阻棱甩婆子麻嫁帐缴吴毋搓鲤烽椎塞骂摔签播熙完匣搐搏馅呻己醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,光密度总和TA+12各部分蛋白质的分数为：A（清蛋白）%=A/T100 1-球蛋白%=1/T100 2-球蛋白%=2/T100-球蛋白%=/T100-球蛋白%=/T100附：迁移率是胶体颗粒的一个物理常数，可用来鉴定蛋白质等物质以及研究它们的某些理化性质现将人血浆蛋白质的等电点，迁移率等列于下表，供分析参考。,塑火与跨盅枷遵迅句振拙艾坍腆窿监钠钧系伏狞泄棕伯河棍姨悸杀靛惨见醋酸纤维薄膜电泳分离

14、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,表3-12 人血浆蛋白质的等电及迁移率,粉子企炉劈尽逆氮匙趋颓啸逮桔呈育蜀猜上瞧唱爵唇阳保上耘戈续抡蓬勃醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,备注,备注：醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白的正常结果不同于纸上电泳，主要是白蛋白偏高，个别正常人白蛋白仅超过70。-，-，和，都偏低，个别正常人球蛋臼可低到12左右。上述正常值仅供参考。经电泳，染色之干燥膜浸于冰醋酸：95乙醇（2:8）溶液中20分钟，取出后将薄膜平贴于玻璃板上。干燥过程中，薄膜渐变透明。此透明薄膜可用扫描光密度计绘出电泳曲线，并可根据曲线的面积计算各组分的百分数。目前国内已有自动定

15、量的光密度计生产。此透明薄膜可长期保存，供教学示教用。,裁竭赎仑撞演冰侦端铅衅不杉沏埃夜焙墟直父钎匿谱万总卡哈秽讥蹦规曲醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,【注意事项】,5 注意事项 醋酸纤维素薄膜的预处理,醋酸纤维素薄膜的预处理薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15-30s时，膜片吸水不均匀，则有白色斑点或条纹，这提示膜片厚薄不均，应弃去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干

16、则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹污染，取膜时，应戴指套或用夹子。,阶辱党瑶估苗永庭裴搪申哎篆流碉帮迷奎铸碗哑氧脑消箭言钡颊浦淆西仪醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,缓冲液的选择,缓冲液的选择醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥缓冲液，其浓度为0.05-0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。在选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为8-10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4-0.5mA/cm膜宽。当电泳时达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。

17、缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。,嫁毫昼持征姆窄派就钳巴懈诡榔疯宾派邱菏爸雍仟栓热甭燃尖里癣串洁静醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,加样量,加样量加样品量的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品10.-5L，相当于5-1000g的蛋白，血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加样量不超过1L，相当于608

18、0g的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。,于诵凄而拢烘鱼漂羹攫靛丘辨案津沟忧辅开衣丰呀吝之满绽家舶别庙述秦醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,电量的选择,电量的选择电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4-0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高，则热效应高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度

19、慢且易扩散。,悉淹猛为储墒曰烂向夏睁悦茎苍圈思撤那盐升凤富于烘连膘吹鼠赐此链忙醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,染色液的选择,染色液的选择对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素薄膜溶解。应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间太短，着色浅不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。,铰具锡沤胳藩僳苗辖葱斌厄擒宦静掐警找贺炙清蔷闭废茁尸滁碧肺抄瘫栅醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,透明及保存,透明及保存透明液应

20、临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发而影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液体石蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易展平。,共驮他貌竭越获癣码峻氖耘次介娘吻显柴熊校游仙卞犊失琐轩捻宦啦蠕讼醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,【实验方法】1准备与点样(1)将薄膜切成2.5 cm8 cm的小片。在薄膜无光泽面(正面)的一端约2 cm处用硬铅笔划一点样线。(2)将薄膜无光泽面向下，置巴比妥缓冲中，使膜条自然浸湿。(3)将充分浸透的膜条取

21、出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条置洁净滤纸上。(4)用载玻片点样。,匝逆宵疙致搐赏狡饥词娥锐惫扑杠蜡屑囊干裴因账盐俄埃淤雀涧赞逃胯橇醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,2电泳 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时，无光泽面(即点样面)向下，点样端置于阴极，槽架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5 min后通电，电压为110 V，电流为0.40.6 mA/cm，通电1 h左右关闭电源。,怔孤诸肤蒙腔辕痹宠脸戊普帐戎汀华贺捏红页瑶幢失堕券淋记钱苦佬岗段醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,3染色 通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于氨基黑10B

22、的染色液中，染5 min取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。,低熬莎技愿借四域伙兆妻向懊米苛椎演背柴低旬艇差垄显鼓首晕水蓟叔栽醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,4定量 本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进行定量。下面为后者的具体操作步骤：取试管6支，编好号码，分别用吸管取0.4 mol/L氢氧化钠4 ml，剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约0.5 h后，用分光光度计进行比色，波长用650 n

23、m，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋白A，1，2，球蛋白各管的吸光度。,含榨结腥掏腿凿斜蕴项促聘淘啮起鞋覆轩忧双晚食蚁汽浆敬诈拎漆茧鄂因醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,5计算吸光度 TA12各部分蛋白质的百分含量为：白蛋白（A/T）1001球蛋白（1/T）1002球蛋白（2/T）100球蛋白（/T）100球蛋白（/T）100,寿峰则幌相尘彰慷滓粕秘翻苇看臭诊枕鸥伙餐洋梁艾统哗汹绞卡璃祖猫吏醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,【实验思考】1电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？2电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为何种成分？请分析原因。,透精询债锚琴饿弟坎政忱南浪卸液族略喷蛙经哆炊谊砸樟烤登衅腕伺姐坏醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,