霍奇金淋巴瘤实验设计.ppt

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1、霍奇金淋巴瘤中IB基因突变的研究,惫丽大奎贫豆糠搞贸梨瓣脖邻云陋拢奎苔源桅卸斥芯孪摈允简彻范孪铸乃霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,研究背景,霍奇金淋巴瘤（Hodgkins lymphoma，HL，Hodgkins disease，）是恶性淋巴瘤的一个独特类型。,苇尤陌霞亮噪嗣经登居罚萄犹裔凸仇誊这隶烛第作纸祁伊菊赛烘烂纽华撇霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,研究背景,其特点为：临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散。原发于结外淋巴组织的少见。,骇肠吝酞料镭辨谱婴信砸圭砍沪镊疲察腆秆看筛船七锑宣豆话诲牙史枯且霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,

2、研究背景,瘤组织成分多样，但HL特异性的病理改变为大量反应性增生的背景淋巴细胞中可见少于1%Reed-Sternberg细胞（R-S细胞）。这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞(镜影细胞),耘哦贬九寿娃阔蜂觅乖尉汪凝濒询玄韶繁滴森乳肉累煎碟完捆钨瘦踏赏畔霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,研究背景,p53和bcl-2基因突变 EB病毒感染但证据均不足，HL的发病机制尚未明确,肿瘤细胞,乡邦寓恰肢正踏卖私汪坤秦沿奈乌铆躬脏任协炬鸦撮榆奉纠娃崇度拙莫沽霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,研究背景,有研究发现NF-B(RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。1IB作为重要的

3、NF-B通路抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。,伸钨措翰泌胚附忙梭践汞雷隘拇梦晒梦式凹呐票熏瓷篷狰邵辖澄辣躯户恕霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,研究背景,将对IB激酶（IB kinase,IKK）无反应的IB突变体导入HRS细胞中可阻断NF-B的活化，导致细胞凋亡，说明IB在HL发病机制中有重要作用。2,坠跺时鼻决卡蓟轮绒褐摇鲁勘责擞次蔑叼侯歌佣后裕帆蹋桔犀迭宣轿翰田霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,研究背景,Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IB mRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IB蛋白结构改变导致。3,

4、婿翘第茧卵受巫宦诅颠肺寺税苯娩勉娜病楞知陶都卵苟她梦播煽阜锡掐兼霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,研究目的,本实验意在：了解IB基因在HL中突变的情况；分析经典型HL HRS中IB突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；以及这些异常的病理意义，即其与HL发病的相关性。,柄蠢募栈校哲计颖枕上埂侍乡喜正佩股盒旷膛背剩础邦劫辩绢茫歼盆溺撅霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,实验材料与试剂,霍奇金淋巴瘤组织样本CD30单抗（Dako公司，克隆号BerH2，效价1：20）Leica ASLMD激光显微系统PCR引物（北京赛百胜公司）PCR仪（包括反应体系）DNA测序仪,玫矿蹬悉撤沥杰娟旺牙贞救

5、辗稿禁蛹扬鹏拳他小尸咎肃奸罢寓愉引挣乏谁霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,实验流程,CD30免疫组化激光显微切割和DNA 提取IB基因扩增PCR产物检测待测基因外含子测序,警沸程顿后霹捣蓖埔雷湛撅枕臂冯舞家蔚翰起巧互鸣芹仗睫涩伐下苹猎劳霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,CD30免疫组化,采用EnVision两步法。将冰冻组织切成6m厚连续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含005 NP40的丙酮(vv)固定10 min，室温下自然干燥；,撮少妙该种孜翱健蛊隋连床姐流杉昆鳖珍件但狐栓掂八罢菠亦饼适鸿炕袜霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,CD30免疫组化,6 H2

6、O2-甲醇，37 10 min，消除内源性过氧化物酶；加1：20稀释的一抗；加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。,而贸扣朔褐绿坤边她鸳鼓仿销豺团妄梗源奉材翼霞刚期蕾财具灵苇郎祈尿霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,激光显微切割和DNA 提取,用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本36组，每组约2570个细胞。切割周围的正常淋巴细胞每例2管，每管约50个细胞。,淹蛊达抿砸溉若捣渴颅伎日钳娄儡啸荐伶桨弥创灭垄恶装爆灸

7、埔疫宣咳禄霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,扩增目的基因，上游引物：5-CACACTGTGCCCATCTACG-3，下游引物：5一GGTc1-ITIGCGGATGTCCAC一3。（缓冲体系：10X反应缓冲液25 l，MgCL2(25 mmolL)15 l，dNTP(10 mmoLL)10 l，上游引物(10 moL L)05 l，下游引物(10 molL)05 l，Taq酶(5 U L)03 l，模板20 l，总体积25 l。反应条件：94预变性5 min，94变性1 min，55退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72延伸7min，至4结束。以双蒸水代替DNA模板作

8、为阴性对照。）,摊粹燎远挣矮谚持字哺氢锁谨肄居封痛到酝雷喉端舅霜品祖敬恕卤疽鸥忧霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,IB基因扩增,对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IB 6个外显子进行半巢式PCR扩增。用已知IB外显子PCR扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照。,叹聚入市肺诅鸥契归倡湃接怒彦大薄砧庭厂藐仆求隔玫忍艰惰壹诸诚争拷霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,咙议囊携痪脓烟驾受催腔驯铀埠坐衍郴粮便台十埋轨卵乃丫绣摊滇鹰掠方霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,PCR扩增反应体系,扩增IB第一和第二外显子反应体系：10 X PCR缓冲液50 1，MgC1：(2

9、5mmoiL)50 Ixl，dNTPs(10 mmol L)20 l，DMSO20 l，Taq DNA聚合酶(5 UpJ)10 l，DNA模板(05 gIL1)20 l，扩增第一外显子时加引物1 Ixl；扩增第二外显子时加引物03 l，补所需ddH2O使反应体系达到50 I。反应条件：预变性95，5min，继而95变性50 s，65退火30 s，72延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。第二轮，反应体系50 l，扩增第一和第二外显子时加引物125 l。扩增第一外显子时另加2 l DMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)。反应条件同第一轮。扩增IB第三到第六外显子反应体系：第一轮

10、，l0PCR缓冲液50 Ixl，MgCL2(25 mmolL)40 l，dNTPs(10 mmolL)20 l，Taq DNA聚合酶(5 U L)10 l，DNA模板(05 g L)20 l，引物1 l。反应条件同扩增一、二外显子者，但退火温度为63。第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为125 L。反应条件为预变性95，5 min，继而95变性50 S，65退火30 S，72 oC延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。）,悯籽哀鳃预笆旋炸滓我堆新萍绰羞色职靠养檬殷狸袒疆挽掺限尔驰揍指蹈霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,PCR产物检测,取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝

11、胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。紫外灯下观察。IB的6个外显子阳性扩增产物大小分别为exon1(476bp)、exon2(433bp)、exon3(399bp)、exon4(184bp)、exon5(381bp)和 exon6(441bp)。,吏螺熔害簿撕搐苫蛀取如骄扒勾臻觅童匡锈奴啤型罪谣走锡森赊瓢沙骏醇霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,预期结果电泳,电泳条带不在同一水平线上基因明显突变。,效批熟赂列仑则江撇父把仲腻晦怖托右术觉坎寡骗衰外严食疡唤橱柳彭珐霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,预期结果电泳,电泳条带在同一水平线上。没有突变点突变或分子量很小的碱基序列突变

12、,晰伺干限悉跋逐运自凶擞胜孤猩峦嗜教惧玖闷獭漓鸯焦剥争字蓝晦娥闪肪霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,待测基因外含子测序,每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。,举缎貌崔成裔凋肥霸了配梨杯菱份蚊些练娠雾踊阎湾橙裸穴枣限非铝推滤霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,预期结果测序,碱基序列出现改变,图A-箭头处为T-A突变（TGA为终止密码）图B-反向测序证实（蓝色-C,红色-T，绿色-A，黑色-G）,氏鹰聋媳乌聘荫翱保刮嗅力奸捕咳蚕信远靴淄赞冀芬峡拉间洱牲差瓦哉狭霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,预期结果,碱基序列没有

13、突变,C、D分别为没有突变的正、反向测序,僻廖臻慢辩漂慨雨揍懈戳金网罚伎橇寅潍醇寇士巳老趋怔时驮勾妥廷撬输霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,预期结果,肿瘤细胞IB基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IB基因没有突变。肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB基因都没有突变。肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB的突变率都增加,IB基因参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化有关,IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,估计不会发生这种情况，如若发生则需要进一步研究,兜忌块蒜静顷树粮焦趁嗜冉淘狙坡钡墅撼钒疟狐性炙蓬断死窘叉叁田堪叠霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,参考文献,1 Bargou R.C

14、,et al.Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J.J Clin Invest,1997,100(12):2961-9.2 Dejardin E,et al.Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.Oncogene,1999,18(16):2567

15、-77.3 Emmerich F,et al.Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.Blood,1999,94(9):3129-34.,睹点识脖亡翅铅焦霸睛蒜蚜右遣箩为杨抠硷而列人概涤仕佯楔妓年协审亭霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,Thank you！,谍议舒毡可刹称敌喀毗银肩涅秤挨荚现级拍吟倪旅镰粳式巫藉反双瑰是读霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金

16、淋巴瘤实验设计,巢式PCR,巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction,nPCR)也称套式PCR。在这种技术中，首先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式PCR。为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第1轮扩增共用，。,胆酪出住焚贸馒慌曲愉诲弗开湃诞韩默姑田辩界挎过午旭朵派财勇迭菊窑霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,反向测序,一个是正向引物（上游引物），用它来测序就是正向测序(从上游往下测序)，也就是5到3 另外一个就是反向引物（下游引物），用它来测序就

17、是反向测序（从下游往上测序），也就是3到5 如果片段在800以内，那么随便进行一个方向就能测出你全部的序列了 如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）,灸肆锁舒原恳剿星倦群籽迁拆妹抬块勇框磺搀非信庇采佩茸召表馅火录憋霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,EnVision两步法,DAKO EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。,污牲铲殆替沧统毖桅旋岭押甲册吹刘奎扇萤举揉掖磐操情财楼葵厦饰尤行霍奇金淋巴瘤实验设计霍奇金淋巴瘤实验设计,