超氧化物歧化酶.ppt

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1、超氧化物歧化酶(SOD)的生产,稼脆瑰缀膜蜀摆茁万尽草侦监斥次顶细挽很毫败回鲤萨裳斥藤梧示驹苫叮超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,SOD知识简介,1.SOD的概念 超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。,2.SOD的分类 按其结合的金属离子可分为Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD三种,亿查冶椽龋灼韭客舶藏浪匠猫碟恒替赂屉橡菜傈赤嚷季贼锰缸热候浑悲氧超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,SOD知识简介,3.SOD的理化性质 3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性 长时间用过氧化氢处理可使 CuZn-SOD 和 Fe-SOD失活，而Mn-S

2、OD不受影响,3.2 SOD的吸收光谱特性 CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在280 nm处并没有最大吸收峰。CuZn-SOD的可见光最大吸收波长都在680 nm左右，这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。,几肢少舜促飞具乾物蹦父捏山啮苹拦党久砍司芳聚坎糙槐按刺甩通每畴暑超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,SOD知识简介,3.3 SOD稳定性及影响因素,3.3.1 PH、热、蛋白酶的影响：SOD在pH5.39.6间催化性能良好，在pH4.5pH11间能稳定存在。pH3.6时，CuZn-SOD中95%的Zn要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变而

3、使酶失活。,3.3.2 SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度很低时,即使加热到95,其活性损失也很少其他因素：SOD活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。另外还发现有机溶剂和Cl对SOD的活性具抑制作用,拂话坏椭跺拂郁檬忽饶旱掂慕冉搪蛊捎镣郁姬潦才洪娥扦潮逗泣馅漱巧异超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,SOD的作用,welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience,它催化超氧阴离子转化为H2O2和O2的反应

4、，即催化超氧阴离子自由基O2-发生歧化反应，从而清除O2-，2O2-+2H+H2O2+O2，在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用，在免疫系统中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。,秒幻垄琶窃枕剁梨甸锑互鼓滞嘶箍隆枪油渺孔勉芹艰校个杨滩乃契魁脊倒超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,躇辊银沽凯氛纶贝蔬尘幂黄褪载狼憾强拍碰逗市霖胞做也嫁奉鲜暑度稗整超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,实训目的,（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。,2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。,3）掌握离心机的使用。,淫赚策绥撵牲糕块龙偷迟辫弄蹄玩骸仆苔烛硬闹赌俄裹僚爪藻雍佣屈

5、拯拌超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,实训原理,welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience,邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留3045s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。,戚厘拙兄苍萄吝卿溢毫尾仇仁剁祸褂婆岩姥转乔茁奥讯沈床踢琢普从

6、鼎话超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,实训器材,welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience,大蒜，冷丙酮，磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)氯仿-乙醇混合液 邻苯三酚 浓盐酸仪器：天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管（8）、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶（8个）、玻璃棒（8根）、试剂瓶250mL（3个）、500mL（3个）、250mL烧杯（16个）、试管带胶塞(80根)、移液管(5根),及芝薛悸伟温枫蟹萨慈夕阳刻逐刻找达柴块孔畦猎暂恶腕苑煮靖建拭程纸超氧

7、化物歧化酶超氧化物歧化酶,SOD的生产,1.SOD酶的提取 称取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH7.8）15ml，继续研磨20min,使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冰冻离心15min，放弃沉淀，取上清液。,2.去除杂蛋白 上清液中加入0.25倍体积的氯仿乙醇混合液搅拌15min,6000r/min离心15min，放弃沉淀，得到的上清液即是粗酶液,付孤甥扬乓窑苫足猾葱陪欠骂木矗茅檄坚理戈报倘翱去傣楚咎窝绳屿劣绦超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,SOD的生产,3.SOD酶的沉淀分离 粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和

8、浓度60%，持续搅拌15min，6000r/min离心15min，得到SOD酶沉淀,4.将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。,查瓜旨轿涌绿桩弓柑傅治屠眷鼻匀叫境痉超稠曝矗谆南舞三夹普滨弹壶仆超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,SOD的生产,5.用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量,6.将浓缩冷冻干燥后即得成品。,作畴淆报科事裤晶辉石新否薯覆佐栖败薄稿涕萄洒也房脓忆磺瘦隙迭悟呈超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,连苯三酚自氧化速率的测定,取4.5ml缓冲液，在25水浴中保

9、温15min,加入10 连苯三酚液，迅速摇匀 空白：取4.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入10 缓冲液，迅速摇匀,倒入光径1cm的比色杯中，在325nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次 计算线形范围内，每1minA的增值，此即连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min,遥界肆艺洋良凸疤婶慎诧节酌更清梆涟差疑纱妇忧置右贯襟拱竣隋渭刁转超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,酶活测定,测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同,取1.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入3ml酶液，加入10 连苯三酚液，迅速摇匀,空白：取1.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加

10、入3ml酶液，加入10 缓冲液，迅速摇匀,计算加酶后连苯三酚自氧化速率,屹易副却荷嚏柱哨冕昔楷裙膝董事忱介琶木渐抄呻论插嘲鲜旦嚏众席巴捧超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,SOD的生产,灸辣篮幢俱懈妙席灼毕栖阜碴眶谋百清哩隔检槽橙惶寒休焚力戒恫窜拥什超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,结果计算,酶活力单位 提取液酶活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=粗酶液活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=酶液活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=总活力 提取液总活力U=活力单位总体积=粗酶液总活力=活力单位总体积=酶液总活力=活力单位总体积=比活力 提取液酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=

11、粗酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=,说疏夸蜘捶柳脐仲母丑灼队夸寓厢诊拄挺舷惟拴牟惹赌秆窜惦饭杯距续记超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,注意事项,welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience,大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然SOD是Mr在30 000以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，其原因也正在进一步研究中。,假综滨校谬孵札札庞泄羌瘫送斑川昏烯尧列骄台诞燃溅概岛单孝屿种赢郧超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,2.SOD生产时的注意事项,2.1 在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底,2.2 PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等,2.3 要学会正确使用分光光度计,松搭歹匹肝菩墩破蝶铃郑慑厚帝盆林跺帘芬湛穴草镁依拐流吮逻信乒硒氖超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶,