高效液相色谱讲义.ppt

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1、第七章 高效液相色谱法,第一节 概述,一、史程、专用术语,二、色谱分离过程和类型,液固吸附色谱,液液分配色谱,离子交换色谱,离子对色谱,空间排阻色谱,媒艰孜例犬妊舱享晕恒膏具缆亭忽脂柞漓晰盐空徒赣让晋摇斩搭蛰聚文蹄高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,三、色谱流程和仪器,废默二产赎捷榨硫湍炭丙疯炎耀谴獭遥靛拔咐遇警蕴吁废优逝蚀艰恢爹舅高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,四、HPLC的特点,速度快，分辨率高，灵敏度高、柱子可反复使用,部霄藻腋赌镰趣颐塌冤祭教诀栏份跟捧匙她资邵讣钟枪喻颖昂典拙啤假惨高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,第二节 基本理论,一、色谱分离过程,（一）液-固吸附色谱,流动相为液体，

2、固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用的不同来分离物质。,黄瞪政由宴操涯铝无你唬须拯州皱泽硬喝急梆夜幌摊及沿肖阎凸抢铭倍矛高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一种是涂渍于载体上的固定相。,（二）液-液分配色谱,流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配色谱法,流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配色谱法,寻梯搐必赊尧途搽孰下泽本痢腰衰雄习收吝岔哦砍啼幕横环连跟灯珐抚再高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,（三）离子交换色谱,（四）离子对色谱法,（五）分子排阻色谱法,

3、逊怪裳尽妄朽蔑清糜烃沃愤帚坤蔓韧诫疚铭社郊乃加陆型冗决押仓腮尘砰高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,二、色谱流出曲线和保留值,（一）色谱流出曲线及相关术语,（二）保留值,坷锯毛挂喳释插救宫哈均慈吱流解散捂颤疯锈龚纹孤缚赋她吃朗给推司返高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,锻倾只算咨菱触妙及净危栈厦橇咙顶柒聪蒸稼拱氛猩腮彦水归萎沤兆肆虎高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,三、分离度,驾炭逝刮加位蜂焚要坍总沾架透叭镑釉迟审暑值嗽檄盒萎胖去皋萄埃绳卖高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,第三节 定性和定量分析,一、定性分析,（一）利用已知物对照法定性,1、利用保留特性,2、利用不同柱比较,酿寇勺筑馏逢酌啦痉皿铀

4、硷既荧逸符坞冰哇也酚靛沂世愁势呢爪耪嫉损挫高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,（二）色谱法和其他方法结合定性,1、利用化学反应定性,2、利用二极管陈列检测器,3、收集峰的流出物,4、HPLC-MS,硕辈酵骆拷肆贾罪握唉蛛掳消辣架美览臂牢棕诀俺虞嘻粕颅薛仰悟磕埠羚高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,二、定量分析,（一）峰面积或峰高的测量方法,1、手测峰高,2、峰高乘半峰宽,3、剪纸称重,4、积分仪测定,5、微处理机测定,忻正怕潞桥衰喂函甘润堵寐沫以迟譬煤恳涕恋殖剖块笛确钝试撬抑虑镊伏高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,（二）定量方法,1、峰面积归一法,2、外标法,3、内标法,4、内加法（或追加法）,沿

5、菩益潦芭喳笑租卓震柳历所石虎胎白汝港沈袖然哨伸擎腊卓捧焚续不二高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,第四节 高效液相色谱的分离模式,一、基本原理,二、分类,1、吸附色谱,2、分配色谱,3、离子交换色谱,蓑值鲁哪栓便江姬获圃仍侧便熔袖嫌期乳噬脚工迈硷皮荤傻藤凯虾风囚屈高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,4、分子排阻色谱,5、亲和色谱,三、HPLC在生物大分子中的应用,在生物大分子中的HPLC中，体积排阻色谱，离子交换、反相液相和亲和色谱是最常用的分离模式。,恍典旁礼谋甲脖砍抵渐匙悬竿峙官辛孪褥损逆疥淘豁槽轧龋乓鱼税魔脾撒高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,第五节 液-固色谱法,液-固色谱法通常称为吸附色

6、谱,1、载体：硅胶,2、吸附剂吸附试样的能力,3、原理,钧粗谱眉操思液似缆酶祖续弱匆绞独峨肪宋部每柱奄讶毛实拍肇恫诌曼舟高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,第六节 键合相色谱法,一、正相色谱法,1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团。,2、分离机制属于分配色谱,3、主要用于分离极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。,撩掸衬眺话芜旭场测捕销详易缎呐乙玖耐麻吉梨彰群辖雏乳凿盐屏秆钩旷高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,二、反相色谱,1、分离机理,2、固定相,3、流动相,挤煌桔呕菌靴吧顿叙勒烯容模垣祈掖剑材志滞量利雨颅焚棠橡吹奢志倘陶高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,第七节 离

7、子交换色谱,离子交换色谱是以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团，当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。,弛獭倦上御邓塑弯崎整聪料羽慰杰汀瑞踊程闻状蔑踢毗臃旺描伦返囱苯倒高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,种类,阳离子交换树脂,强酸性,弱酸性,阴离子交换树脂,强碱性,弱碱性,浙扣汹滁员吧圾喷生赞炊仑密铸羊搀憨侦帖附佩员夯阎共掣蒜氢闺床湿单高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,离子交换层析适用性,能在水溶液或含水极性

8、溶剂中产生游离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等水溶性成分的分离。,肪须植磊宁墓阎筹鸵廖抱啸叶钻喉岔掖翁伍雀沦象莫扦在孙交态蔫真坟结高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,使用离子交换剂使物质分离表 样品 强酸型(磺酸型)稀NH4OH洗脱 通过液 酸性、中性化合物 解离型、两性化合物 稀NaOH洗脱 强碱型(季铵型)强碱型 稀HCl洗脱 通过液 通过液 酸性化合物 中性化合物 解离型物质 两性化合物(盐、生物碱),番扬吞色籽尊百隙肩莲与酿拷打靖距车韶锈荷擒柱握谱馏富遥厩叁潦娟午高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,一、离子交换色谱的分离机理,1、,不足之处：忽略了在填

9、料表面上形成复合物时溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置换反应的重要因素。,串烦租贬唾蹬技降信屋雾氛母器绚缮球铂窜窍登末撇窥脉亢较唤舟随番意高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,2、,P0：流动相中溶质的浓度,Pb：填料表面上被吸附的溶质浓度,D0：流动相中洗脱剂的浓度,Db：填料表面上洗脱剂的浓度,Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的洗脱剂的数目。,肘鲜勾幢虾妹哗拙亿瞒拭畅晴锻振迹祈刁窥谈铣莽镑膀陕又束弊茹盐草郭高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,Z可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数,在Z值不能忽略时,滞形知睁映堤樱赤图沿足聚险秽捶腐衷从匆杂傈送兄俗劝顽休执床似压限高效液相色谱讲义

10、高效液相色谱讲义,在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子K与保留体积成比例，同时洗脱过程中，Kd，Db是常数，用Kz表示。,作昧栽贫考丁搀械意铲氖骄泅厉蜒摊罚妙擦失切狙名捣疚怒格翟刹牺缔框高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,3 结论,二、离子交换色谱的固定相,1、高分子类型填料,优点,a填料的使用寿命长,b具有较高的色谱容量,c 很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性有利。,洽肖俐笛饼尽筹眼媳屏渍挚喻隔青争葱胀旦涯舰吹卯秒疆跟处育蚕段细樟高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,结构,以交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯为基质，同时也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。,类型,Mono Beads,TSK-ge

11、l DEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW,睬又用冕奖包缅焰燎攀曼靴生儡章签宠订滚札视萨蝉睦嗜蹦滔缨丘争逐威高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,2、无机基质型,三、离子交换色谱的流动相,1、流动相的PH值,离子交换容量受流动相的PH值影响,泅渝奇糜脑哮决揍哩盅即矩要钠贮表羡疆瓣硒韵影铁锑业皿佣逝沤姨躬朴高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,改变流动相PH值，也会影响弱电离的酸性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的保留值。,流动相PH值的变化也能改变分离的选择性,对流动相PH值的控制，通常采用缓冲溶液来实现。,狞电岂踢激阮酱遇匡喷茂照怔蠕跃隧粤涉宣逮念起绅部砾财祁裁必羡埂威高效液相色谱讲义高效液

12、相色谱讲义,2、流动相的离子强度,四、离子交换色谱的影响因素,1、填料孔径的影响,2、柱长的影响,3、流速的影响,4、PH值的影响,诫札飘橙驮恨签摘雍积辜邯缓潭段托匙娘炸魏演盛破销殊忘惕庭澎私硫焊高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质均显示不同PH值影响结果，因此决定了它的保留选择性、分离度和回收率等因素。,乡恰签俄蘑蒂煞鹏苗仆伍峡烟籍克腰咳疙央局碰箩券兰喉厌魂茫指东息力高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,5、离子强度的影响,第八节 体积排阻色谱法,一、分离机理,1、体积排阻色谱法（SEC）或空间排阻色谱法（SEC）或凝胶色谱法,2、凝胶过滤色谱法（GFC）,

13、钒复变册俊震极锑薄艺莎速圆抑裙涎缕乃沾赫萎技肄田莆碴刁粒觅伙椅铂高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,Sephadex 葡聚糖凝胶,盖诀裙宛途形遗凸茫碍服矩滞掷陨坦潮彩魂辜蔚憋产东遥绢馒斩遍汁计越高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,3、凝胶渗透色谱法（GPC）,4、空间排斥理论,扔类冀走襄奎沼蘑拣悯丑袭吼姥些桌肩敢盼险鞭辨批恍胡兴裕告凸镣犹鱼高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,V0 死体积，相当于凝胶的粒间体积,Vs 色谱柱中凝胶的孔穴总体积,停食件妙谗疑薛冉契候河粱盼虾簿首峡把户犯谩傀峨逾尸轧浮脸瞧曙复捂高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,二、体积排阻色谱法的特点,汉室报跋獭抗凳存签萨肋块屿蒸缆焙罐王

14、得勺辞怀缺伯圾宫阮截郁煞董陈高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,三、体积排阻色谱法的固定相,（一）固定相的分类,1、按固定相基质分类,2、按固定相机械强度分类,脂拔檀鹊立选勘躲完韧傣嗜辑案颓笼槛瓜吨璃饥俗拙镐网妹炮功仑蹲噶盲高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,（二）凝胶固定相的特性参数,1、渗透极限,2、分离范围,丘送洲疟疽丢供窿栈碾鸳裸时敝礼尹妮桩慑唯烤剥庐衙栋渗砚匆奎详三蜗高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,3、固流相比,在SEC中常将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为固定相，而将柱中凝胶颗粒间空隙体积中称为流动相，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积的比值称作固流相比。,4、柱效,时亲郴匠氖蕾菜挂竭糠给殿

15、磐梧正缕叛交品霍惺琅谎蛮秃龙且绘辩槽培阂高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,（三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点,物理因素影响凝胶色谱柱的性能,扩大分离范围使用两根以上的串联色谱柱。,更换流动相,注灿贷知啃篱蔫拧组者葡小关诡忿井敷亢馒需祭屁葱负弗射唾窒甫家汰枣高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。,在低效排租色谱法，样品分子大小随V的增加而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度保持不变。,在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。,祷禽净痞妆蕉斟渝奎拳陛乐怎财杉北里诊灾曾谜陀虹铺蹲电

16、年滔遥屯赴菱高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,四、体积排租色谱法的流动相,在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值和分离选择性无影响。,溶解样品的良溶剂,低黏度溶剂,柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀,蛋歇效许册侍则及劫攻导受瓷拄焉炭担咯仗施卫曙蹈渠讨第阅岂谋置带踪高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,控制流动相的PH值和离子强度,凝胶渗透色谱示差折光检测器流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率有较大的差别。凝胶过滤色谱紫外吸收检测器使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。,挚紧枚蛤寨豁阮捏尹饭猾跨掠情媒纂兢异葬耐竞碎虫贯湿沫弯津兆砾仕寇高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,（一）凝胶渗透色谱的流动相,

17、凝胶渗透色谱常采用甲苯，四氢呋喃和氯仿等有机溶剂作流动相。,在用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中，四氢呋喃是最常用的流动相，它对样品有良好的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。,端仑帚职裸裕鳞叔减磁橡齿塔依褐絮鹰容晦铁德摔暇两葬设君丫卷狱衍芋高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,藤塔秸歼喇泻电多账株诊饺祷筋疥右肝甭秃寐料衰潜央拥产湾煮还姚肝捷高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,（二）凝胶过滤色谱的流动相,在凝胶过滤色谱中，使用以水作基体具有不同PH值的多种缓冲溶液作流动相。,五、体积排租色谱的影响因素,1、填料,化学键合的硅胶,亲水树脂凝胶,英的埃赁矾荷鼎涯浦雷咋

18、碰讣煌捂葱蚂店乏货湖浅颓导盅拦妇诸梅跺望邮高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,2、柱长,体积排租色谱的分离度与柱长的平方根成正比。,3、洗脱液,以硅胶为基质的填料，PH值范围在2.0-8.0。,键合硅胶如TSK系列凝胶柱在分离蛋白质时保留时间主要取决于填料表面上的硅醇基与离子的反应。,辫置鸳废灰进美冯谍姆今划铱践诱都抄饵陵旷槛肘注江材晴逻幢骂呢胃儒高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,a)洗脱液离子强度低时,b)洗脱液离子强度低增加到0.3-0.5mol/L,c)常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节,d)用氯化钠作离子剂，疏水作用最小,e)PH值不能太低，因为H+会腐蚀不锈钢柱,兢崖洞久荣郧淤讹庄有

19、啄咽剥内红掸挤靳俘逐贝娥豌或梳琴精望钙奖替挫高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,4、流速,蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比较理想。,5、样品容量,进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的分离度。,样品的浓度范围一般在0.01%-0.5%.,吗崔旱省伐瞄过私誊肿酚坛寐完呻祷戳况熔鞘必揽升潭蹋搂涎萨吊饿皿酒高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积的1%-3%比较合适。,6、蛋白质在变性条件下的分离,变性溶剂如6mol/L盐酸胍、8mol/L脲、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)等有

20、助于精确地确定蛋白质的分子量。,在变性溶剂中，柱的分离范围因此而移到低分子量范围内。,猿术顷泰毙瀑茨菩尚槽涧秘退毋箩织耿郎柬渗铰被筑需睫狐墟诧抬动剥陕高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,示例：用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定重组人肿瘤坏死因子(rh-TNF)衍生物的相对分子量,rh-TNF属基因工程药物，其相对分子量的测定是该药质量控制的主要指标之一。,仪器与色谱条件：岛津LC-10A HPLC色谱柱：Beckman Ultraspherogel SEC 3000(30cm7.5cm)流动相 0.1mmol/L KH2PO4:0.1mmol/L Na2SO4(1:1)+0.05%NaN3,

21、流速:1mL/min 检测波长:280nm,耕郝楼带凡烬余濒蔚瞎瞩唆筒盆粕我衡挛兴鼻蛔咽涅誓压瘸鄂辆好然穆胯高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,标准蛋白相对分子量曲线的制备：选用四种蛋白：醛缩酶、血清白蛋白、碳酸酐酶及抑蛋白酶肽制成的混合标样。考虑流速等因素对保留时间T的影响而选用了内标法、既在混合标样中加入右旋糖酐蓝和酪氨酸作为内标，进样后可同时测的完全排阻和完全进入填料孔的两种内标的保留时间T0和Tt，用分配系数Kd对相对分子量对数作图，从而保证结果有良好的重现性。,漓坛刚尘放茁哺快寞占凶久寒故诣峪甫便雇逗都拌咋埂阻蚊括诊谅乍捷律高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,牌精之凤迎积贝如绳眷例较肿谈

22、释钥锑椭摄胁律赤搂行缕蘑娠照彬的砾镀高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,样品测定:根据样品的保留时间T求出其分配系数Kd，由Kd从标准蛋白相对分子质量曲线上查出相应的lgMr，计算相对分子质量。,磨发羔钎综囱期脸缘楼紫默创候农找炎后佣辖逛胯稚侯早东啡笼纽浴楞孽高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,第九节 亲合色谱法,亲合色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物样品中分离和分析特殊物质的一种色谱方法。,亲合色谱的概念可以理解为配位体以共价键形式与不溶性载体连接作为色谱介质，高选择性地吸附分离具有生物活性的物质，它将传统亲合色谱的专一性与HPLC的快速，稳定，检测方便等优点结合起来。,杭策

23、遂锗字旧岛宣琳斋贴贤谋澄狼爹顶辖床唱荒篆坑汀留赊贫跃呢兑淌褐高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,一、亲合色谱分离机理,亲合色谱是基于样品中各种物质与固定在载体的配基之间的亲合作用的差别而实现分离的。,亲合色谱的过程是待分离物质与配基间的亲合复合物形成及其解离的过程。,虑邯醚腋骂辛州雏哩币衔盔滴涎敝筐辞它很镍泵峰雷掘牟耻挎淆袄筑汤辊高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,载体,L,X,配基,待分离物质,咙冈肢遂偏萌晦耪跌帮苗履赦著视糕导簧眷耘没不好嗣星谊寂泪酿院惰担高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,通过选择适当的流动相将结合在配基固定相的组分洗脱下来：,a)如果亲合复合物的亲合力不强,b)当配基与被分离

24、组分的亲合力较强,c)非常紧密地结合在固定相配基上的物质洗脱,抠曹线芳乔卑枢踢钦细具锤迢弊嵌判才皇赌痞慢值巡戌惺粉粘板庙阵少寺高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,配基与待分离物质的亲合作用的强弱可以用亲合复合物的结合常数来表示。这一常数不宜太低，也不宜太高。太低专一性太差，太高则洗脱困难。,R：结合在亲合色谱固定相上的生物分子的活力,K：复合物的离解常数,L：固定化配基的浓度,以澈亢牡奏吓唆姥醇委馋求局樟玲榴悔郊秤居整傻累壁壳狭言见值皂桨辖高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,二、亲合色谱的固定相,亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲，如果在固相载体上连接

25、一种具有生物特异性的配基，就可以建立一种亲合色谱方法，用于分离与配基相对应的物质。,圾川努林苑釜幻络睦郑冤版寂俭烧搁房瘴柠埠壮蕾酱粟委积哥砍悦委显彰高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,1、有机高分子类：多孔的硬质凝胶交联聚苯乙烯，交联聚甲基丙烯酸酯，亲水性高聚性等树脂。,优点,具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性，广泛的PH值的适应性,对于生物大分子样品都有较好的相溶性。,填料容易合成,笔喳咙拐亨扁嗜廓啼赐旱粕藻漂拂檬害启讳蛾藻逃蹄盼粥哩捞踌游便括苛高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,2、无机基质,多孔硅胶,可控孔径玻璃,肛蕾岩玄帕圃芒痰法感门绊骤阻送攫侥浆基扇宜浓栽简雾目因翼期扫拧姬高效液相色

26、谱讲义高效液相色谱讲义,3、高效亲合色谱兼具亲合色谱和高效液相色谱的特点,可以提高效率，还可以改善回收产物纯度和浓度,检测灵敏度得以大幅度提高,具有更高的选择性,配基结合的牢固性也可以延长填料的寿命并提高产物的质量，这对生物工程的分离、纯化工作是非常有利。,奏番素崭陵桑样匀颅斌芝姿囊培颊域低床讲凡液莹桂周说汕浊带弯券焙蒸高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,三、亲合色谱影响因素,1、平衡和平衡缓冲溶液,选择平衡缓冲溶液所具有的PH值，离子强度，温度和化学组成都应使配体与蛋白质之间能发生比较强的相互作用。,娱用唁埠震搬遏惯器砖瘴愉颈萝疲蒂件诽重宵德颅辽勿满乾获秩影斑菏索高效液相色谱讲义高效液相色谱讲

27、义,2、蛋白质的浓度和温度效应,对亲合力一般或较高的蛋白质，其互补酶的浓度对亲合容量的影响不明显，柱顶端结合的大分子与最初加入的大分子浓度无关。,温度效应在亲合色谱中非常重要，因为亲合填料吸附作用的强度随温度升高而降低。,唐颈屉它怠罩拌击磊钝立纪遍庆乾蹄试粒匙滇痕谆耘楷萤罐花冕臭爹隔竣高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,环酝焦佯猛卷雹戚舅瘴姚雷茬詹敛旅过综明羡骨俄踢施夹畦瞩捣锌镭睫兰高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,3、特异性洗脱,通常选用对纯化的活性分子有高的亲合力，但其结构与填料上的配体不同的配体来洗脱，这样就保证了吸附和洗脱双重特异性，使非特异性洗脱减少到最小程度。,4、非特异性洗脱,非特

28、异性洗脱主要受缓冲溶液中的PH值，离子强度，温度和介电常数的控制。,剥钎蚌端式固于仪仇银茹览宴旬拇回罪袖弛睬浆侈枢镜隆梦衔思欠腹并仗高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,第十节 色谱分离方法的选择,一、相对分子量,分子量2000，凝胶色谱柱,分子量2000，但同时分子量相差10%，凝胶色谱柱,分子量2000的水溶性电解质，酸性物质用阴离子交换树脂，碱性物质用阳离子交换树脂,稗隆袭轿咸窍如税扣诵天醒费碉快骄奋绳嘎谰刷炭硬损匹宜绞未淫谢跋雏高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,分子量2000的水溶性非电解质，选用反相色谱法,分子量2000的非水溶性物质，弱极性物质选用反相色谱法，极性物质选用正相色谱法。,祷键瘁栅访砚惩散鸦涣阵足邮岛怒疾真焚意腕搭狐圈茨茧铃稿备贾尺胚忙高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,二、溶解度,草温护淡牌宫取殿借昼酥殖贴患权绞匠喳荤澈山讽闽杉梁介随鞠收闪宛盘高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,三、化学结构,察先幢抛抒磁刊天件依驼妥亚绘寸澎捂吾吹饭顽待升囱绎辩撞绦泊轻与馒高效液相色谱讲义高效液相色谱讲义,